Summary
प्राथमिक सफेद चूहों में सफेद वसा ऊतकों से पृथक preadipocytes beige / brite कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत एक विश्वसनीय सेलुलर मॉडल सफेद वसा के भूरे की आणविक विनियमन का अध्ययन करने के लिए प्रणाली है.
Abstract
ब्राउन adipocytes mitochondria में सांस की श्रृंखला ताल्लुक तोड़ देना और गर्मी के रूप में रासायनिक ऊर्जा नष्ट करने की क्षमता है. सफेद वसा ऊतकों (तथाकथित beige या brite कोशिकाओं) में UCP1 सकारात्मक भूरे रंग adipocytes के विकास अत्यधिक पुरानी ठंड जोखिम के रूप में या PPARγ agonists द्वारा पर्यावरण cues की एक किस्म के द्वारा प्रेरित है, इसलिए इस सेल प्रकार के लिए एक चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में की क्षमता है मोटापे के इलाज. हालांकि अधिकांश अमर adipocyte लाइनों संस्कृति में सफेद वसा के भूरे "की प्रक्रिया नहीं पुनरावृत्ति कर सकते हैं, प्राथमिक adipocytes चमड़े के नीचे सफेद वसा ऊतकों में stromal संवहनी अंश (WAT) से अलग beige / brite सेल विकास की आणविक नियंत्रण अध्ययन के लिए एक विश्वसनीय सेलुलर प्रणाली प्रदान करने के लिए . हम यहाँ प्राथमिक preadipocytes के प्रभावी अलगाव के लिए और संस्कृति में beige / brite कोशिकाओं को भेदभाव उत्प्रेरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. भूरे प्रभाव भूरे रंग के निशान वसा चयनात्मक की अभिव्यक्ति द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता हैUCP1 के रूप में इस तरह के नेताओं.
Introduction
मोटापे की वजह से नाटकीय रूप से बढ़ रही है और दुनिया भर में है अब एक 1 सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए सबसे गंभीर चिंताओं में से एक माना जाता है. इस हालत के लिए ऊर्जा का सेवन सापेक्ष में एक व्यय misbalance और अतिरिक्त सफेद वसा ऊतकों में लिपिड (WAT) के रूप में संग्रहीत ऊर्जा में परिणाम से संबंधित है. बढ़े WAT बढ़ शरीर द्रव्यमान और वजन के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि ब्राउन वसा ऊतकों फैलने अतिरिक्त ऊर्जा के लिए गर्मी का उत्पादन करने की क्षमता है. इसलिए बैट दोनों सर्दी और 2,3 मोटापे के खिलाफ संरक्षण के रूप में कार्य कर सकते हैं. यह mitochondria में एक प्रोटीन (UCP1) uncoupling इलेक्ट्रॉन परिवहन के uncoupling द्वारा हासिल की है. इस प्रोटीन 3 बैट में thermogenesis nonshivering के लिए एक बानगी माना जाता है. हाल के वर्षों में कई अध्ययनों से पता चला है कि वयस्क मानव कार्यात्मक बैट 4-8 है और इसके परिणामस्वरूप, मनुष्यों में बल्ले के हेरफेर मोटापा और उसके संबंधित रोगों के खिलाफ लड़ाई में एक संभावित चिकित्सकीय हस्तक्षेप हो सकता है.
"jove_content> वर्तमान साक्ष्य इंगित करता है कि भूरे रंग adipocytes की दो प्रकार कृन्तकों में मौजूद हैं," शास्त्रीय "या" पूर्व मौजूदा "भूरे वसा जन्म के पूर्व चरण के दौरान विकसित और समर्पित interscapular क्षेत्र और अन्य परिधि के ऊतकों में भूरे वसा डिपो रूपों दूसरी ओर. भूरा वसा (तथाकथित brite या बेज कोशिकाओं) का एक "inducible" फार्म प्रसवोत्तर चरण के दौरान विकसित और सफेद वसा ऊतकों में interspersed होता भूरे रंग adipocytes के दो प्रकार के भी विभिन्न विकासात्मक मूल से अलग होती है. जबकि पूर्व मौजूदा भूरे रंग adipocytes myoblastsic Myf5 व्यापारियों तरह से उठता है, inducible / brite बेज WAT में interspersed कोशिकाओं को एक गैर Myf5 9,10 वंश से पैदा होती है इसके अलावा, इस सेल प्रकार की विनियामक रास्ते Myf5 व्युत्पन्न भूरे रंग से अलग होने की संभावना है. 11 adipocytes. beige कोशिकाओं (यानी सफेद वसा के भूरे ") विकास पुरानी ठंड जोखिम करने के लिए और प्रतिक्रिया में सक्रिय किया जा सकता हैβ3 adrenoceptor-agonists या 12-14 वयस्कों में PPARγ agonists. बेज रंग / brite कोशिकाओं समग्र ऊर्जा संतुलन के हेरफेर के लिए एक आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्य होने की संभावना हैं और संभवतः मोटापे के इलाज का हिस्सा बन सकता है, इसलिए, यह महत्वपूर्ण है सटीक आणविक तंत्र और संकेत मार्ग है जिसके द्वारा पर्यावरण cues beige के विकास को नियंत्रित समझ कोशिकाओं.सफेद वसा के भूरे के आणविक नियंत्रण को समझने के लिए, इन विट्रो प्रयोगों में सर्वश्रेष्ठ जगह asynchronously बल्कि लेता preadipocytes के भेदभाव के रूप में उपयुक्त हैं और यह 15 में स्वस्थानी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए मुश्किल है. हालांकि adipocyte विकास पर अध्ययन के इस प्रकार अब तक ऐसे 3T3 L1, 3T3 F442A या HIB1 के रूप में सेल लाइनों पर किया गया है मुख्य रूप से प्रदर्शन किया, इन सेल लाइनों beige कोशिकाओं के आणविक हस्ताक्षर की कमी दिखाई देते हैं. दूसरी ओर, प्राथमिक चमड़े के नीचे WAT से अलग adipocytes सबसे प्रक्रिया के पुनरावृत्ति करना की संभावनाएक सेल स्वायत्त फैशन में सफेद वसा के भूरे. यहाँ हम वसा ऊतकों से stromal संवहनी अंश प्रभावी अलगाव के लिए और PPARγ agonists के जवाब में सफेद वसा के भूरे उत्प्रेरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. Rosiglitazone इन कोशिकाओं में एक भूरे की विशेष रूप से प्रभावी मध्यस्थ होना दिखाया गया है. जैसा कि पहले 16 सुझाव दिया है, इस सेलुलर प्रणाली के लिए एक विश्वसनीय सेलुलर के लिए beige / brite कोशिकाओं के विकास का अध्ययन प्रणाली की सेवा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Protocol
1. पाचन मध्यम तैयार
ऊतक 5 प्रति चूहों (लगभग 1 मिलीग्राम / 1 ग्राम वसा ऊतकों) प्रति 5 मिलीग्राम.
- पाचन एंजाइमों में वजन:
- Collaginase डी: 1.5 यू / मिलीलीटर (1108874103, 1 ग्राम, Roche,, 70,334,223)
- Dispase द्वितीय: 2.4 यू / मिलीलीटर (04942078001, 0980 11,466,200 मिलीग्राम / Lyo, रॉश,) - 25 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से भंग करने के लिए
- 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में 2 CACL सिर्फ ऊतक के पाचन के लिए पूर्व में जोड़ें
2. चूहों से वसा ऊतकों टुकड़े करना
- विच्छेदन ध्यान प्रदर्शन किया जाना चाहिए, और चूहों के तुरंत बाद (6-8 सप्ताह पुराना) बलिदान कर रहे हैं. माउस फर पर छिड़काव इथेनॉल के साथ इसे खोलने से पहले बाँझ काम करते हैं. साफ Pbs, अलग interscapular बैट और उपचर्म वंक्षण WAT में ऊतक सीधे जगह.
- Interscapular बल्लेबाजी के लिए: माउस का सामना करना पड़ा वापस साथ रखा है, पीठ और गर्दन के लिए सभी तरह के साथ खुले में कटौती. ब्राउनवसा ऊतक कंधे (interscapular) के बीच सही त्वचा के नीचे पाया जा सकता है. बैट दो lobes, तितली के आकार के रूप में देखा जा सकता है. सफेद वसा की एक पतली परत बैट को कवर ध्यान से हटाया जाना चाहिए.
- चमड़े के नीचे WAT (वंक्षण WAT) के लिए: त्वचा को हटा दें. वंक्षण WAT सीधे दोनों पक्षों पर त्वचा के नीचे पाया जाता है, लगभग पीठ पर शुरू करने और बगल में जा रहा है, जांघों के अंदर और अंडकोष नीचे की ओर.
3. कट और वसा ऊतकों को पचाने
- जल्दी बाल, कंकाल की मांसपेशी और ऊतक वर्गों से संयोजी ऊतक की तरह सभी संदूषण हटा दें.
- ऊतक जल्दी से कागज पर पीबीएस के साथ पतला नहीं विच्छेदन मध्यम और यह एक सूखी थाली पर जगह सूखी.
- पाचन (2 पाचन के लिए पहले CACL जोड़ा) मध्यम और छोटे टुकड़ों में ऊतक बोटी - बोटी करना जोड़ें. एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ और नीचे pipetting द्वारा बहुत अच्छी तरह से मिलाएं. पाचन मीटर के बाकी के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब में कीमा बनाया हुआ ऊतकों स्थानांतरणedium, pipetting और नीचे से भी अधिक मिश्रण.
- डाइजेस्ट 37 ° C 40-50 मिनट के लिए 150 rpm पर लगातार आंदोलन के साथ है. यकीन है कि पाचन ठीक चल रहा है और अधिक पाचन को रोकने के लिए हर 10-15 मिनट की जाँच करें.
नोट: सही पाचन मध्यम और समय के लिए महत्वपूर्ण हैं. ऊतकों को अच्छी तरह पच होने की जरूरत है, लेकिन अतिरिक्त पाचन कोशिकाओं को नुकसान कर सकते हैं.
4. फ़िल्टर सेल सस्पेंशन
- 5 मिलीलीटर पूरा मध्यम (DMEM/F12 युक्त एफपीएस 10% और पी / एस) जोड़कर पाचन बंद करो. कोशिकाओं को लगभग पूरी तरह से समरूप होना चाहिए. Pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
- 10 मिनट के लिए 700 XG अपकेंद्रित्र.
- SVF अब ट्यूब के तल पर एक भूरा गोली के रूप में देखा जा सकता है. तेल और तरल परत के ऊपर सबसे पर परिपक्व adipocyte परत Aspirate - गोली रखने के लिए और यह 10 मिलीलीटर पूरा मध्यम में भंग. अच्छी तरह से मिलाएं.
- एक नया 50 पर एक सेल झरनी (50-70 सुक्ष्ममापी व्यास) प्लेस मिलीलीटर ट्यूब और सेल निलंबन फिल्टर.
5. प्लेट कोशिकाओं
- एक 15 मिलीग्राम और 10 मिनट के लिए 700 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र सेल निलंबन स्थानांतरण.
- मध्यम Aspirate और 10 मिलीलीटर पूरा मध्यम में फिर से को निलंबित गोली. पिपेट और मिश्रण अच्छी तरह से.
- अनुमान कितने प्लेटों की जरूरत है. यह भिन्न है और गोली के आकार पर निर्भर करता है. एक सामान्य नियम 2 वंक्षण वाट के लिए 5 चूहों और एक बैट के लिए 10 सेमी थाली से 10 सेमी प्लेटों की है.
- प्लेट कोलेजन लेपित व्यंजन पर पूरा मध्यम में कोशिकाओं (आर एंड डी)
- कोशिकाओं, Aspirate मध्यम चढ़ाना के बाद 1-2 घंटा, पीबीएस के साथ दो बार धोने और ताजा मध्यम जोड़ें. यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि यह लाल रक्त कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और अन्य contaminants को दूर कर सकते हैं.
6. कोशिकाओं को अलग
- रखरखाव और प्रेरण माध्यमों.
रखरखाव मध्यम
साथ जोड़ा पूरा मध्यम:
> इंसुलिन, अंतिम सान्द्र 5 ग्राम / मिलीलीटर (शेयर 5 मिलीग्राम / एमएल, *** एसिटिक एसिड के 10 मिलीलीटर एच 2 हे में 100 μl acidified पानी पीएच 2.5 तैयार. ent "स्टोर acidified पानी में इंसुलिन को भंग पर शेयर -20 डिग्री सेल्सियस)3,3 '(T3) ,5 Triiodo एल thyronine, अंतिम सान्द्र. 1 एनएम (10 सुक्ष्ममापी स्टॉक, *** 1N NaOH में T3 को भंग करने और 10 सुक्ष्ममापी स्टॉक बनाने के लिए मध्यम जोड़ने के लिए सिग्मा बिल्ली # टी 2877)
4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस, एक सप्ताह के लिए अच्छा
प्रेरण मध्यम
रखरखाव निम्न यौगिकों से युक्त मध्यम:
इंडोमेथासिन, अंतिम सान्द्र. 125 सुक्ष्ममापी (.125 एम इथेनॉल में शेयर, सिग्मा बिल्ली # मैं 7378). इंडोमेथासिन 60 के लिए गर्म किया जाना चाहिए ° C भंग किया जा.
Dexamethasone, अंतिम सान्द्र. 2 ग्राम / मिलीलीटर (2 मिलीग्राम / मिलीलीटर जुर्राब इथेनॉल में, सिग्मा बिल्ली # डी - 1756)
(IBMX) 3 Isobutyl 1 - methylxanthine, अंतिम सान्द्र. 0.5 मिमी (0.25 DMSO में एम स्टॉक, सिग्मा बिल्ली # मैं 5879)
Rosiglitazone, अंतिम सान्द्र. 0.5 सुक्ष्ममापी(DMSO में 10 मिमी स्टॉक, सिग्मा बिल्ली # आर 2408)
नोट: हर बार मध्यम ताजा प्रेरण.
- पूरा मध्यम में 95-97% संगम (सहधारा लेकिन पैक भी नहीं) के लिए प्राथमिक adipocytes बढ़ो
- प्रेरण मध्यम (0 दिन) के साथ नियमित रूप से पूरा मध्यम बदलें
- 48 घंटा (2 दिन) के बाद, rosiglitazone (0.5 सुक्ष्ममापी) के साथ रखरखाव मध्यम मध्यम बदलने
- अतिरिक्त 48 घंटे (4 दिन) के बाद, rosiglitazone के साथ नए सिरे से रखरखाव के अतिरिक्त 2-3 दिनों के लिए मध्यम (1 सुक्ष्ममापी) के लिए बदल जाते हैं. प्रेरण मध्यम जोड़ने के बाद 6-7 दिन, कोशिकाओं को पूरी तरह से वसा कोशिकाओं को परिपक्व भेदभाव कर रहे हैं और तेल की बूंदों के साथ भरा. बूंदों के अधिष्ठापन के बाद 3-4 दिनों के चारों ओर दिखाई देगा.
नोट: बदले मध्यम 2-3 दिनों हर जब तक कोशिकाओं को पूरी तरह से भेदभाव कर रहे हैं.
कोशिकाओं को अब और काटा जा सकता है Ucp1 और othe mRNA अभिव्यक्तिqRT-पीसीआर द्वारा r भूरे रंग adipocyte विशेष जीन मापा जा सकता है. वेस्टर्न ब्लॉट प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
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Representative Results
QRT-पीसीआर द्वारा Ucp1 mRNA अभिव्यक्ति और अन्य भूरे वसा विशिष्ट या चुनिंदा जीन को मापने के द्वारा प्राथमिक adipocytes की ब्राउनिंग पहुँचा जा सकता है. चित्रा 1 में प्रस्तुत जीन वंक्षण WAT व्युत्पन्न प्राथमिक adipocytes में अभिव्यक्ति डेटा है. कोशिकाओं के 50 एनएम और 500 एनएम पर rosiglitazone की दो अलग अलग मात्रा की उपस्थिति में अंतर, क्रमशः के लिए प्रेरित किया गया. कोशिकाओं के एक सबसेट forskolin साथ 4 घंटा पूर्व फसल के लिए के लिए 10 सुक्ष्ममापी पर इलाज किया गया था. यह कोशिकाओं में चक्रीय एएमपी (शिविर) प्रेरित और Ucp1 अभिव्यक्ति सहित thermogenic जीन कार्यक्रम को सक्रिय करेंगे.
जैसा चित्र 1 ए में दिखाया गया, rosiglitazone robustly Ucp1 mRNA अभिव्यक्ति प्रेरित किया. Forskolin उपचार (शिविर) आगे rosiglitazone प्रेरित UCP1 अभिव्यक्ति संवर्धित. एक और भूरे रंग के जीन वसा चयनात्मक, Cidea अभिव्यक्ति भी robustly एक खुराक पर निर्भर ढंग (चित्रा 1 बी) में rosiglitazone द्वारा प्रेरित किया. <em> Fabp4 PPARγ और दोनों भूरा वसा और सफेद वसा के लिए वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला मार्कर का एक सीधा लक्ष्य है. जैसा कि चित्र 1C में दिखाया, Fabp4 अभिव्यक्ति भी जब rosiglitazone के साथ इलाज करने के लिए बढ़ा दिया गया था. यह भूरे प्रभाव बस से प्रति adipogenesis के एक वृद्धि की वजह से नहीं था, क्योंकि Ucp1 और Cidea अभिव्यक्ति की प्रेरण अभी भी महत्वपूर्ण भी है अगर Ucp1 और Cidea mRNA स्तर (आंकड़े 1D और ई) Fabp4 के उन लोगों के लिए normalized थे.
लिए वृद्धि हुई UCP1 के प्रोटीन का स्तर की पुष्टि करने के लिए, वेस्टर्न ब्लॉट किया जाना चाहिए. चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है, rosiglitazone (500 एनएम) के एक उच्च खुराक robustly कोशिकाओं में प्रोटीन UCP1 वृद्धि हुई है. महत्वपूर्ण बात है, के रूप में पहले से Ohno एट अल में दिखाया 16, rosiglitazone-inducible beige कोशिकाओं शिविर उत्तेजना, एक importa जवाब में ऊंचा कुल और uncoupled ऑक्सीजन की खपत से पता चलाNT के भूरे रंग adipocytes / beige कोशिकाओं के कार्यात्मक विशेषताओं.
चित्रा 1. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT - पीसीआर) सहित Ucp1 (ए) और (बी) Cidea भूरे वसा चयनात्मक जीनों की प्रेरण दिखा एक वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला मार्कर Fabp4 की अभिव्यक्ति भी (सी) दिखाया गया है. जहां संकेत दिया है, कोशिकाओं शिविर (10 सुक्ष्ममापी पर forskolin) के साथ फसल के लिए पहले चार घंटे के लिए इलाज किया गया. कुल शाही सेना विभेदित TRIzol (Invitrogen) का उपयोग कोशिकाओं से निकाला गया था. रिवर्स प्रतिलेखन एक सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन किट (iScript, एप्लाइड Biosystems) का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया था और qRT-पीसीआर डुप्लिकेट में SYBR हरी फ्लोरोसेंट डाई एक अबी ViiA7 मशीन का उपयोग कर के साथ प्रदर्शन किया था. टाटा बाध्यकारी प्रोटीन (TBP) कार्य के रूप में एक संदर्भ जीन और प्राइमर दृश्यों तालिका 1 में प्रदान की जाती हैं. Rosiglitazone भूरे रंग का चयन करें प्रेरितive Ucp1 (डी) और उसके बाद एक वसा या मोटापा उत्पन्न करने वाला मार्कर Fabp4 जीन द्वारा सामान्य Cidea (ई) जीन.
चित्रा 2. वेस्टर्न ब्लॉट UCP1 वंक्षण प्राथमिक 50 एनएम या 500 एनएम की खुराक पर rosiglitazone के साथ इलाज किया कोशिकाओं में प्रोटीन का स्तर कुल सेल lysates और अलग थे पश्चिमी blottings के लिए आवेदन. पश्चिमी सोख्ता के लिए UCP1 प्रतिरक्षी (Abcam) इस्तेमाल किया गया था.
| जीन | जाति | फॉरवर्ड प्राइमर | प्राइमर रिवर्स |
| Fabp4 | माउस | ACACCGAGATTTCCTTCAAACTG | CCATCTAGGGTTATGATGCTCTTCA |
| Cidea | माउस | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT |
| TBP | माउस | ACCCTTCACCAATGACTCCTATG | TGACTGCAGCAAATCGCTTGG |
| Ucp1 | माउस | CACCTTCCCGCTGGACACT | CCCTAGGACACCTTTATACCTAATGG |
तालिका 1. प्राइमर वास्तविक समय qPCR विश्लेषण के लिए दृश्यों.
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Discussion
यहाँ हम चूहों में प्राथमिक सुसंस्कृत adipocytes में beige / brite कोशिकाओं के विकास का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय सेलुलर प्रणाली मौजूद है. के रूप में कई उपलब्ध अमर सेल लाइनों की तुलना में, इस प्रणाली vivo में सफेद वसा के भूरे बढ़ाया प्रासंगिकता की पेशकश की संभावना है.
हालांकि इन प्राथमिक adipocytes के अध्ययन में कुछ लाभ प्रदान करता है, वहाँ भी कुछ सीमाओं और चिंताओं पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैं मौजूद हैं. सबसे पहले, इस प्रणाली अत्यधिक कोशिकाओं के भेदभाव शक्ति पर निर्भर है. भूरा वसा ऐसे Ucp1 और Cidea के रूप में चयनात्मक जीनों की अभिव्यक्ति के लिए विशेष रूप से भेदभाव पर निर्भर कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, PPARγ agonists और BMP7 भी वसाजनन बढ़ाने के लिए, इसलिए, "भूरे" प्रभाव काफी भेदभाव के समान डिग्री के साथ कोशिकाओं में पहुँचा जा है. वैकल्पिक रूप से, के रूप में आंकड़े -1 डी और ई में दिखाया गया है, भूरे रंग की वसा चयनात्मक अभिव्यक्ति सामान्यFabp4 के रूप में वसाजनन मार्कर जीन के साथ जीन उपयोगी हो सकता है. दूसरा, चूहों की उम्र के लिए महत्वपूर्ण है. यह शायद बड़े चूहों का उपयोग क्रम में संभव के रूप में के रूप में कई कोशिकाओं के लिए आकर्षक हो सकता है, लेकिन उम्र के साथ भेदभाव में गिरावट के रूप में. यह जांच करने के लिए कैसे ठंड जोखिम, मोटापा, इंसुलिन प्रतिरोध या उम्र बढ़ने के रूप में इस तरह के आंतरिक और बाह्य cues इस संस्कृति प्रणाली का उपयोग करते हुए इस सेल प्रकार के प्रसार, आत्म नवीकरण या भेदभाव की क्षमता को प्रभावित करता है के लिए दिलचस्प होगा. हमारे मामले में, प्रकार C57BL/6J के चूहों के उपयुक्त उम्र 6-8 सप्ताह के बीच है. तीसरा, प्राथमिक कोशिकाओं सामान्य रूप में और अधिक संवेदनशील और अमर adipocyte लाइनों की तुलना में कमजोर है. हालांकि बैट या चमड़े के नीचे WAT से preadipocytes प्रसार और आंत WAT से उन लोगों की तुलना में भेदभाव की बेहतर क्षमता है, वे कई मार्ग के बाद उनकी भिन्नता की क्षमता खो देते हैं. हम आम तौर पर 3 मार्ग की एक अधिकतम के भीतर भेदभाव प्रेरित.
एक अन्य महत्वपूर्णउग्रवादी पहलू पर विचार करना है कि stromal संवहनी अंश एक विषम सेल की आबादी है. इस प्रोटोकॉल में हम preadipocytes और उनके एक भूरे वसा चयनात्मक एक PPARγ agonist rosiglitazone की उपस्थिति में आनुवंशिक प्रोग्राम चालू करने की क्षमता पर ध्यान केंद्रित. हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि PDGFRa पॉजिटिव उदर WAT में द्वि - शक्तिशाली progenitors vivo में 17 बीटा एड्रीनर्जिक उत्तेजना के जवाब में भूरे रंग adipocytes को जन्म देता है. हालांकि, beige / brite कोशिकाओं है कि पुरानी PPARγ agonist उपचार करने के लिए जवाब में उभरने की वास्तविक मूल अस्पष्ट बनी हुई है. बहस सक्रिय कर दिया गया है और शोधकर्ताओं ने इस मौलिक प्रश्न के साथ व्यस्त हैं, बढ़ाया सफेद करने के लिए भूरे रंग वसा रूपांतरण के माध्यम से सफेद वसा के प्रतिबद्ध भूरे रंग preadipocytes के प्रसार के माध्यम से या परिपक्व सफेद 18,19 adipocytes से transdifferentiation के माध्यम से, तमंचा है.
Rosiglitazone इन विट्रो में सफेद वसा के भूरे प्रेरित ज्ञात किया गया है 20-26 vivo में. दिलचस्प है, PPARγ के सिंथेटिक agonists द्वारा सक्रियण सफेद वसा के भूरे प्रेरित, तथापि, सफेद adipocytes में PPARγ की overexpression के लिए पर्याप्त नहीं है 27. हम पहले से पता चला है कि PPARγ agonist प्रेरित भूरे प्रभाव भाग में 16 PRDM16 के प्रोटीन स्थिरीकरण के माध्यम से मध्यस्थता है. इसलिए, छोटे या यौगिकों endogeneous अणुओं कि PRDM16 प्रोटीन को स्थिर करने की पहचान के लिए विशेष रूप से सफेद वसा के भूरे उत्पन्न करने में सक्षम हो सकता है. वर्तमान विधि एक मजबूत और विश्वसनीय प्रयोगात्मक जैसे कारकों, जो मोटापा और मधुमेह के इलाज के लिए एक उपन्यास चिकित्सकीय हस्तक्षेप करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की पहचान प्रणाली प्रदान करता है.
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Disclosures
लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
हम चर्चा, तकनीकी सहायता और पांडुलिपि पर संपादकीय सहायता के लिए Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, लुई तीव्र, ईएमआई Tomoda, और लॉरेन Ruiz धन्यवाद. इस काम में कोपेनहेगन और यूरोपीय संघ के FP7 परियोजना DIABAT (स्वास्थ्य F2 के विश्वविद्यालय से एक शेयर पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था (DK087853) NIH निर्णायक बायोमेडिकल और Asubio फार्म इंक से अनुसंधान के लिए कार्यक्रम से SKULA से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया Lise Madsen और कर्स्टन Kristiansen) -2,011-278,373. हम भी DERC केंद्र अनुदान (P30 DK063720 एनआईएच) को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
References
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