Summary
Суточные ритмы в добровольном колеса работают активности у млекопитающих тесно связаны с молекулярной колебаний тактового генератора в мозг. Как таковые, эти суточные ритмы в поведении могут быть использованы для изучения влияния генетических, фармакологических и экологических факторов на функционирование этой циркадных часов.
Abstract
Когда грызуны имеют свободный доступ к ходового колеса в их доме клетке, добровольное применение этого колеса будет зависеть от времени суток 1-5. Ночные грызунов, включая крыс, хомяков и мышей, активных ночью и относительно неактивны в течение дня. Многие другие поведенческие и физиологические показатели также демонстрируют суточные ритмы, но у грызунов, работающий колеса деятельность служит особенно надежной и удобной мерой выходной мастер циркадных часов, ядро супрахиазматическое (SCN) гипоталамуса. В общем, посредством процесса, называемого увлечения, ежедневная картина под управлением колеса деятельность естественно совпадают с экологическими цикле свет-темнота (LD цикл, например 12 ч свет: 12 ч, темный). Однако циркадные ритмы эндогенно порожденных моделей поведения, которые демонстрируют ~ 24 часов период, и сохраняются в постоянной темноте. Таким образом, в отсутствие цикла LD, учета и анализа хода колеса деятельность можетбыть использованы для определения субъективной время-день. Потому что эти ритмы направлены на циркадные часы субъективное время-день называют суточным времени (CT). Напротив, когда цикл LD присутствует, время-день, который определяется по экологическим циклом LD называется временем zeitgeber (ZT).
Несмотря на циркадные ритмы в ход колеса деятельность, как правило, связаны с SCN 6-8 часов, суточный осцилляторов и во многих других областях мозга и тела 9-14 может быть также участвует в регуляции суточных ритмов активности. Например, суточные ритмы в пищевой упреждающей деятельности не требует SCN 15,16, а вместо этого коррелируют с изменениями в деятельности экстра-SCN осцилляторов 17-20. Таким образом, под управлением колеса записи активности может предоставить важную поведенческую информацию не только о выходе часы SCN мастера, но и на деятельность экстра-SCN осцилляторов. Ниже мы DESCRМБП оборудования и методов, используемых для записи, анализа и отображения циркадных ритмов опорно-двигательной активности в лабораторных грызунов.
Protocol
1. Содержание животных
- Кейдж: Для того, чтобы записать ход колес деятельности индивидуального грызунов, каждая клетка должна включать одного грызуна и обкатки колеса. Потому что ходовые колеса могут рассматриваться как форма обогащения, все грызуны в любое исследование должно иметь подобный доступ к ходового колеса.
- Постельное белье меняется: Животные обработки, а также изменения в клетках или постельные принадлежности могут иметь не световые эффекты на циркадные ритмы 21-23, таким образом, клетки с сеткой-полы являются идеальными, поскольку они минимизируют контакт с животным. Несмотря на наличие такого лотка системы, постельные принадлежности изменения следует избегать во время критических фаз эксперимента. Альтернативы включают в себя использование более длительного постельного белья, которое позволило бы более редкими изменениями клетки, или клетки на изменение псевдослучайных графику.
- Изоляция коробки: Клетки должны быть в изоляции коробки, которые являются звук ослабленных, светло-сотрудничестваntrolled, и хорошо проветриваемым. В зависимости от размеров и конфигурации изоляции коробки, количество клеток в каждой коробке обычно находится в пределах от 1-8. Когда жилье несколько клеток в одной коробке изоляции, следует иметь в виду, что различные запахи и звуки, исходящие от других животных может иметь смешанное воздействие на циркадный поведения отдельных животных. Чтобы избежать этих проблем, нужно пытаться разместить в одной клетке изоляции коробки.
- Вентиляция: достаточный приток воздуха необходимо, чтобы сделать ящики комфортные условия дома для грызунов. Вентилятор в каждой коробке должна быть с капюшоном, с тем чтобы предотвратить света из-за пределов штрафной от достижения внутри. Кроме того, поклонники, как правило, удалить воздух из коробки и взорвать его в комнату. Малый светонепроницаемый отверстия позволяют воздуху входить в изоляции коробки с нескольких точек, а также поможет избежать неудобных бризы. Для того, чтобы убедиться, что имеется достаточная вентиляция, температура внутри изоляции коробки (когдазакрыт в течение нескольких часов, с огнями на) должна быть практически идентична температуре в помещении, где она находится.
- Освещение: экологическая интенсивность света должна быть одинаковой во всех клетках. Организовать единый свет на том же месте, над каждой клетке, и всегда использовать ту же марку / тип лампы. Используйте умеренной интенсивности освещения (100-300 люкс) в клетке уровне. Избегайте чрезмерно высокие уровни освещенности, который, скорее всего, производить прямые изменения в поведении связаны с света, а не суточный системы, как таковой (например, маскировка).
- Darkness / тусклый красный свет: Если это необходимо для обработки или лечения животных в темноте (например, в постоянной темноте или ночью), очки ночного видения должны быть использованы. Кроме того, так как циркадные система является относительно нечувствительным к красно-волн, тусклое освещение красным могут быть использованы. Конкретные красный свет вы используете должны быть проверены, чтобы убедиться, что он не AlteГ хода колес деятельности (например, маскировка) или настроить циркадных часов (например, производят сдвиг фазы).
2. Сбора данных (см. Рисунок 1 - Vitalview аппаратной конфигурации)
- Запуск колес: диаметр и эргономика ходового колеса изменится объем использования 24. Таким образом, использовать меньшие и более легкие колеса мыши, и большие тяжелые колеса для крыс. При стирке и повторной установки колес, убедитесь, что колеса могут вращаться беспрепятственно, не "раскачиваться", и что запись микро-переключателей активируется каждый поворот колеса.
- Микро-переключатели: каждый оборот ходового колеса должны активировать магнитные или механические микро-переключатель. Информация из микро-переключателя передается по одному каналу и записал с компьютера, который может бин данных с течением времени (например, каждые 2, 5, 6, или 10 мин).
- Компьютерное оборудование: Наши Runniнг колеса записи сделаны с Vitalview, аппаратная и программная платформа разработана Мини Mitter ( http://www.minimitter.com/vitalview_software.cfm ). Однако, есть другие платформы, такие как записи ClockLab, разработанный Actimetrics ( http://www.actimetrics.com/ClockLab/ ). Обе платформы объединять данные из многих одноканальных источников (например, одного микропереключатель активируется одной ходового колеса) в один файл компьютера. Данные из отдельных каналов может быть графически и проанализированы отдельно в более поздние сроки.
3. Данные записи
- Файлы: выше программных платформ могут быть использованы выделить отдельные каналы, так что отдельные файлы создаются для каждого хода колеса записи. Такие данные лучше визуализировать и графически специально для дизайнаD программ, таких как ActiView (Minimitter, Бенд, Орегон), Circadia, или Clocklab (Actimetrics, Wilmette, IL), которые могут производить периодограмм и actograms. Тем не менее, одноканальные файлы могут быть открыты и проанализированы с использованием общих программ, таких как таблицы Excel (Microsoft, Редмонд, штат Вашингтон).
- Расчет суточного времени (CT): CT 12, по определению, начало работы колеса деятельность в ночных грызунов. Параллельно с 24 часов дня, по соглашению, один суточный день разбит на 24 циркадных часов. Соответственно, если суточный автономный срок составляет 24 ч 30 мин измеряемый настенные часы, CT 0 будет происходить примерно в 12 час 15 мин после CT12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
- Компьютерные программы: специализированные компьютерные программы, которые обычно используются в поколение actograms и расчета суточного периода. Эти программы включают, но не ограничиваются, ActiView (Minimitter, Бенд, Орегон) и Circadia.
- Actograms: Actograms обеспечить наглядную иллюстрацию ежедневно моделей хода колес деятельности. Есть одно-график (ось х = 24 ч) и двойной заговор (ось х = 48 ч) actograms. Оба метода последовательных дней участке сверху вниз, но дважды построены actograms участке два дня на каждой горизонтальной линии. В частности, дважды построены actograms показать "второй день" в дальнем правом каждой линии, а также в начале второй горизонтальной линии, и так далее. Двойной заговор особенно полезен для визуализации без ритмы-24 час.
- Периодограммы: периодограммы построен из спектрального анализа ходового колеса деятельность с течением времени. Периодограммы показывают относительную военнопленныхэ для ряда заданных периодов, и обычно используются для определения свободного хода период.
- Результаты: В лаборатории, грызунов, как правило, размещается под 24-цикл час LD. В этих условиях ритм активности увлекается, например, что ежедневная картина хода колеса деятельность в соответствие с точным циклом 24 часа LD. В 2А рисунок, дважды построены актограммы слева показывает ход колеса деятельность крыс, которые стали активными в то же время каждый день, вскоре после экологической огни были выключены. Периодограммы справа показывает сильный пик в 24 часов, в соответствии с увлечением для точного цикла 24 часа LD. Рисунок 2B иллюстрирует ходового колеса использования крыса, которая была размещена в постоянной темноте. В этом случае, ежедневные началом обкатки колеса деятельность произошла чуть позже каждый день, создавая вправо "дрейф". Это вправо "дрейф" указывает, что эндогенный суточный период больше тхаN 24 часа в сутки, но это пик периода, который количественно этот период. По словам периода, максимальная мощность наблюдается на 24,33 грн. В отличие от автоматизированного анализа периодограммы, Рисунок 3 иллюстрирует способ, чтобы вручную рассчитать свободный ход период, используя время наступления ход колеса деятельность. Важно понимать, что расчет периода руку и расчета его периодограммы может дать несколько иные результаты.
Ежедневно моделей обкатки колеса активности может быть нарушена в нескольких направлениях. Рисунке 4 показана структура аритмической работает колесо деятельности, производства электролитического поражения SCN. Этот тип эксперимента были получены одни из первых свидетельств того, что содержащиеся SCN "мастер" циркадных часов 7,8. Периодограммы на правом подтверждает это аритмической модели деятельности, показав самое низкое энергопотребление за все периоды в суточный диапазон (20-30 ч). CircadЯн картину хода колес использования также может быть нарушена жилья крыс в постоянном свете. рисунке 5 показана актограммы от крыс воздействию последовательно несколько условий освещения уже описано. Во-первых, крыса была размещена в постоянной темноте и выставлены работы ритме колес деятельность примерно 24,33 грн. Во-вторых, экологические свет был оставлен и крыса была размещена в постоянной освещенности. Постоянный свет, как известно, нарушают SCN на основе часов и производить аритмической моделей обкатки колеса деятельность, похожие на SCN поражения. Это нарушение света, однако, происходит постепенно в течение 2-3 недель. Поэтому, когда ход колеса запись проанализированы после первых 3 недель в постоянном свете, периодограммы не дает пик. Наконец, на третьем этапе крыс положил обратно на 12 часов: 12 часов LD цикла и работают ритмы колеса деятельность восстановить почти сразу.
Количество работает, и времени суток осдворняги, также можно манипулировать факторами окружающей среды. Например, если грызуны постился и приблизительно временно ограниченным еду каждый день, это ограниченный график кормления будет вызывать ежедневно бой пищевых упреждающей деятельности. Это называется "упреждающий", поскольку она происходит до прибытия ежедневной едой, и это особенно очевидно, когда еду дано в середине дня, время, когда ночные грызуны являются относительно неактивны. Например, если эксперимент представляет собой единую 2 часа еду каждый день, еда может быть добавлен в клетке на ZT 4 (4 часа после отбоя включен) и удалены в ZT 6 (2 часа позже). Кроме того, сетка полы в клетках также выгодно для такого рода эксперимент, потому что это делает невозможным для крыс, чтобы скрыть продовольствие и сохранить его для последующего использования, обеспечивая тем самым, что крыса на самом деле много вся еда в установленный приема пищи. И, наконец, одно из главных преимуществ точного хода колеса деятельность записи является то, что она позволяет корреляциюы должен быть заключен между ход колеса деятельность и суточные колебания в выражении экспрессии генов циркадных часов по всему мозгу и телу. - Общие ловушки:
- Многие программные платформы автоматически настраивать на летнее время изменений. При проведении эксперимента во время ежегодного изменения времени, убедитесь, что эта опция отключена в программное обеспечение для записи, а также операционная система компьютера программное обеспечение. Эта гарантия должна помочь избежать расхождения между записью и внешнем цикле свет.
- Для того, чтобы проверить расхождения в данных или неожиданного изменения в поведении, сохранить в текстовый файл с точной дате и времени каждой коробке открытия, кормления и поения, постельные принадлежности изменения, экспериментальных манипуляций, и любые другие нарушения, которые могут возникнуть. Точное время начала и окончания данных записи следует также отметить в этом файле.
- Важно регулярно проверять, что огни включения и выключеният ожидаемого раз. Многие проблемы могут возникнуть, в том числе перебоев в подаче электроэнергии и сожгли лампочки. Некоторые ход колеса платформы снабжены световой датчики, но другие не проверяют условия освещения.
Рисунок 1. Конфигурации аппаратного Vitalview начинается с грызунами ходового колеса, который предназначен для активации микро-переключатель с каждой революции. Эта информация затем отправляется QA4 модулей и передается на датапортом DP24 и, наконец, записывается Vitalview оборудованный компьютером. Компьютер подводит под управлением колеса революций от каждого канала каждые 10 минут, эти данные могут быть просмотрены позже актограммы или периодограммы. В зависимости от того, как огни установлены, они могут управляться удаленно либо же VitalviewОборудованном компьютером или стене таймеры приобрести в любом магазине электроники.
Рисунок 2 представителя actograms и периодограмм для самцов крыс Вистар расположен в 12 час. 12 час LD цикла (А) и в постоянной темноте (B). Двойной заговор actograms (левая колонка) иллюстрируют условия освещения вдоль верхнего, 48 ч работы колеса деятельность по оси Х, и сюжет последовательных дней от верха до низа. Периодограммы (правая колонка) выполнения спектрального анализа на ходовое колесо данных, изображенных на actograms. Рис. 1А иллюстрирует поведение крыс, который был расположен под 24-цикл час LD. В этих условиях крыса становится активным, в то же время каждый день, показывая точное 24 час пик в периодограммы. Рис. 1б иллюстрирует поведение крыса, которая была размещена в постоянной темноте. Под Фес электронной условиях крыса была активной чуть позже каждый день, поэтому вправо дрейф в актограммы и 24,33 час пик в периодограммы.
Рисунок 3. Период также может быть экстраполированы на руку. Первый нарисовать линию из наиболее подходят на основе ежедневного начала деятельности (красная линия). Далее вычислить наклон в ч / день, помните, что если ритм <24 часа в сутки наклон будет отрицательным значением, и, наконец, добавить 24 часа в сутки. Эта процедура даст оценку суточного периода для этого животного. В этом случае, 4 hr/10 дней предполагает, что животное становится активным примерно на 0,4 часа позже каждый день (наклон 0,4 час / день). Таким образом, циркадного периода составляет около 24,4 ч (или около 24 ч и 24 мин). Любая манипуляция, которая запланирована в соответствии с КТ требует свободного хода период, чтобы сделать точный прогноз CT.
Рисунок 4. Электролитические поражения SCN будет производить аритмической моделей хода колес деятельности. В этом случае крыса находится под постоянной темноте, а потому, что "мастер" циркадных часов было поражений, крыса не показывает эндогенной циркадного ритма в ход колес деятельности. Периодограммы на право подтверждает, что нет существенной ритм в суточный диапазон.
Условия Рисунок 5. Освещения имеют сильное влияние на модели ходового колеса деятельность. В этой записи, крыса первоначально размещался в постоянной темноте (DD), как обозначено заштрихованной части отчета. В соответствии с этим conditiна, циркадные часы ездит на циркадный ритм в управлении колеса деятельность с периодом в 24,33 ч, показали периода (вверху справа). Далее, крыса находится под постоянным светом (LL), а обозначается белой части актограммы. При этом условии эндогенных циркадных часов разрушается постепенно, в течение 2-3 недель, и, как показали периода (в середине справа) крыса становится аритмичный. И, наконец, нормальное 12 часов: 12 часов LD цикл был восстановлен и ход колеса деятельность ритм был восстановлен с точным ритмом 24 часа в сутки, как показано периода (внизу справа).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мониторинг суточных ритмов активности с использованием ходовых колес является наиболее распространенным и надежным методом оценки выходе мастер циркадные часы в ночных грызунов. Колесо хода деятельности, однако, является лишь одним из многих аспектов поведения и физиологии, которые можно постоянно контролировать. Хотя подавляющее большинство ход колеса деятельность происходит в ночное время, более 30% от общего бодрствования происходит в дневное время 25,26. Другие конечные точки могут быть использованы для оценки циркадных ритмов, в том числе общая активность, пищевой бен подходы, питья, сна и температуру тела. Таким образом, в зависимости от характера исследования, исследователи могут записать несколько ритмов одновременно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность заработной платы премий, грантов оборудования и операционных средств из Fonds-де-La Recherche ан santé Квебек (FRSQ), Канадский институт исследований в области здравоохранения (CIHR), естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC), и Concordia University Research Стулья программы (CRUC), а также вдумчивое мнение об этой рукописи д-ра Джейн Стюарт.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitalview Card & Software | Mini Mitter | #855-0030-00 | (Bend, OR, USA) |
| DP24 Dataport | Mini Mitter | #840-0024-00 | (Bend, OR, USA) |
| QA4-Module | Mini Mitter | #130-0050-00 | (Bend, OR, USA) |
| Magnetic Switch | Mini Mitter | #130-0015-00 | (Bend, OR, USA) |
| C-50 Cable assembly | Mini Mitter | #060-0045-10 | (Bend, OR, USA) |
| Rat running wheel assembly | Mini Mitter | #640-0700-00 | (Bend, OR, USA) |
| Cage and tray support | Mini Mitter | #640-0400-00 | (Bend, OR, USA) |
| Useable cut away cage | Mini Mitter | #664-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Grid floor for cage | Mini Mitter | #676-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Waste tray | Mini Mitter | #684-2154-00 | (Bend, OR, USA) |
| Lamp housing | Microlites Scientific | #R-101 | (Toronto, ON, Canada) |
| 4W Fluorescent lamps | Microlites Scientific | #F4T5/CW | (Toronto, ON, Canada) |
| Isolation chambers | Custom built | 28"H x 20"W x 28"D ½" Black Melamine. |
References
- Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. V. Pacemaker Structure: A Clock for All Seasons. J. Comp. Physiol. 106, 333-355 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. IV. Entrainment: Pacemaker as Clock. J. Comp. Physiol. 106, 291-331 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. III. Heavy Water and Constant Light: Homeostasis of Frequency? J. Comp. Physiol. 106, 267-290 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. II. The Variability of Phase Response Curves. J. Comp. Physiol. 106, 253-266 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. I. The Stability and Lability of Spontaneous Frequency. J. Comp. Physiol. 106, 223-252 (1976).
- Ralph, M. R., Foster, R. G., Davis, F. C., Menaker, M. Transplanted suprachiasmatic nucleus determines circadian period. Science. 247, 975-978 (1990).
- Moore, R. Y., Eichler, V. B. Loss of a circadian adrenal corticosterone rhythm following suprachiasmatic lesions in the rat. Brain Res. 42, 201-206 (1972).
- Stephan, F. K., Zucker, I. Circadian rhythms in drinking behavior and locomotor activity of rats are eliminated by hypothalamic lesions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 1583-1586 (1972).
- Abe, M., et al. Circadian rhythms in isolated brain regions. J. Neurosci. 22, 350-356 (2002).
- Yamazaki, S., et al. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lamont, E. W., Robinson, B., Stewart, J., Amir, S. The central and basolateral nuclei of the amygdala exhibit opposite diurnal rhythms of expression of the clock protein Period2. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4180-4184 (2005).
- Amir, S., Lamont, E. W., Robinson, B., Stewart, J. A circadian rhythm in the expression of PERIOD2 protein reveals a novel SCN-controlled oscillator in the oval nucleus of the bed nucleus of the stria terminalis. J. Neurosci. 24, 781-790 (2004).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 5339-5346 (2004).
- Guilding, C., Piggins, H. D. Challenging the omnipotence of the suprachiasmatic timekeeper: are circadian oscillators present throughout the mammalian brain? Eur. J. Neurosci. 25, 3195-3216 (2007).
- Boulos, Z., Terman, M. Food availability and daily biological rhythms. Neurosci. Biobehav. Rev. 4, 119-131 (1980).
- Boulos, Z., Rosenwasser, A. M., Terman, M. Feeding schedules and the circadian organization of behavior in the rat. Behav. Brain Res. 1, 39-65 (1980).
- Verwey, M., Amir, S. Food-entrainable circadian oscillators in the brain. Eur. J. Neurosci. 30, 1650-1657 (2009).
- Davidson, A. J., Poole, A. S., Yamazaki, S., Menaker, M. Is the food-entrainable circadian oscillator in the digestive system? Genes Brain Behav. 2, 32-39 (2003).
- Hara, R., et al. Restricted feeding entrains liver clock without participation of the suprachiasmatic nucleus. Genes Cells. 6, 269-278 (2001).
- Damiola, F., et al. Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes Dev. 14, 2950-2961 (2000).
- Mrosovsky, N. Phase response curves for social entrainment. J. Comp. Physiol. A. 162, 35-46 (1988).
- Cain, S. W., et al. Reward and aversive stimuli produce similar nonphotic phase shifts. Behav. Neurosci. 118, 131-137 (2004).
- Antle, M. C., Mistlberger, R. E. Circadian clock resetting by sleep deprivation without exercise in the Syrian hamster. J. Neurosci. 20, 9326-9332 (2000).
- Banjanin, S., Mrosovsky, N. Preferences of mice, Mus musculus, for different types of running wheel. Lab Anim. 34, 313-318 (2000).
- Verwey, M., Lam, G. Y., Amir, S. Circadian rhythms of PERIOD1 expression in the dorsomedial hypothalamic nucleus in the absence of entrained food-anticipatory activity rhythms in rats. Eur. J. Neurosci. 29, 2217-2222 (2009).
- Gooley, J. J., Schomer, A., Saper, C. B. The dorsomedial hypothalamic nucleus is critical for the expression of food-entrainable circadian rhythms. Nat. Neurosci. 9, 398-407 (2006).
