Summary
Primarie preadipociti bianchi isolati dal tessuto adiposo bianco nei topi possono essere differenziate in cellule del beige / brite. Presentato qui è un sistema affidabile modello cellulare per studiare la regolazione molecolare della "doratura" di grasso bianco.
Abstract
Adipociti bruni hanno la capacità di disaccoppiare la catena respiratoria nei mitocondri e dissipare l'energia chimica sotto forma di calore. Sviluppo di adipociti bruni UCP1-positive nei tessuti adiposi bianchi (cosiddetta cellule beige o brite) è altamente indotta da una varietà di stimoli ambientali come esposizione cronica freddo o da agonisti PPARy, quindi, questo tipo di cella ha un potenziale come un obiettivo terapeutico trattamento dell'obesità. Sebbene la maggior parte delle linee degli adipociti immortalizzate non può ricapitolare il processo di "doratura" di grasso bianco nella cultura, adipociti primari isolati da stromale frazione vascolare nel tessuto sottocutaneo adiposo bianco (WAT) forniscono un sistema affidabile cellulare per studiare il controllo molecolare di beige / brite lo sviluppo delle cellule . Qui si descrive un protocollo per l'isolamento efficace preadipociti primarie e per indurre la differenziazione di cellule beige / brite in coltura. L'effetto di doratura può essere valutata mediante l'espressione di grasso bruno-selettivo marchioERS come UCP1.
Introduction
L'obesità è in aumento in tutto il mondo in modo drammatico ed è ora considerato una delle preoccupazioni più gravi per la salute pubblica 1. Questa condizione si riferisce ad un squilibrio in relazione al consumo di energia spesa e risultati in eccesso di energia memorizzata come lipidi nel tessuto adiposo bianco (WAT). WAT allargata è associata con un aumento di massa corporea e il peso, mentre il tessuto adiposo bruno ha la capacità di dissipare l'energia in eccesso per produrre calore. Quindi BAT può funzionare sia come protezione contro freddo e l'obesità 2,3. Questo si ottiene disaccoppiamento del trasporto di elettroni nei mitocondri di disaccoppiamento della proteina 1 (UCP1). Questa proteina è considerato un marchio di garanzia per nonshivering termogenesi nel BAT 3. Diversi studi negli ultimi anni hanno rivelato che gli esseri umani adulti hanno 4-8 BAT funzionale e, di conseguenza, la manipolazione delle BAT negli esseri umani può essere un possibile intervento terapeutico nella lotta contro l'obesità e le malattie correlate.
jove_content "prove> corrente indica che due tipi di adipociti bruni esistono in roditori," classico "o" pre-esistente "grasso bruno si sviluppa durante la fase prenatale e forma dedicati depositi adiposi marroni in regione interscapolare e di altri tessuti periferici D'altra parte. , una forma "inducibile" di grasso bruno (così chiamate cellule brite o beige) si sviluppa durante la fase post-natale e appare intervallati nel tessuto adiposo bianco. I due tipi di adipociti bruni sono separati da diverse origini dello sviluppo. Mentre il pre-esistente adipociti bruni derivano da myoblastsic-come Myf5 precursori, i brite / beige cellule inducibili intervallati in WAT nascono da una non-Myf5 lignaggio 9,10. Inoltre, percorsi di regolamentazione di questo tipo di cellule è probabile che sia diverso da quello Myf5 derivato marrone adipociti 11. Lo sviluppo delle cellule beige (cioè "doratura" di grasso bianco) può essere attivato in risposta a esposizione cronica a freddo eβ3-adrenergici agonisti o agonisti PPARy negli adulti 12-14. Le cellule beige / brite sono suscettibili di essere un bersaglio terapeutico promettente per la manipolazione di bilancio energetico complessivo e può potenzialmente diventare parte del trattamento dell'obesità, di conseguenza, è importante capire precisi meccanismi molecolari e vie di segnalazione da stimoli ambientali che controllano lo sviluppo del beige cellule.Per comprendere il controllo molecolare della doratura di grasso bianco, esperimenti in vitro sono più adatti come differenziazione dei preadipociti avviene piuttosto asincrono ed è difficile rilevare le cellule in situ 15. Sebbene studi sullo sviluppo adipociti sono state finora eseguite principalmente su linee cellulari quali 3T3-L1, 3T3-F442A o HIB1, queste linee cellulari sembrano non firma molecolare delle cellule beige. D'altra parte, adipociti primari isolati da sottocutaneo WAT hanno più probabilità di ricapitolare i process di doratura di grasso bianco in modo cellula autonoma. Qui forniamo un protocollo per un efficace isolamento della frazione stromale-vascolare da tessuti adiposi e per indurre l'imbrunimento del grasso bianco in risposta ad agonisti PPARy. Rosiglitazone ha dimostrato di essere un mediatore particolarmente efficace di doratura in queste cellule. Come suggerito in precedenza 16, questo sistema cellulare può essere utilizzato per servire un sistema cellulare affidabile per studiare lo sviluppo delle cellule beige / brite.
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Protocol
1. Preparare Medio Digestione
Fare 5 ml per 5 topi per tessuti (circa 1 ml / 1 tessuto adiposo g).
- Pesare in enzimi digestivi:
- Collaginase D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223)
- Dispasi II: 2.4 U / ml (04942078001, 0980 mg / lyo, Roche, 11466200) - Aggiungere 25 ml di PBS e mescolare bene per sciogliere
- Aggiungere CaCl 2 appena prima digestione del tessuto ad una concentrazione finale di 10 mM
2. Dissect tessuto adiposo di topi
- Dissezione deve essere eseguito con cura, e subito dopo i topi (6-8 settimane) vengono sacrificati. Lavora con etanolo sterile spruzzato sulla pelliccia del mouse prima di aprirlo. Posizionare il tessuto direttamente in PBS pulito, separato BAT interscapolare e sottocutaneo inguinale WAT.
- Per BAT interscapolare: hanno il mouse posizionato con il dorso affrontato, sezionato lungo la schiena e fino al collo. Il marronetessuto adiposo si trova proprio sotto la pelle tra le spalle (interscapolare). BAT può essere visto come due lobi, a forma di farfalla. Un sottile strato di grasso bianco che copre il BAT dovrebbe essere accuratamente rimosso.
- Per via sottocutanea WAT (inguinale WAT): rimuovere la pelle. Inguinale WAT è situato direttamente sotto la pelle su entrambi i lati, a partire quasi sulla schiena e costeggiando, all'interno delle cosce e in basso, verso il testicolo.
3. Tagliare e Digest tessuto adiposo
- Rimuovere rapidamente ogni contaminazione, come i capelli, muscolo scheletrico e tessuto connettivo dalle sezioni di tessuto.
- Asciugare su carta velina in fretta per non diluire media dissezione con PBS e metterlo su un piatto asciutto.
- Aggiungere mezzo digestione (aggiunto CaCl 2 prima della digestione) e tritare il tessuto in piccoli pezzi. Mescolare bene pipettando su e giù con una pipetta da 5 ml. Trasferire i tessuti tritati in provette da 50 ml con il resto del m digestioneedio, mescolare ancora di più pipettando su e giù.
- Digest in 37 ° C con agitazione costante a 150 rpm per 40-50 min. Controllare ogni 10-15 minuti per assicurarsi che la digestione sta andando bene e per evitare sovra-digestione.
Nota: media la digestione e l'ora corrette sono importanti. Il tessuto deve essere ben digerita, ma digestione eccesso può danneggiare le cellule.
4. Sospensione cellulare Filtro
- Arrestare digestione aggiungendo 5 ml mezzo completo (DMEM/F12 FPS contenenti 10% e P / S). Le cellule dovrebbero essere quasi del tutto omogeneo. Mescolare bene pipettando.
- Centrifugare a 700 xg per 10 min.
- SVF ora può essere visto come una pastiglia brunastro sul fondo della provetta. Aspirare il adipociti maturi strato oleoso sulla parte superiore e maggior parte dello strato liquido - mantenere il pellet e farla sciogliere in 10 ml di mezzo completo. Mescolare bene.
- Mettere un filtro cella (50-70 micron di diametro) in un nuovo 50 ml tubo e filtrare la sospensione cellulare.
5. Piatto Celle
- Trasferire sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare a 700 xg per 10 min.
- Aspirare il terreno e risospendere pellet in 10 ml di terreno completo. Pipetta e mescolare bene.
- Stimare il numero di piatti necessari. Questo può variare e dipende dalla dimensione pellet. Una regola generale è 2 di 10 piatti cm da 5 topi per inguinale WAT e uno da 10 cm per piatto BAT.
- Celle a piastre sui piatti rivestiti di collagene (R & S) in mezzo completo
- 1-2 ore dopo la placcatura le cellule, medie aspirato, lavare due volte con PBS e aggiungere mezzo fresco. Questo passaggio è importante in quanto questo può rimuovere i globuli rossi, le cellule del sistema immunitario e altri contaminanti.
6. Differenziare le cellule
- Fare manutenzione e mezzi induzione.
Manutenzione medie
Completo di supporto con l'aggiunta di:
ent "> Insulin, conc finale. 5 ug / ml (5 mg / ml magazzino, *** 100 ml di acido acetico in 10 ml di H 2 O per preparare pH acqua acidificata 2,5. dissolvono insulina in acqua acidificata. Conservare a magazzino -20 ° C)3,3 ',5-triiodo-L-tironina (T3), conc finale. 1 nM (stock 10 mM, *** sciogliere T3 in 1N NaOH e aggiungere mezzo per rendere stock 10 mM. Sigma cat # T-2877)
Conservare a 4 ° C, buona per una settimana
Induzione media
Manutenzione mezzo contenente i seguenti composti:
Indometacina, conc finale. 125 micron (0,125 magazzino M in etanolo, cat Sigma # I-7378). Indometacina deve essere riscaldata a 60 ° C da sciogliere.
Desametasone, conc finale. 2 ug / ml (2 mg / ml in etanolo calzino, Sigma cat # D-1756)
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), conc finale. 0.5 mM (0,25 magazzino M in DMSO, Sigma cat # I-5879)
Rosiglitazone, finale conc. 0,5 micron(Stock 10 mM in DMSO, Sigma cat # R-2408)
Nota: Assicurarsi di induzione fresco medio di volta in volta.
- Crescere adipociti primari al 95-97% confluenza in mezzo completo (confluenti ma non troppo imballato)
- Cambiare regolarmente terreno completo con induzione a media (giorno 0)
- Dopo 48 ore (giorno 2), cambiare medio e medio di mantenimento con rosiglitazone (0,5 micron)
- Dopo ulteriori 48 ore (giorno 4), cambiare terreno di mantenimento fresco con rosiglitazone (1 mM) per altri 2-3 giorni. 6-7 giorni dopo l'aggiunta del mezzo di induzione, le cellule sono completamente differenziate a maturare cellule di grasso e sono riempite con goccioline di olio. Goccioline apparirà intorno 3-4 giorni dopo l'induzione.
Nota: medio cambio ogni 2-3 giorni fino a quando le cellule sono completamente differenziate.
Le cellule possono essere raccolte e l'espressione di mRNA di Ucp1 e Other adipocita bruno-specifici geni può essere misurata mediante RT-PCR. Western blot sarà utilizzato per rilevare le proteine.
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Representative Results
Browning di adipociti primari può accedere misurando l'espressione di mRNA di Ucp1 e altri geni grasso bruno-specifici o selettivi per RT-PCR. Presentato in figura 1 è dati di espressione genica in inguinali WAT-derivati adipociti primari. Le cellule sono state indotte a differenziarsi in presenza di due diverse dosi di rosiglitazone a 50 nm e 500 nm, rispettivamente. Un sottoinsieme di cellule è stato trattato con forskolin a 10 pM per 4 ore prima della raccolta. Ciò provocherà-AMP ciclico (cAMP) nelle cellule e attivare programma termogenica gene compresa Ucp1 espressione.
Come mostrato in Figura 1A, rosiglitazone robustamente indotto Ucp1 mRNA. Forskolin trattamento (cAMP) ulteriormente aumentato il rosiglitazone indotta espressione UCP1. Un'altra grasso bruno-selettiva gene, espressione Cidea anche robustamente indotta da rosiglitazone in una maniera dose-dipendente (Figura 1B). <em> Fabp4 è un obiettivo diretto di PPAR e un marcatore adipogenico sia per il grasso bruno e grasso bianco. Come mostrato nella Figura 1C, Fabp4 espressione era aumentata anche quando trattati con rosiglitazone. Questo effetto imbrunimento non era semplicemente dovuta ad un aumento della adipogenesi per sé, poiché l'induzione di espressione e Ucp1 Cidea era ancora significativa anche se i livelli di mRNA di Ucp1 e Cidea stati normalizzati a quelli di Fabp4 (Figure 1D e E).
Per confermare il livello di proteina aumentato UCP1, Western blot dovrebbe essere eseguita. Come illustrato nella figura 2, una dose elevata di rosiglitazone (500 nM) robustamente aumentata UCP1 proteine nelle cellule. Soprattutto, come precedentemente illustrato in Ohno et al. 16, rosiglitazone-inducibile cellule beige mostrato elevata consumo totale di ossigeno e disaccoppiati in risposta alla stimolazione cAMP, un Important caratteristiche funzionali di adipociti bruni cellule / beige.
Figura 1. Quantitativa PCR in tempo reale (RT-PCR) che mostra l'induzione di grasso bruno-selettivi geni incluse Ucp1 (A) e Cidea (B). Espressione di un marcatore Fabp4 adipogenico è anche mostrato (C). Dove indicato, le cellule sono state trattate con cAMP (forskolin a 10 mM) per quattro ore prima della raccolta. RNA totale è stato estratto dalle cellule differenziate utilizzando Trizol (Invitrogen). La trascrizione inversa è stata eseguita usando un kit cDNA trascrizione inversa (iScript, Applied Biosystems) e RT-PCR è stata eseguita in duplicati con colorante fluorescente verde SYBR utilizzando una macchina ABI ViiA7. TATA-binding protein (TBP) funzionato come gene di riferimento e le sequenze dei primer sono forniti nella tabella 1. Rosiglitazone ha indotto il marrone-selectgeni ive UCP1 (D) e Cidea (E) dopo la normalizzazione di un gene marcatore adipogenico Fabp4.
Figura 2. Western blot di UCP1 livelli di proteina in cellule primarie inguinali trattati con rosiglitazone alla dose di 50 nM e 500 nm. Lisati cellulari totali sono stati isolati e applicato per blottings occidentali. UCP1 anticorpo (Abcam) è stato utilizzato per Western blotting.
| Gene | Specie | Primer forward | Primer reverse |
| Fabp4 | mouse | ACACCGAGATTTCCTTCAAACTG | CCATCTAGGGTTATGATGCTCTTCA |
| Cidea | mouse | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT |
| TBP | mouse | ACCCTTCACCAATGACTCCTATG | TGACTGCAGCAAATCGCTTGG |
| Ucp1 | mouse | CACCTTCCCGCTGGACACT | CCCTAGGACACCTTTATACCTAATGG |
Tabella 1. Sequenze di primer per l'analisi qPCR tempo reale.
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Discussion
Qui vi presentiamo un sistema affidabile cellulare per studiare lo sviluppo di cellule beige / brite in colture primarie adipociti nei topi. Rispetto a diverse linee cellulari immortalizzate disponibili, questo sistema è suscettibile di offrire maggiore rilevanza alla doratura di grasso bianco in vivo.
Anche se lo studio di questi adipociti primari offre alcuni vantaggi, esistono anche alcune limitazioni e preoccupazioni che sono importanti da considerare. Primo, questo sistema è altamente dipendente dalla potenza differenziazione delle cellule. L'espressione di grasso bruno-selettivi geni come Ucp1 e Cidea sono particolarmente differenziazione-dipendente. Per esempio, agonisti e PPARy BMP7 anche migliorare adipogenesi, pertanto, i "Browning" effetti devono essere abbastanza accessibile in cellule con simili gradi di differenziazione. In alternativa, come mostrato in Figure 1D e E, normalizzando l'espressione di grasso bruno-selettivageni con quella dei geni marcatori adipogenesi come Fabp4 può essere utile. Secondo, l'età dei topi è importante. Si potrebbe forse essere tentati di utilizzare topi di grandi dimensioni al fine di ottenere cellule il maggior numero possibile, ma come differenziazione diminuisce con l'età. Sarebbe interessante esaminare come stimoli interni ed esterni, come l'esposizione al freddo, l'obesità, insulino-resistenza o l'invecchiamento colpisce la capacità di proliferazione, self-renewal e differenziazione di questo tipo di cellule utilizzando questo sistema di coltura. Nel nostro caso, l'età appropriata di topi di tipo C57BL/6J è tra 6-8 settimane. In terzo luogo, le cellule primarie sono in generale più sensibile e più fragile di quanto immortalato linee degli adipociti. Sebbene preadipocytes da BAT o sottocutanea WAT hanno una migliore capacità di proliferazione e differenziazione di quelli viscerale WAT, tendono a perdere la loro capacità di differenziazione dopo diversi passaggi. Di solito indurre la differenziazione entro un massimo di 3 passaggi.
Un altro imporaspetto importante da considerare è che il stromale-vascolare frazione è una popolazione cellulare eterogenea. In questo protocollo ampia preadipocytes e la loro capacità di attivare un grasso bruno-selettiva programma genetico in presenza di un agonista PPAR rosiglitazone. Un recente studio ha dimostrato che PDGFRA-positivi bi-potenti progenitori nel WAT addominale dà origine a adipociti bruni in risposta alla stimolazione beta-adrenergica in vivo 17. Tuttavia, la vera origine delle cellule beige / brite che emergono in risposta al trattamento cronico con agonisti PPAR rimane poco chiaro. Il dibattito è stato attivo e ricercatori sono preoccupati di questo problema fondamentale, si rosola di bianco grasso attraverso una maggiore bianco-marrone conversione grassi, attraverso la proliferazione delle impegnati preadipociti marroni o attraverso transdifferenziazione da adipociti bianchi maturi 18,19.
Rosiglitazone è stato conosciuto per indurre la doratura di grasso bianco in vitro 20-26 e in vivo. È interessante notare che l'attivazione del PPAR da agonisti sintetici possono indurre l'imbrunimento del grasso bianco, tuttavia, la sovraespressione di PPARy in adipociti bianchi non è sufficiente 27. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'agonista PPAR-indotta effetto doratura è mediato in parte attraverso la stabilizzazione proteica di PRDM16 16. Quindi, identificando piccoli composti o molecole endogene che stabilizzano PRDM16 proteina può essere in grado di indurre specificamente l'imbrunimento del grasso bianco. Attuale metodo fornisce un sistema robusto ed affidabile sperimentale per identificare tali fattori, che possono portare ad un intervento terapeutico per il trattamento di obesità e diabete.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, e Lauren Ruiz per la discussione, assistenza tecnica e assistenza editoriale sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del NIH (DK087853), dal Programma per la Ricerca Biomedica e dal Breakthrough Asubio Pharm Inc. per SKULA stato sostenuto da una SHARE borse di dottorato di ricerca presso l'Università di Copenhagen e l'Unione europea del 7 ° PQ progetto Diabat (HEALTH-F2 -2.011-278373) di Lise Madsen e Karsten Kristiansen. Riconosciamo inoltre il centro DERC sovvenzione (NIH DK063720 P30).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
References
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