Summary
主要从小鼠白色脂肪组织中分离出的白色脂肪前体细胞可以分化成浅米色/ BRITE细胞。这里介绍的是一个可靠的细胞模型系统，研究的分子调控“黑”的白色脂肪。
Abstract
棕色脂肪细胞的能力脱开在线粒体呼吸链和消散化学能量作为热量。 UCP1阳性棕色脂肪细胞在白色脂肪组织（所谓的米色或BRITE细胞）的发展是高度由各种环境线索，如慢性暴露于寒冷的环境或PPARγ激动剂诱导，因此，这种细胞类型具有潜在的治疗靶点肥胖的治疗。虽然大多数永生脂肪细胞线可以不概括的“褐变”的白色脂肪中文化的过程，原代脂肪细胞分离出间质血管部分在皮下白色脂肪组织（WAT）提供一个可靠的蜂窝系统研究的分子控制的米色/ BRITE细胞发展。在这里，我们描述了一个协议，有效隔离的主要前体脂肪细胞和为文化的米色/布里特细胞的诱导分化。褐变效果可评估的棕色脂肪选择性标记的表达雇员再培训计划，如UCP1。
Introduction
肥胖是显着世界范围内不断增加，现在被认为对公众健康1的最严重的问题之一。这种情况涉及到的能量摄入相对misbalance支出和结果，多余的能量储存在白色脂肪组织（WAT）的脂质。扩大WAT与增加身体的质量和重量，而棕色脂肪组织的能力，以消耗多余的能量以产生热量。因此，BAT可作为寒冷和保护，防止肥胖2,3。这是通过解偶联线粒体解偶联蛋白1（UCP1）的电子传输。这种蛋白质被认为是一个标志性非颤抖性产热作用BAT 3。在近几年的几项研究显示，成年人有功能BAT 4-8，因此，在人类的BAT操作可能是一个潜在的干预治疗，对肥胖及其相关疾病的战斗中。
jove_content“目前的证据表明，棕色脂肪细胞中存在两种类型的啮齿动物，”古典“或”以前存在的“棕色脂肪在产前阶段的发展，形成专用的棕色脂肪在肩胛间区的仓库和其他外围组织。另一方面，“诱导”形式的棕色脂肪（所谓BRITE或米色细胞）在产后阶段发展，穿插在白色脂肪组织中出现，这两种类型的棕色脂肪细胞也分离由不同发育起源。虽然预先存在的棕色脂肪细胞从myoblastsic像MYF5前体的产生，诱导BRITE /米色WAT中穿插的细胞从的非MYF5谱系9,10产生，此外，这种细胞类型的调控途径可能是不同的从MYF5派生棕色可以激活慢性暴露于寒冷的环境和发展的米色细胞（ 即 “黑”的白色脂肪）脂肪11。β3-肾上腺素能受体激动剂或PPARγ激动剂在成人中12-14。浅米色/ BRITE细胞有可能是一个有前途的治疗目标操作的整体能源平衡，并有可能成为肥胖治疗的一部分，因此，重要的是要了解确切的分子机制和信号途径，其中环境因素控制的发展米色细胞。了解的分子控制的白色脂肪的褐变， 在体外实验中是最适合作为发生，而异步的前体脂肪细胞的分化，它是很难检测细胞原位 15。虽然对脂肪细胞发展的研究迄今为止进行主要对3T3-L1，3T3-F442A或HIB1的细胞系，例如，这些细胞系出现米色细胞缺乏的分子签名。另一方面，从皮下WAT中分离的原代脂肪细胞是最有可能重述议事录S褐变的白色脂肪的细胞自主的方式。在这里，我们提供了一个协议，用于从脂肪组织的间质血管部分有效隔离和白色脂肪PPARγ激动剂诱导褐变。罗格列酮已被证明是一种非常有效的调解员在这些细胞中的褐变。正如先前所建议的16，这蜂窝系统可用于为可靠的蜂窝系统研究米色/布里特细胞的发展。
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Protocol
1。准备消化液
5毫升，每5只小鼠组织（大约1毫升/ 1克脂肪组织）。
- 在消化酶称：
- Collaginase D：1.5单位/毫升（1108874103，1克，罗氏，70334223）
- 中性蛋白酶II：2.4单位/毫升（0980毫克/ LYO，罗氏，04942078001，11466200） - 加入25毫升PBS，拌匀溶解
- 的最终浓度为10mM，加入CaCl 2的只是事先消化组织
2。解剖小鼠脂肪组织
- 应仔细进行解剖，并立即牺牲后的小鼠（6-8周龄）。在打开它之前，用乙醇消毒喷洒鼠标上的毛皮工作。将组织直接在干净的PBS，独立的肩胛间BAT和皮下腹股沟WAT。
- 肩胛间BAT：有鼠标放在面临的后面，沿后面，所有的方式向颈部切开。棕色可以找到的肩膀（肩胛间）之间的皮肤下脂肪组织。 BAT可以被看作是两叶，蝴蝶形。覆盖一层薄薄的白色脂肪的BAT应仔细清除。
- 对于皮下，WAT（腹股沟WAT）：去除皮肤。腹股沟WAT直属双方在皮肤上，开始几乎就在后面，旁边，里面的大腿和向下的睾丸。
3。剪切和消化脂肪组织
- 快速删除所有的污染，如头发，骨骼肌肉和结缔组织的组织切片。
- 干组织迅速在纸上中与PBS稀释解剖，并把它放在一个干板。
- 加入消化液（添加氯化钙消化前）和切成小块，剁碎的组织。 5毫升的移液管移液和组合非常好。将切碎的组织在50毫升管传输的其余部分的消化米edium，混合均匀，上下吹打。
- 在37°C的精华在150 rpm的转速下为40-50分钟，不断搅拌。检查每10至15分钟，以确保消化进展顺利，以防止过度消化。
注意：正确的消化液和时间是很重要的。的组织需要很好地消化，但多余的消化可以对细胞造成损害。
4。过滤器细胞悬浮
- 通过加入5毫升完全培养基（DMEM/F12中含有10％的FPS和P / S）终止消化。几乎完全同质的细胞。移液拌匀。
- 700×g离心10分钟，离心。
- SVF现在可以被看作是一种褐色的颗粒上的试管底部。吸取油状的成熟的脂肪细胞层的顶部和大部分的液体层 - 保留沉淀，并溶解在10毫升完全培养基。拌匀。
- 一个新的50年，将一个单元格的过滤器（直径为50-70微米）毫升管和过滤细胞悬浮液。
5。板细胞
- 细胞悬浮液转移到一个15毫升的试管，在700×g离心10分钟离心。
- 吸液的介质中，并重新悬浮在10ml完全培养基沉淀。移液器拌匀。
- 估计需要多少个盘子。这可能会有所不同，取决于颗粒的大小。一般的规则是从5的小鼠腹股沟疝WAT和一个10厘米的板BAT 10厘米的板。
- 在完全培养基板细胞上胶原涂层的菜肴（R＆D）
- 1-2小时电镀后的细胞，吸出培养基，用PBS洗两次，加入新鲜培养基。此步骤是很重要的，因为这可以去除红血细胞，免疫细胞和其他污染物。
6。区分细胞
- 维护和归纳介质。
维护介质
完成培养基中加入：
耳鼻喉科“>胰岛素，终浓度5微克/毫升（5毫克/毫升库存中，*** 100微升乙酸在10ml H 2 O以制备酸化的水的pH值2.5。溶解胰岛素的酸化水。商店股票-20°C）3,3'-2,5 - 三碘-L-甲状腺原氨酸（T3），最终浓度。 1纳米（10μM股票，***溶解T3 1N氢氧化钠和添加中，使10μM股票。西格玛猫＃T-2877）
储存于4℃下，良好的一个星期
诱导培养基
维持培养基含有下列化合物：
吲哚美辛，最终浓度。 125微米（0.125 M的股票乙醇，适马猫＃I-7378）。吲哚美辛，必须加热至60℃进行溶解。
地塞米松，最终浓2微克/毫升（2毫克/毫升的袜子在乙醇中，Sigma公司猫＃D-1756）
3 - 异丁基-1 - 甲基黄嘌呤（IBMX），最终浓度。 0.5毫米（0.25 M DMSO，Sigma公司股票在猫＃I-5879）
罗格列酮，终浓度。 0.5μM（10 mM的股票在DMSO，Sigma目录＃R-2408）
注意：每次作出新的诱导培养基。
- 原代脂肪细胞生长至95-97％汇合，在完全培养基（汇合但不能太包装）
- 变化规律完全培养基诱导培养基（第0天）
- 经过48个小时（2天），变更中维持培养基中，罗格列酮（0.5μM）
- 额外的48小时（4天）后，改变与罗格列酮（1μM）2-3天的新鲜维持液。加入诱导培养基后6-7天，细胞完全分化成熟的脂肪细胞，并填充有油滴。诱导后，液滴周围会出现3-4天。
注意：更改介质每隔2-3天，直至完全分化的细胞。
现在可以收获细胞mRNA的表达UCP1和其他可通过定量RT-PCR·布朗脂肪细胞特异性基因。 Western blot分析将被用于检测蛋白质。
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Representative Results
原代脂肪细胞褐变的可访问通过测量UCP1和其他棕色脂肪特异性或选择性由定量RT-PCR的基因的mRNA的表达。示于图1是腹股沟WAT-衍生的原代脂肪细胞中的基因表达数据。将细胞诱导分化，分别在存在两种不同剂量的罗格列酮，在50纳米和500纳米。 4小时收获前10μMforskolin的细胞治疗的一个子集。这将引起循环AMP（cAMP）的细胞和，包括UCP1的表达，激活热基因程序。
正如图1A中所示，罗格列酮鲁棒诱导UCP1 mRNA的表达。毛喉素治疗（cAMP）的进一步增强，罗格列酮诱导UCP1表达。另一个棕色脂肪选择性基因，CIDEA的表达也被稳健诱导的罗格列酮以剂量依赖的方式（ 图1B）。 <em>的FABP4是棕色脂肪细胞和白色脂肪PPARγ和脂肪细胞标记的直接目标。 如图1C所示，FABP4的表达也增加了处理时用罗格列酮。这个褐变效果不是简单地由于脂肪细胞本身的提高，，UCP1和CIDEA表达的诱导以来UCP1和CIDEA的表达水平进行标准化FABP4（ 图1D，E）仍然显着。
要确认增加蛋白水平UCP1，应进行Western blot检测。正如在图2中，高剂量的罗格列酮（500 nm）的鲁棒增加的UCP1蛋白在细胞。更重要的是，如前面所示，Ohno 等人16，罗格列酮诱导米色细胞表现出升高的总的和非耦合的氧的消耗，在响应于cAMP的刺激，importaNT棕色脂肪细胞/米色细胞的功能特性。
图1。实时定量PCR（荧光定量RT-PCR）显示的诱导棕色脂肪选择性基因，包括UCP1（A）和CIDEA（B）。脂肪细胞的标记FABP4表达的是（C）。在哪里显示，细胞治疗与cAMP（10μMforskolin的）四小时收获前。提取总RNA，使用TRIzol试剂（Invitrogen公司）从分化的细胞。使用cDNA的反转录试剂盒（iScript，Applied Biosystems公司）进行逆转录和qRT-PCR SYBR绿色荧光染料使用的ABI ViiA7机进行重复的。 TATA结合蛋白（TBP）的功能，作为一个参考基因和在表1中所提供的引物序列。罗格列酮诱导棕色的选择香港专业教育学院基因UCP1（D）和CIDEA（E）正常化后，由脂肪细胞标记基因的FABP4。
图2。 UCP1在腹股沟与罗格列酮在治疗剂量的50纳米或500纳米的初级细胞中的蛋白表达水平的Western印迹的总细胞裂解物中分离出，并适用于西方印迹。 UCP1抗体（Abcam公司）被用于Western印迹。
| 基因 | 种类 | 正向引物 | 反向引物 |
| FABP4 | 鼠标 | ACACCGAGATTTCCTTCAAACTG | CCATCTAGGGTTATGATGCTCTTCA |
| CIDEA | 鼠标 | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT |
| TBP | 鼠标 | ACCCTTCACCAATGACTCCTATG | TGACTGCAGCAAATCGCTTGG |
| UCP1 | 鼠标 | CACCTTCCCGCTGGACACT | CCCTAGGACACCTTTATACCTAATGG |
表1中。实时定量PCR分析的引物序列。
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Discussion
在这里，我们提出了一个可靠的蜂窝系统研究的发展，米色/ BRITE细胞的原代培养的脂肪细胞在小鼠体内。几个可用的永生化细胞系相比，这个系统是有可能提供增强相关的的白色脂肪在体内的褐变。
即使这些原代脂肪细胞的研究提供了一定的优势，也存在着一定的局限性和关切问题，是重要的考虑因素。首先，这个系统是高度依赖的细胞的分化能力。如UCP1和CIDEA棕色脂肪选择性基因表达，尤其是分化依赖。例如，PPARγ激动剂和BMP7也提高脂肪生成，因此，“褐变”的影响必须要相当相似的程度的分化细胞中访问。或者，如在图1D和 E所示，正火的棕色脂肪选择性表达与脂肪细胞分化的标记基因，如FABP4的基因可能是有用的。其次，重要的是小鼠的年龄。这也许是很有诱惑力的使用，以获得尽可能多的细胞尽可能大小鼠，但随着年龄下降分化。这将是有趣的检查内部和外部的线索，如暴露于寒冷的环境，肥胖，胰岛素抵抗或老化如何影响细胞的增殖，自我更新或分化能力，这种细胞类型，这种文化系统。在我们的例子中，型C57BL/6J小鼠在适当的年龄是6-8周。三，原代细胞一般比永生的脂肪细胞线更敏感，更脆弱。尽管BAT或皮下脂肪前体细胞从WAT有更好的内脏WAT增殖和分化能力的几个段落后，他们往往会失去其分化能力。我们通常诱导分化的第3代的最大范围内。
另一个IMPORTANT方面要考虑的是，间质血管的一部分，是一种异质性的细胞群。在这个协议中，我们着重对前脂肪细胞和开启的棕色脂肪PPARγ激动剂罗格列酮的存在下，选择性遗传程序的能力。最近的研究表明，PDGFRA阳性双向烈性祖细胞在腹腔WAT产生棕色脂肪细胞在体内 17的 β-肾上腺素能刺激响应。然而，实际中出现的PPARγ激动剂治疗慢性的的米色/ BRITE细胞的来源尚不清楚。的辩论和研究人员专注于这一根本问题，是通过加强白到棕色脂肪转化褐变的白色脂肪，通过承诺的棕色脂肪前体细胞的增殖或通过成熟的白 色脂肪细胞的转分化18,19。
罗格列酮已被公知的白色脂肪在体外诱导的褐变20-26 在体内 。有趣的是，激活PPARγ的合成激动剂可以诱发褐变的白色脂肪，然而，过度的PPARγ在白色脂肪细胞是不足够27。我们先前的研究显示，，，PPARγ激动剂诱导的褐变效应是部分介导的，通过蛋白质稳定PRDM16 16。因此，确定小分子化合物或稳定PRDM16蛋白的内源性分子，能特别引起褐变的白色脂肪。目前的方法提供了一种坚固和可靠的实验系统，以识别这样的因素，这些因素可能导致一种新的治疗肥胖和糖尿病的治疗干预。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
我们感谢大野治哉，筱田耕作，路易·夏普，友田惠美，劳伦·鲁伊斯的手稿上的讨论，技术帮助和编辑协助。这项工作是支持的股份从哥本哈根与欧盟FP7：项目DIABAT（HEALTH-F2大学的博士研究生奖学金补助金从美国国立卫生研究院（DK087853），从程序突破性的生物医学研究和从Asubio医药公司SKULA的支持-2011-278373）莉莎·马德森和Karsten克里斯蒂安森。我们也承认DERC的中心授予（NIH P30 DK063720）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
References
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