Summary
マウスにおける白色脂肪組織から単離された脂肪細胞は、一次白ベージュ/ブライト細胞に分化させることができる。白色脂肪の "焦げ目"の分子調節を研究するために信頼性の高い細胞モデルシステムは、ここに提示されます。
Abstract
褐色脂肪細胞は、ミトコンドリアの呼吸鎖を切り離すと熱などの化学的エネルギーを放散する能力を持っています。白色脂肪組織中のUCP1陽性褐色脂肪細胞（いわゆるベージュまたはBRITE細胞と呼ばれる）の開発が強く、したがって、そのような慢性の寒冷暴露などの環境合図の様々な方法によって、またはPPARγアゴニストにより誘導され、この細胞型は、治療標的としての可能性を秘めている肥満治療。最も不死脂肪線は文化の中で白色脂肪の "褐色化"の過程を再現することはできませんが、皮下の白色脂肪組織における間質血管画分（WAT）から単離された主要な脂肪細胞はBRITE /ベージュ細胞分化の分子制御を研究するために信頼性の高い携帯電話システムを提供。ここでは、主要な脂肪細胞を効果的に分離するための、文化の中でブライトベージュ/細胞への分化を誘導するためのプロトコルを記述します。褐変効果は褐色脂肪選択的マークの発現によって評価することができるそのようなUCP1としてERS。
Introduction
肥満が劇的に世界的に増加しており、今では公衆衛生1に最も深刻な懸念の一つと考えられている。この条件は、支出にエネルギー摂取量の相対でmisbalanceと白色脂肪組織（WAT）における脂質として格納されている余分なエネルギーの結果に関連しています。褐色脂肪組織は熱を生成するために余分なエネルギーを放散する能力を持っていながら、拡大されたWATは、増加した体重と体重に関連付けられています。したがって、BATは、寒さと肥満2,3の両方に対する保護として機能することができます。これは、タンパク質1（UCP1）を脱共役することによってミトコンドリアにおける電子伝達の脱共役することによって達成される。このタンパク質は、BAT 3で熱発生をnonshiveringための顕著な特徴と考えられている。近年のいくつかの研究では、成人の人間が機能BAT 4-8を持っていることを明らかにし、その結果、ヒトにおけるBATの操作は、肥満とそれに関連する疾患との闘いにおいて、潜在的な治療介入することができます。
jove_contentは ">現在の証拠は褐色脂肪細胞の2種類がげっ歯類に存在することを示し、"古典的な "または"既存の "褐色脂肪は、出生前の段階で開発し、肩甲間部やその他の末梢組織における専用の褐色脂肪デポを形成している一方。 、褐色脂肪（いわゆるブライトやベージュ細胞と呼ばれる）の "誘導"フォームは、出生後の段階で開発し、白色脂肪組織中に散在して表示されます。褐色脂肪細胞の2つのタイプは、異なる発達の起源で区切られています。既存ながら褐色脂肪細胞はmyoblastsicライクMyf5前駆体から生じる、WATに点在誘導BRITE /ベージュ細胞は非Myf5系統9,10から生じる。さらに、この細胞型の調節経路はMyf5由来の茶色とは異なる可能性が高い脂肪11。ベージュ細胞（白色脂肪のすなわち "褐変"）の開発が慢性寒冷暴露へとに応答して活性化することができますβ3-アドレナリン受容体アゴニスト、大人の12月14日でのPPARγアゴニスト。ベージュ/ BRITE細胞は全体のエネルギーバランスを操作するための有望な治療標的となる可能性がある、潜在的肥満治療の一部になることができますので、環境への手がかりはベージュの開発を制御する正確な分子機構とシグナル伝達経路を理解することが重要です細胞。前駆脂肪細胞の分化ではなく非同期に行われ、それがその場で 15 で細胞を検出することは困難であるとして、白色脂肪の褐変の分子制御を理解するために、in vitroの実験で最も適している。脂肪細胞の開発に関する研究はこれまでそのような、3T3-L1、3T3-F442AまたはHIB1などの細胞株では、主に行われてきたが、これらの細胞株はベージュ細胞の分子署名を欠いているように見える。一方、皮下WATから分離された主要な脂肪細胞はプロセッを再現する可能性が最も高い細胞自律的に白色脂肪の褐変のだ。ここでは、脂肪組織から間質血管画分の効果的な分離のためとPPARγアゴニストに応答して、白色脂肪の褐変を誘導するためのプロトコルを提供する。ロシグリタゾンは、これらの細胞における褐変の特に有効なメディエーターであることが示されている。以前に16を示唆したように、この細胞系は、ベージュ/ブライト細胞の発達を研究するために信頼性の高い携帯電話システムを提供するために使用することができます。
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Protocol
1。消化培地を調製
組織当たり5匹（約1ml / 1グラムの脂肪組織）ごとに5ミリリットルを加えます。
- 消化酵素で重量を量る：
- Collaginase D：1.5 U / mlの（1108874103、1グラム、ロシュ、70334223）
- ディスパーゼⅡ：2.4 U / mlの（04942078001、0980ミリグラム/ LYO、ロシュ、11466200） - 25ミリリットルのPBSを加え、溶解させるためによく混ぜる
- 10mMの最終濃度で組織の消化直前にCaCl 2を追加
2。マウスから脂肪組織を解剖
- 切開は慎重に行うべきであり、すぐにマウスの後（6-8週齢）に屠殺されています。それを開く前に、マウスの毛皮の上に噴霧し、エタノールで滅菌作業。クリーン、PBS、別甲骨間BATおよび皮下鼠径WATで直接組織を置きます。
- 肩甲骨間BATの場合：最大直面背にして配置されたマウスを持って、背中や首へのすべての道に沿って切り開く。茶色脂肪組織は右肩（肩甲骨間）の間の皮膚の下に見つけることができます。 BATは2葉、蝶の形として見ることができます。 BATをカバーする白色脂肪の薄い層を注意深く除去する必要があります。
- 皮下WAT（鼠径WAT）の場合：皮膚を取り除きます。鼠径WATは睾丸に向かって太ももと下の内側、ほぼ背面に始まると一緒に行く、両側の皮膚の直下にあります。
3。脂肪組織を切り取ってダイジェスト
- 素早く髪、骨格筋および組織切片から結合組織のように、すべての汚染物質を除去。
- PBSで切開培地を希釈し、乾板の上に置いたりしないように紙の上で素早く乾いたティッシュ。
- 消化液（消化前にCaCl 2を添加した）と小さな断片に組織をミンチを追加します。 5 mlのピペットでピペッティングによって非常によく混ぜる。消化メートルの残りの部分との50mlチューブでミンチ組織を移すediumは、上下にピペッティングして、さらに混ぜる。
- ダイジェスト37℃·40から50分間150rpmで一定に撹拌しながら。消化がうまくいっていることを確認するとオーバー消化を防止するために15分間隔でチェックします。
注：正しい消化媒体と時間が重要である。組織は、消化をよくする必要がありますが、過剰消化が細胞を損傷することができる。
4。フィルタ細胞懸濁液
- 5ミリリットル完全培地（DMEM/F12含む10％のFPSとP / S）を添加することによって消化を停止します。細胞がほぼ完全に均一である必要があります。ピペッティングでよく混ぜる。
- 10分間、700×gで遠心分離します。
- SVFは今やチューブの底に茶色がかったペレットとして見ることができます。トップと液体層の最も上に油性の成熟脂肪細胞層を吸引 - ペレットを維持し、10mlの完全培地中でそれを溶かす。よく混ぜる。
- 新しい50の上にセルストレーナー（50〜70μmの直径）を配置 mlチューブに細胞懸濁液をろ過する。
5。細胞をプレート
- 10分間、700×gで15 mlのチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を移す。
- 10mlの完全培地で培地を吸引除去し、再懸濁ペレット。ピペット、よく混ぜる。
- 必要とされているどのように多くのプレートを見積もる。これはこれとは異なり、ペレットの大きさに依存するかもしれません。一般的なルールは、鼠径WATのために5匹とBATのための1 10cmプレートから10cmプレートの2です。
- 完全培地中でコラーゲンコートディッシュ（R＆D）に細胞をプレート
- 1-2時間細胞、培地を吸引めっき後、PBSで2回洗浄し、新鮮な培地を追加します。これは赤血球、免疫細胞やその他の汚染物質を除去することができるため、この手順は重要です。
6。細胞を分化
- 保守と誘導媒体を作る。
維持培地
付加した培地を完了して下さい：
ENT ">インスリン、最終濃度5μg/ mlの（5 mg / mlストック、酸性化した水のpHが2.5を準備するために10 mlのH 2 O中の酢酸***100μlの。酸性水でインスリンを溶かす。店舗在庫で-20℃）3,3 '、5 - トリヨード-L-チロニン（T3）は、最終濃度。 1nMの（10μMストック、***は1N NaOHに溶解し、T3は10μMストックを作るために媒体を追加します。シグマ猫＃T-2877）
4℃で保存、一週間のために良い
誘導培地
以下の化合物を含む維持培地：
インドメタシン、最終濃度。 125μMの（エタノール中の0.125 Mのストック、シグマの猫＃I-7378）。インドメタシンを60℃に加熱しなければならない°C溶解させる。
デキサメタゾン、最終濃度。 2μg/ mlの（エタノール中の2 mg / mlの靴下、シグマ猫＃D-1756）
3 - イソブチル-1 - メチルキサンチン（IBMX）、最終濃度。 0.5mMの（DMSO中0.25Mの株式、シグマ猫＃I-5879）
ロシグリタゾンは、最終濃度。 0.5μMで（DMSO中10mMストック、シグマ猫＃R-2408）
注：毎回新鮮な培地誘導を行います。
- 完全培地中で95から97パーセントのコンフルエンス（コンフルエントが、あまりにも梱包されていない）に一次脂肪細胞を成長させる
- 誘導培地（0日目）との定期的な完全培地を変更
- 48時間（2日目）の後、グリタゾン（0.5μM）で維持培地に培地を変更
- さらに48時間（4日目）の後に、さらに2〜3日間のロシグリタゾンと新鮮な維持培地（1μM）に変更します。 6-7日誘導培地を添加した後、細胞を完全に脂肪細胞を成熟させる差別化され、油滴で満たされている。液滴は、誘導後3-4日周囲に表示されます。
注：細胞は完全に分化されるまで2〜3日毎に培地を変更します。
細胞は、今では収穫し、UCP1とパーソナルプラグインのmRNA発現することができますrは褐色脂肪細胞特異的遺伝子は、qRT-PCRにより測定することができます。ウエスタンブロット法を用いて、タンパク質を検出するために使用されます。
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Representative Results
主要な脂肪細胞の褐変は、qRT-PCRによりmRNAのUCP1の発現と他の褐色脂肪特異的または選択的な遺伝子を測定することによってアクセスすることができます。 図1に示さ鼠径WAT-由来の初代脂肪細胞における遺伝子発現データです。細胞はそれぞれ、50nmおよび500nmにおけるロシグリタゾンの二つの異なる用量の存在下で分化するように誘導された。細胞のサブセットは、収穫前に4時間10μMでフォルスコリンで処理した。これは、細胞内サイクリックAMP（cAMPを）誘導し、UCP1発現を含む熱発遺伝子プログラムをアクティブにします。
図1Aに示すように、ロシグリタゾンは強壮UCP1 mRNA発現を誘導した。フォルスコリン治療（CAMP）はさらにロシ誘起UCP1の発現を増強。別の褐色脂肪選択的遺伝子、Cidea発現はまた、ロバスト用量依存的にロシグリタゾン（ 図1B）によって誘導された。 <em>のFABP4はPPARγと褐色脂肪と白色脂肪の両方の脂肪形成マーカーの直接のターゲットである。 図1Cに示すように、ロシグリタゾンで処理した場合、FABP4発現も増加した。 UCP1とCidea発現の誘導がまだUCP1とCideaのmRNAレベルはFABP4（ 図1DおよびE）のものに正規化した場合であっても有意であったので、この褐変効果は、 それ自体が脂肪細胞の増強に単にによるものではなかった。
UCP1の増加タンパク質レベルを確認するために、ウェスタンブロット法を実施すべきである。 図2に示すように、ロシグリタゾンの高用量（500 nM）を強壮に細胞内にUCP1タンパク質を増加させた。重要なのは、以前に大野ら 16に示すように、ロシグリタゾン誘導ベージュ細胞は、cAMP刺激に応答してimportaを高架合計と非結合酸素消費量を示した褐色脂肪細胞/ベージュ細胞のNT機能特性。
図1。 UCP1（A）とCidea（B）を含む褐色脂肪選択的遺伝子の誘導を示す定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）。脂肪分化マーカーFABP4の発現はまた、（C）が示されています。示される場合は、細胞を収穫前に4時間のcAMP（10μMのフォルスコリン）で処置した。総RNAをトリゾール（Invitrogen）を用いて、分化した細胞から抽出した。逆転写は、cDNAの逆転写キット（iScript、Applied Biosystems社）を用いて行ったと定量RT-PCRは、ABI ViiA7機を用いて、SYBRグリーン蛍光色素で重複して行った。 TATA結合参照遺伝子およびプライマー配列として機能するタンパク質（TBP）を表1に記載されています。ロシグリタゾンは茶色のセレクトを誘導アイブ遺伝子UCP1（D）および脂肪細胞のマーカー遺伝子FABP4によって正規化後Cidea（E）である 。
図2。は50nMまたは500nMの用量でロシグリタゾンで治療鼠径初代細胞におけるUCP1タンパク質レベルのウエスタンブロット。全細胞溶解物を単離し、西洋ブロッティングに適用した。 UCP1抗体（Abcam）は、ウエスタンブロット法のために使用された。
| 遺伝子 | 種 | フォワードプライマー | プライマーを逆 |
| FABP4 | マウス | ACACCGAGATTTCCTTCAAACTG | CCATCTAGGGTTATGATGCTCTTCA |
| Cidea | マウス | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT |
| TBP | マウス | ACCCTTCACCAATGACTCCTATG | TGACTGCAGCAAATCGCTTGG |
| UCP1 | マウス | CACCTTCCCGCTGGACACT | CCCTAGGACACCTTTATACCTAATGG |
表1。リアルタイム定量PCR解析用プライマー配列。
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Discussion
ここで我々は、マウスの初代培養脂肪細胞におけるベージュ/ブライト細胞の発達を研究するために信頼性の高い携帯電話システムを提案する。など、いくつかの利用可能な不死化細胞株と比較して、このシステムは、in vivoでの白色脂肪の褐変に強化された関連性を提供することがございます。
これらの主要な脂肪細胞の研究はいくつかの利点を提供していますが、も考慮する必要があるいくつかの制限との懸念が存在する。まず、このシステムは、細胞の分化能に大きく依存しています。そのようなUCP1とCideaとして褐色脂肪選択的遺伝子の発現は、特に分化に依存しています。例えば、PPARγアゴニストおよびBMP7も脂質生成を強化するため、 "褐変"効果はかなり分化の類似度を持つ細胞でアクセスする必要があります。あるいはまた、褐色脂肪選択性の発現を正常化、 図1DとEに示すように、そのようなFABP4として脂肪細胞のマーカー遺伝子のそれと遺伝子が役に立つかもしれません。第二に、マウスの年齢は重要である。それはおそらく可能な限りですが、加齢に伴って分化の下落と同じくらい多くの細胞を得るために大型のマウスを使用することは魅力的かもしれません。それはそのような寒冷暴露、肥満、インスリン抵抗性や高齢化など、内部と外部の手がかりは、この培養系を用いて、この細胞型の増殖、自己複製や分化能力にどのように影響するかを調べることは興味深いものになるだろう。我々のケースでは、型C57BL/6Jのマウスの適切な年齢は6〜8週間の間にある。第三に、初代培養細胞は、一般的には脂肪細胞の不死化ラインよりも高感度と、より壊れやすくなっています。 BATまたは皮下ワットから脂肪細胞は内臓WATからのものより増殖および分化の優れた能力を持っているが、それらはいくつかの通路の後にそれらの分化能を失う傾向にある。我々は通常、3継代の最大内分化を誘導する。
もう一つの重要考慮すべき重要局面は、間質血管画分は不均一な細胞集団であるということです。このプロトコルでは、前脂肪細胞およびPPARγアゴニストのロシグリタゾンの存在下で褐色脂肪選択的遺伝的プログラムをオンにする能力に焦点を当てる。最近の研究では、腹部のWATでPDGFRA陽性双方向強力な前駆細胞は 、in vivo 17 における β-アドレナリン作動性刺激に応答して、褐色脂肪細胞を生じさせることが示されている。しかし、慢性的なPPARγアゴニストの治療に反応して出てくるベージュ/ブライトセルの実際の起源は不明なままである。議論が活躍していると研究者は、この基本的な質問に終始され、強化された白から褐色脂肪変換を介して、コミットされた褐色脂肪細胞の増殖を介して、または成熟白色脂肪細胞から分化18,19を通して白色脂肪の褐変です。
ロシグリタゾンは 、in vitro で白色脂肪の褐変を誘発することが知られている生体 20〜26インチ興味深いことに、合成アゴニストによるPPARγの活性化は、白色脂肪の褐変を誘発することができるが、白色脂肪細胞におけるPPARγの過剰発現は27だけでは不十分です。我々は以前、PPARγアゴニスト誘導褐変効果がPRDM16 16のタンパク質の安定化を通じて部分的に媒介されることが示されている。したがって、PRDM16タンパク質を安定化させる小さな化合物または内因性の分子を同定することは特に白色脂肪の褐変を誘導することができるかもしれません。現在の方法は、肥満や糖尿病の治療のための新規治療的介入につながる可能性がありますこのような要因を識別するための堅牢で信頼性の高い実験系を提供しています。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は、原稿上の議論、技術的なヘルプと編集支援のための治大野耕作篠田ルイシャープ、恵美友田、とローレンルイズに感謝します。この作品は、コペンハーゲンとEU FP7プロジェクトDIABAT（健康F2の大学から博士号SHAREのフェローシップでサポートされていた画期的な生物医学研究のためのプログラムからとアスビオファーマ株式会社からSKULAには、NIH（DK087853）からの補助金によって支えられてリセマドセンとKarstenクリステンセンに-2011-278373）。またDERCセンター助成（NIH P30 DK063720）を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
References
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