Summary
Préadipocytes primaires blanches isolées à partir de tissus adipeux blancs chez la souris peuvent être différenciées en cellules beige / brite. Présenté ici est un système modèle cellulaire fiable pour étudier la régulation moléculaire de "brunissement" de graisse blanche.
Abstract
Adipocytes bruns ont la possibilité de découpler la chaîne respiratoire dans les mitochondries et dissiper l'énergie chimique sous forme de chaleur. Développement d'UCP1-positifs adipocytes bruns dans les tissus adipeux blancs (que l'on appelle les cellules beige ou brite) est fortement induite par une variété de facteurs environnementaux tels que l'exposition au froid ou chronique par des agonistes PPARy, par conséquent, ce type de cellule a un potentiel en tant que cible thérapeutique pour traitement de l'obésité. Bien que la plupart des lignes adipocytes immortalisés ne peut pas résumer le processus de «brunissement» de la graisse blanche dans la culture, les adipocytes primaires isolés de la fraction vasculaire du stroma dans le tissu sous-cutané adipeux blanc (WAT) fournir un système fiable cellulaire pour étudier le contrôle moléculaire du développement des cellules beige / brite . Nous décrivons ici un protocole pour une isolation efficace des pré-adipocytes primaires et pour induire la différenciation des cellules beige / brite en culture. L'effet de brunissement peut être évaluée par l'expression de la graisse brune sélective marqueteurs tels que UCP1.
Introduction
L'obésité est dramatiquement dans le monde augmente et est maintenant considéré comme l'un des problèmes les plus graves pour la santé publique 1. Cette condition est liée à un déséquilibre par rapport à l'apport énergétique de dépenses et les résultats de l'excès d'énergie stockée sous forme de lipides dans le tissu adipeux blanc (WAT). WAT élargie est associée à une augmentation de masse corporelle et de poids, tandis que le tissu adipeux brun est capable de dissiper l'énergie en excès pour produire de la chaleur. Ainsi BAT peut fonctionner comme une protection contre le froid et l'obésité 2,3. Ceci est réalisé par le découplage du transport des électrons dans les mitochondries par la protéine découplante 1 (UCP1). Cette protéine est considérée comme une caractéristique de thermogenèse sans frisson dans la MTD 3. Plusieurs études de ces dernières années ont révélé que les humains adultes ont fonctionnel 4-8 BAT et, par conséquent, la manipulation des MTD chez l'homme peut être une intervention thérapeutique potentielle dans la lutte contre l'obésité et ses maladies associées.
jove_content «preuves> actuelles indiquent que les deux types d'adipocytes bruns existent chez les rongeurs;« classique »ou« pré-existant "graisse brune se développe pendant la période prénatale et forme dédiée dépôts adipeux brun dans la région inter-scapulaire et d'autres tissus périphériques D'autre part. , un "inductible" sous forme de graisse brune (que l'on appelle les cellules brite ou beige) se développe pendant la phase post-natale et semble intercalées dans les tissus adipeux blancs. Les deux types d'adipocytes bruns sont également séparés par différentes origines développementales. Alors que la pré-existant adipocytes bruns proviennent de myoblastsic-Myf5 comme précurseurs, les inductibles brite / beige cellules intercalées dans WAT proviennent d'une lignée non Myf5 9,10. Par ailleurs, les voies de régulation de ce type de cellule est susceptible d'être différente de la brune Myf5 dérivé adipocytes 11. Le développement des cellules beiges (ie "brunissement" de la graisse blanche) peuvent être activés en réponse à l'exposition au froid chronique et àβ3-adrénergiques agonistes ou agonistes PPARy chez les adultes 12-14. Les cellules beige / brite sont susceptibles d'être une cible thérapeutique prometteuse pour la manipulation de la balance énergétique globale et peut potentiellement faire partie du traitement de l'obésité; par conséquent, il est important de comprendre les mécanismes moléculaires précis et voies de signalisation par laquelle des signaux environnementaux contrôlent le développement de beige cellules.Pour comprendre le contrôle moléculaire du brunissement de la graisse blanche, des expériences in vitro sont mieux adaptés comme la différenciation des pré-adipocytes se déroule plutôt de manière asynchrone et il est difficile de détecter les cellules dans 15 situ. Bien que les études sur le développement des adipocytes ont jusqu'ici été effectuées principalement sur des lignées cellulaires telles que les cellules 3T3-L1, 3T3-F442A ou Hib1, ces lignées cellulaires semblent manquer de la signature moléculaire des cellules beiges. D'autre part, les adipocytes primaires isolées à partir de WAT sous-cutanée sont les plus susceptibles de récapituler les process de brunissement de la graisse blanche dans une cellule autonome de la mode. Ici, nous fournissons un protocole pour une isolation efficace de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux et pour induire le brunissement de la graisse blanche en réponse à des agonistes PPARy. La rosiglitazone a été montré pour être un médiateur particulièrement efficace de brunissement dans ces cellules. Comme suggéré précédemment 16, ce système cellulaire peut être utilisé pour servir un système cellulaire fiable pour étudier le développement des cellules beige / brite.
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Protocol
1. Préparer milieu de digestion
Faire 5 ml par 5 souris par du tissu (environ 1 ml / 1 g tissu adipeux).
- Peser des enzymes de digestion:
- Collaginase D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223)
- Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0.980 mg / lyo, Roche, 11466200) - Ajouter 25 ml de PBS et bien mélanger pour dissoudre
- Ajouter CaCl 2 juste avant la digestion du tissu à une concentration finale de 10 mM
2. Disséquer les tissus adipeux des souris
- La dissection doit être effectuée avec soin et immédiatement après les souris (6-8 semaines) sont sacrifiés. Travailler avec de l'éthanol stérile pulvérisé sur la fourrure de la souris avant de l'ouvrir. Placez le tissu directement dans PBS propre, distincte BAT interscapulaire et sous-cutanée inguinale WAT.
- Pour BAT interscapulaire: avoir la souris placé à l'arrière fait face, découpé le long du dos et tout le chemin vers le cou. Le brunle tissu adipeux se trouve juste sous la peau entre les épaules (interscapulaire). MTD peuvent être considérés comme les deux lobes en forme de papillon,. Une fine couche de graisse blanche couvrant la MTD devrait être soigneusement enlevés.
- Pour sous-cutanée WAT (WAT inguinale): enlever la peau. Inguinale WAT se trouve directement sous la peau des deux côtés, en commençant presque sur le dos et aller à côté, à l'intérieur des cuisses et le bas en direction du testicule.
3. Couper et digérer le tissu adipeux
- Supprimer rapidement toute contamination, comme les cheveux, les muscles squelettiques et du tissu conjonctif des coupes de tissus.
- Séchez les tissus rapidement sur le papier pour ne pas diluer le milieu de dissection avec du PBS et le placer sur une plaque sèche.
- Ajouter milieu de digestion (ajouté CaCl 2 avant la digestion) et émincer le tissu en petits morceaux. Mélangez bien à la pipette de haut en bas avec une pipette de 5 ml. Transférez les tissus hachés dans des tubes de 50 ml avec le reste de la digestion moyen, mélangez encore plus par pipetage de haut en bas.
- Digestion à 37 ° C sous agitation constante à 150 tours par minute pendant 40-50 min. Vérifiez toutes les 10-15 minutes pour vous assurer que la digestion se passe bien et pour éviter une sur-digestion.
Remarque: milieu de digestion correcte et le temps sont importants. Le tissu doit être bien digéré, mais la digestion excès peut endommager les cellules.
4. Suspension Cellulaire filtre
- Arrêtez la digestion en ajoutant 5 ml de milieu complet (DMEM/F12 contenant FPS de 10% et P / S). Les cellules doivent être presque complètement homogène. Bien mélanger par pipetage.
- Centrifuger à 700 xg pendant 10 min.
- SVF peut désormais être considérée comme une pastille brunâtre sur le fond du tube. Aspirer le gras des adipocytes matures couche sur le dessus et plus de la couche liquide - garder le culot et le dissoudre dans 10 ml de milieu complet. Mélangez bien.
- Placez un tamis cellulaire (50-70 um de diamètre) sur une 50 nouveaux Tube ml et filtrer la suspension de cellules.
5. Cellules de la plaque
- Transfert suspension de cellules dans un tube de 15 ml et centrifuger à 700 xg pendant 10 min.
- Aspirer à moyen et à remettre en suspension le culot dans 10 ml de milieu complet. Pipette et bien mélanger.
- Estimer combien de plaques sont nécessaires. Cela peut varier et dépend de la grosseur des granules. Une règle générale est de 2 des plaques de 10 cm de 5 souris pour inguinale WAT et une plaque de 10 cm pour les MTD.
- Cellules de la plaque sur les plats revêtus de collagène (R & D) dans un milieu complet
- 1-2 heures après l'étalement des cellules, moyen aspirer, laver avec du PBS deux fois et ajouter du milieu frais. Cette étape est importante, car cela peut éliminer les globules rouges, les cellules immunitaires et d'autres contaminants.
6. Différencier les cellules
- Faire l'entretien et les médiums à induction.
Un milieu d'entretien
Milieu complet additionné de:
ent "> L'insuline, concentration finale. 5 pg / ml (5 mg / ml, *** 100 ul d'acide acétique dans 10 ml H 2 O pour préparer pH de l'eau acidifiée 2.5. actions magasin dissoudre l'insuline dans l'eau acidifiée. à -20 ° C)3,3 ',5-triiodo-L-thyronine (T3), concentration finale. 1 nM (10 uM actions, *** dissoudre T3 dans NaOH 1N et ajouter du milieu pour faire 10 en stock uM. Sigma cat # T-2877)
Conserver à 4 ° C, bon pour une semaine
Un milieu d'induction
Un milieu d'entretien contenant des composés suivants:
Indométhacine, concentration finale. 125 microns (0,125 stock M dans l'éthanol, le chat Sigma # I-7378). Indomethacin doit être chauffé à 60 ° C doit être dissoute.
Dexaméthasone, concentration finale. 2 pg / ml (2 mg / ml dans de l'éthanol chaussette, Sigma cat # D-1756)
3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), concentration finale. 0,5 mM (0,25 stock M dans le DMSO, Sigma cat # I-5879)
La rosiglitazone, concentration finale. 0,5 uM(10 actions mM dans du DMSO, Sigma cat # R-2408)
Remarque: Assurez-induction du milieu frais à chaque fois.
- Cultivez adipocytes primaires jusqu'à la confluence de 95-97% en milieu complet (confluente mais pas trop emballé)
- Changez régulièrement milieu complet avec un milieu d'induction (jour 0)
- Après 48 heures (jour 2), modifier un média à l'entretien avec la rosiglitazone (0,5 uM)
- Après plus de 48 heures (jour 4), changer de milieu d'entretien frais avec la rosiglitazone (1 uM) pour 2-3 jours supplémentaires. 6-7 jours après l'ajout du milieu d'induction, les cellules sont complètement différenciées de cellules adipeuses matures et sont remplis de gouttelettes d'huile. Gouttelettes apparaissent autour de 3-4 jours après l'induction.
Remarque: moyen Changer tous les 2-3 jours jusqu'à ce que les cellules sont complètement différenciées.
Les cellules peuvent maintenant être récoltées et expression de l'ARNm de Ucp1 et otheR Brown gènes spécifiques des adipocytes peut être mesurée par qRT-PCR. Western blot est utilisé pour détecter des protéines.
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Representative Results
Brunissement des adipocytes primaires sont accessibles par la mesure de l'expression d'ARNm de Ucp1 et d'autres gènes de graisse brune spécifique ou sélectif par QRT-PCR. La figure 1 présente des données d'expression de gènes dans inguinales WAT-adipocytes primaires dérivés. Les cellules ont été induites à se différencier en présence de deux doses différentes de la rosiglitazone à 50 nM et 500 nM, respectivement. Un sous-ensemble de cellules a été traité avec de la forskoline à 10 uM pendant 4 heures avant la récolte. Cela entraînera l'AMP cyclique (AMPc) dans les cellules et activer le programme gène thermogénique y compris Ucp1 expression.
Comme le montre la figure 1A, la rosiglitazone robuste induite Ucp1 expression de l'ARNm. La forskoline traitement (AMPc) encore augmenté l'expression induite par la rosiglitazone UCP1. Un autre graisse brune sélective de gènes, expression CIDEA a également été robuste induite par la rosiglitazone dans une manière dose-dépendante (figure 1B). <em> FABP4 est une cible directe de PPARy et un marqueur adipogénique à la fois la graisse brune et la graisse blanche. Comme le montre la figure 1C, FABP4 expression a également été augmentée lors d'un traitement avec la rosiglitazone. Cet effet de brunissement n'était pas simplement dû à une augmentation de l'adipogenèse en soi, puisque l'induction de l'expression et Ucp1 CIDEA était encore importante, même si les taux d'ARNm de Ucp1 et CIDEA ont été normalisées à celles des FABP4 (1D figures et E).
Pour confirmer le niveau de protéines a augmenté de UCP1, Western blot doit être effectuée. Comme présenté dans la figure 2, une forte dose de rosiglitazone (500 nM) solidement augmenté UCP1 protéines dans les cellules. Surtout, comme indiqué précédemment dans Ohno et al. 16, de la rosiglitazone inductible cellules beige a montré surélevée consommation totale d'oxygène et découplées en réponse à la stimulation de l'AMPc, un importacaractéristiques fonctionnelles nt de cellules adipocytes bruns / beige.
Figure 1. Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) montrant l'induction de la graisse brune sélectifs gènes dont Ucp1 (A) et CIDEA (B). L'expression d'un marqueur FABP4 adipogénique est également indiqué (C). Le cas échéant, les cellules ont été traitées avec de l'AMPc (forskoline à 10 uM) pendant quatre heures avant la récolte. L'ARN total a été extrait à partir de cellules différenciées à l'aide TRIzol (Invitrogen). La transcription inverse a été réalisée à l'aide d'un kit de transcription inverse d'ADNc (iScript, Applied Biosystems) et qRT-PCR a été réalisée en double avec SYBR green colorant fluorescent à l'aide d'une machine ABI ViiA7. TATA-binding protein (TBP) a fonctionné comme un gène de référence et séquences des amorces sont fournis dans le tableau 1. La rosiglitazone induit le brun-selective gènes UCP1 (D) et CIDEA (E) après normalisation par un gène marqueur adipogénique FABP4.
Figure 2. Western blot de UCP1 taux de protéines dans des cellules primaires inguinales traités par rosiglitazone à la dose de 50 nM ou 500 nM. Lysats cellulaires totaux ont été isolés et appliquée pour blottings occidentaux. UCP1 anticorps (Abcam) a été utilisé pour Western blot.
| Gène | Espèce | Amorce avant | Inverser primaire |
| FABP4 | souris | ACACCGAGATTTCCTTCAAACTG | CCATCTAGGGTTATGATGCTCTTCA |
| CIDEA | souris | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT |
| Tbp | souris | ACCCTTCACCAATGACTCCTATG | TGACTGCAGCAAATCGCTTGG |
| Ucp1 | souris | CACCTTCCCGCTGGACACT | CCCTAGGACACCTTTATACCTAATGG |
Tableau 1. Les séquences des amorces pour l'analyse en temps réel qPCR.
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Discussion
Nous présentons ici un système cellulaire fiable pour étudier le développement des cellules beige / brite dans les adipocytes en culture primaire chez la souris. Par rapport à plusieurs lignées cellulaires immortalisées disponibles, ce système est susceptible d'offrir une importance accrue au brunissement de la graisse blanche in vivo.
Même si l'étude de ces adipocytes primaires offre certains avantages, il existe aussi quelques limitations et les préoccupations qui sont importants à considérer. Tout d'abord, ce système est fortement tributaire de la puissance différenciation des cellules. Expression de la graisse brune sélectifs gènes tels que Ucp1 et CIDEA sont particulièrement dépendante de la différenciation. Par exemple, les agonistes de PPAR et BMP7 également d'améliorer l'adipogenèse, par conséquent, les "brunissement" effets doivent être assez accessible dans des cellules avec des degrés similaires de différenciation. Sinon, comme indiqué dans les figures 1D et E, la normalisation de l'expression de la graisse brune sélectifgènes avec celui des gènes marqueurs de l'adipogenèse comme FABP4 peut être utile. Deuxièmement, l'âge de la souris est important. On pourrait peut-être tenté d'utiliser la souris grandes afin d'obtenir des cellules autant que possible, mais que la baisse de différenciation avec l'âge. Il serait intéressant d'examiner comment les signaux internes et externes tels que l'exposition au froid, l'obésité, l'insulino-résistance ou le vieillissement affecte la capacité de prolifération, l'auto-renouvellement ou la différenciation de ce type de cellules en utilisant ce système de culture. Dans notre cas, l'âge approprié de souris de type C57BL/6J est entre 6-8 semaines. Troisièmement, les cellules primaires sont en général plus sensible et plus fragile que immortalisés lignes adipocytes. Bien que préadipocytes de la BAT ou sous-cutanée WAT ont une meilleure capacité de prolifération et de différenciation que ceux des viscérale WAT, ils ont tendance à perdre leur capacité de différenciation après plusieurs passages. Nous normalement induire une différenciation dans un délai maximum de 3 passages.
Un autre importantaspect important à considérer est que la fraction stroma-vasculaire est une population hétérogène de cellules. Dans ce protocole, nous nous concentrons sur les préadipocytes et leur capacité à tourner sur un tissu adipeux brun-programme génétique sélective en présence d'un agoniste PPARy rosiglitazone. Une étude récente a montré que PDGFRA-positives bi-puissants ancêtres dans le WAT abdominale donne lieu à des adipocytes bruns en réponse à la stimulation bêta-adrénergique in vivo 17. Cependant, l'origine réelle des cellules beige / brite qui émergent en réponse à un traitement agoniste PPARy chronique demeure incertaine. Le débat a été active et les chercheurs sont préoccupés par cette question fondamentale; c'est le brunissement de la graisse blanche grâce à une meilleure blanche à brun conversion de graisse, grâce à la prolifération des préadipocytes bruns ou engagés par transdifférenciation des adipocytes matures blancs 18,19.
La rosiglitazone a été connu pour induire le brunissement de la graisse blanche in vitro et in vivo 20-26. Fait intéressant, l'activation de PPAR par des agonistes synthétiques peuvent induire le brunissement de la graisse blanche, cependant, la surexpression de PPARy dans les adipocytes blancs ne suffit pas 27. Nous avons précédemment montré que l'induite par un agoniste PPARy effet de brunissement est médiée en partie par la stabilisation des protéines de PRDM16 16. Par conséquent, l'identification de composés de petites molécules endogènes ou qui stabilisent PRDM16 protéine peut être en mesure d'induire spécifiquement le brunissement de la graisse blanche. Méthode actuelle fournit un système robuste et fiable expérimentale pour identifier de tels facteurs, qui pourraient conduire à une nouvelle intervention thérapeutique pour le traitement de l'obésité et du diabète.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Nous remercions Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, et Lauren Ruiz de discussion, une aide technique et aide à la rédaction du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (DK087853), du Programme de recherche biomédicale et percée de Asubio Pharm Inc SKULA a été pris en charge par un ACTIONS bourses de doctorat de l'Université de Copenhague et l'UE projet FP7 Diabat (SANTÉ-F2 -2011 à 278373) à Lise Madsen et Karsten Kristiansen. Nous reconnaissons aussi le centre DERC subvention (NIH P30 DK063720).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
References
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