Summary
Principais pré-adipócitos brancos isolados de tecidos adiposos brancos em ratos podem ser diferenciadas em células bege / brite. Apresentado aqui é um sistema modelo celular fiável para estudar a regulação molecular de "escurecimento" da gordura branca.
Abstract
Adipócitos marrons tem a capacidade de dissociar a cadeia respiratória nas mitocôndrias e dissipar a energia química na forma de calor. Desenvolvimento da UCP1-positivos adipócitos marrons em tecidos adiposos brancos (as chamadas células bege ou brite) é altamente induzida por uma variedade de estímulos ambientais, tais como a exposição ao frio ou crónica por agonistas PPARy, portanto, esse tipo de célula tem potencial como um alvo terapêutico para tratamento da obesidade. Embora a maioria das linhas de adipócitos imortalizados não pode recapitular o processo de "escurecimento" da gordura branca na cultura, os adipócitos primários isolados da fração vascular estromal no tecido adiposo subcutâneo branco (WAT) fornecer um sistema confiável celular para estudar o controle molecular de bege / brite desenvolvimento de células . Aqui descrevemos um protocolo para isolamento eficaz de pré-adipócitos primários e para a indução de diferenciação de células bege / brite em cultura. O efeito de escurecimento pode ser avaliada através da expressão de marca selectiva gordura marromers como UCP1.
Introduction
A obesidade é dramaticamente mundial de aumento e agora é considerado uma das preocupações mais graves para a saúde pública 1. Esta condição está relacionada a um desequilíbrio em relação a ingestão de energia a despesa e resulta em excesso de energia armazenada como lípidos em tecido adiposo branco (WAT). WAT alargada está associada com aumento da massa corporal e do peso, enquanto que o tecido adiposo castanho tem a capacidade de dissipar o excesso de energia para produção de calor. Daí BAT pode funcionar como proteção contra o frio e obesidade 2,3. Isto é conseguido através do desacoplamento de transporte de electrões das mitocôndrias pela proteína desacopladora 1 (UCP1). Esta proteína é considerado um marco para a termogênese sem BAT em 3. Vários estudos nos últimos anos revelou que os seres humanos adultos têm funcional BAT 4-8 e, consequentemente, a manipulação da BAT em seres humanos pode ser uma intervenção potencial terapêutico na batalha contra a obesidade e suas doenças relacionadas.
jove_content "> evidência corrente indica que os dois tipos de adipócitos marrons existir em roedores;" clássica "ou" pré-existente "gordura marrom se desenvolve durante a fase pré-natal e forma depósitos de gordura marrom dedicados na região interescapular e outros tecidos periféricos Por outro lado. , um "induzível" forma de gordura marrom (assim chamadas células brite ou bege) desenvolve durante a fase pós-natal e aparece intercalada nos tecidos adiposos brancos. Os dois tipos de adipócitos marrons também são separadas por diferentes origens desenvolvimentistas. Enquanto a pré-existente adipócitos marrons surgem myoblastsic-like Myf5 precursores, os indutíveis brite / bege células intercaladas em WAT surgir a partir de uma linhagem não Myf5 9,10. Além disso, as vias de regulação deste tipo de células é susceptível de ser diferente do marrom Myf5 derivado 11. adipócitos O desenvolvimento das células (isto é, bege "escurecimento" branco de gordura) pode ser activado em resposta à exposição ao frio e à crónicaβ3-adrenérgicos agonistas ou agonistas PPARy em adultos 12-14. As células bege / brite são susceptíveis de constituir um alvo terapêutico promissor para a manipulação do equilíbrio energético geral e pode potencialmente tornar-se parte do tratamento da obesidade, portanto, é importante compreender os mecanismos moleculares precisos e caminhos de sinalização através dos quais estímulos ambientais controlam o desenvolvimento de cor bege células.Para compreender o controlo molecular do escurecimento de gordura branca, em experiências in vitro são os mais adequados como diferenciação de pré-adipócitos em vez ocorre de forma assíncrona, e é difícil de detectar as células em 15 situ. Embora os estudos sobre o desenvolvimento dos adipócitos têm até agora sido realizada principalmente em linhas de células, tais como células 3T3-L1, 3T3-F442A ou HIB1, estas linhas celulares parecem não ter a assinatura molecular de células de bege. Por outro lado, os adipócitos primários isolados de WAT subcutânea são mais susceptíveis de recapitular o process do escurecimento da gordura branca em uma forma de célula autônoma. Aqui nós fornecemos um protocolo para o isolamento eficaz da fracção do estroma vascular a partir de tecido adiposo e para induzir o escurecimento da gordura branca em resposta a agonistas de PPARy. Rosiglitazona foi demonstrado ser um mediador especialmente eficaz de escurecimento nessas células. Tal como anteriormente sugerido 16, este sistema celular pode ser utilizada para servir um sistema fiável celular para estudar o desenvolvimento de células bege / brite.
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Protocol
1. Prepare Médio Digestão
Fazer 5 ml por 5 ratinhos por tecido (aproximadamente 1 ml / 1 g de tecido adiposo).
- Pesar em enzimas da digestão:
- D Collaginase: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223)
- Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0980 mg / lyo, Roche, 11466200) - Adicionar 25 ml de PBS e misturar bem para dissolver
- Adicionar CaCl 2 imediatamente antes da digestão do tecido com uma concentração final de 10 mM
2. Dissecar tecido adiposo de ratos
- Dissecção deve ser realizado com cuidado, e imediatamente após os ratinhos (6-8 semanas de idade) são sacrificados. Estéril trabalhar com etanol pulverizado sobre a pele do rato antes de abri-lo. Colocar o tecido diretamente no limpo PBS, BAT interescapular separado e inguinal subcutânea WAT.
- Para BAT interescapular: tem o mouse colocado com a parte traseira virada para cima, cortado ao longo das costas e todo o caminho até o pescoço. O marromtecido adiposo pode ser encontrado sob a pele entre os ombros (interescapular). MTD pode ser visto como dois lobos, em forma de borboleta. Uma fina camada de gordura branca que cobre o BAT devem ser cuidadosamente retirados.
- Para subcutânea WAT (inguinal WAT): remover a pele. Inguinal WAT é encontrada diretamente sob a pele de ambos os lados, começando quase na parte de trás e ir ao lado, no interior das coxas e para baixo em direção ao testículo.
3. Corte e digerir tecido adiposo
- Remover rapidamente toda a contaminação, como um músculo de cabelo, esquelética e do tecido conjuntivo das seções de tecido.
- Seque em papel tecido rapidamente para não diluir meio de dissecção com PBS e colocá-lo em uma placa seca.
- Adicionar meio de digestão (adicionado CaCl2 antes da digestão) e moer o tecido em pequenos pedaços. Misture muito bem por pipetagem cima e para baixo com uma pipeta de 5 ml. Transfira os tecidos picados em tubos de 50 ml, com o resto da digestão medium, misturar ainda mais pipetando para cima e para baixo.
- Digest de 37 ° C com agitação constante a 150 rpm durante 40-50 min. Verificar a cada 10-15 minutos para garantir que a digestão está indo bem e para evitar o excesso de digestão.
Nota: meio de digestão correta e tempo são importantes. O tecido deve ser bem digerida, mas em excesso pode prejudicar a digestão das células.
4. Suspensão celular filtro
- Parar a digestão através da adição de 5 ml de meio completo (DMEM/F12 contendo 10% de FPS e P / S). As células devem ser quase completamente homogêneo. Misturar bem por pipetagem.
- Centrifugar a 700 xg durante 10 min.
- SVF agora pode ser vista como um pellet acastanhado no fundo do tubo. Aspirar a camada oleosa adipócitos maduros na parte superior e a maior parte da camada de líquido - manter o sedimento e dissolver em 10 ml de meio completo. Misturar bem.
- Coloque um coador de células (50-70 um de diâmetro), durante um 50 novo ml tubo e filtrar a suspensão de células.
5. Células placa
- Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar a 700 xg durante 10 min.
- Aspirar médio e re-suspender o granulado em 10 ml de meio completo. Pipeta e misture bem.
- Estimar quantas placas forem necessárias. Isto pode variar e depende do tamanho da pastilha. A regra geral é de 2 placas de 10 cm de 5 camundongos para WAT inguinal e uma placa de 10 cm para a BAT.
- Células da placa de pratos revestidas de colágeno (P & D) em meio completo
- 1-2 horas depois do plaqueamento das células, o meio aspirado, lavar duas vezes com PBS e adicionar meio fresco. Esta etapa é importante, pois este pode remover as células vermelhas do sangue, células do sistema imunológico e de outros contaminantes.
6. Diferenciar Células
- Faça manutenção e meios de indução.
Meio de manutenção
Completar meio com acrescentou:
ent "> Insulina, conc final. 5 ng / ml (5 estoque mg / ml, *** 100 ul de ácido acético em 10 ml de H 2 O para preparar o pH da água acidificada 2.5. estoque da loja dissolver insulina na água acidificada. menos -20 ° C)3,3 ',5-triiodo-L-tironina (T3), concentração final. 1 nM (10 mM estoque, *** dissolver T3 em NaOH 1N e adicionar meio para fazer 10 ações pM. Sigma cat # T-2877)
Armazenar a 4 ° C, durante uma semana, bem
Meio de indução
Meio de manutenção contendo compostos que se seguem:
Indometacina, conc final. 125 ^ M (0,125 M em etanol estoque, Sigma cat # I-7378). A indometacina tem de ser aquecida a 60 ° C para se dissolver.
Conc dexametasona, final. 2 | ig / ml (2 mg / ml em etanol a peúga, Sigma cat # D-1756)
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), concentração final. 0,5 mM (0,25 M estoque em DMSO, Sigma cat # I-5879)
Rosiglitazona, final conc. 0,5 uM(10 mM em DMSO, Sigma cat # P-2408)
Nota: Certifique-indução fresca média de cada vez.
- Crescer adipócitos primários de 95-97% de confluência em meio completo (confluentes mas não demasiado embalado)
- Alterar médio completo regular com meio de indução (dia 0)
- Após 48 horas (dia 2), mude meio para meio de manutenção com rosiglitazona (0,5 uM)
- Após 48 h adicionais (dia 4), mudar para meio de manutenção fresco com rosiglitazona (1 uM) durante mais 2-3 dias. 6-7 dias após a adição do meio de indução, as células são totalmente diferenciados para amadurecer as células de gordura e são preenchidos com gotículas de óleo. Gotículas aparecerá em torno de 3-4 dias após a indução.
Nota: Mudança de meio cada 2-3 dias até que as células são totalmente diferenciadas.
As células podem agora ser colhido e a expressão do mRNA de UCP1 e outrr castanhos genes específicos de adipocitos pode ser medido por qRT-PCR. Western blot vai ser utilizado para detectar as proteínas.
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Representative Results
Browning dos adipócitos primários pode ser acessado através da medição expressão de mRNA de UCP1 e outros genes marrons de gordura específica ou selectiva por qRT-PCR. Apresentado na Figura 1 são dados de expressão genética em inguinais WAT-adipócitos primários derivados. As células foram induzidas a diferenciar-se em presença de duas doses diferentes de rosiglitazona a 50 nM e 500 nM, respectivamente. Um subconjunto de células foi tratado com forscolina a 10 uM, durante 4 horas antes da colheita. Isso vai provocar o AMP cíclico (AMPc) nas células e activar programa gene termogénico incluindo UCP1 expressão.
Como mostrado na Figura 1A, a rosiglitazona robustamente UCP1 induzida a expressão do mRNA. Forskolin tratamento (cAMP) ainda aumentou a rosiglitazona expressão induzida UCP1. Outro gene de gordura marrom selectivo, a expressão Cidea foi também induzido pela rosiglitazona robustamente de maneira dose-dependente (Figura 1B). <em> FABP4 é um alvo direto de PPAR e um marcador adipogênica tanto para gordura marrom ea gordura branca. Como mostrado na Figura 1C, FABP4 expressão foi também aumentada quando tratados com rosiglitazona. Este efeito de escurecimento não era simplesmente devido a um aumento da adipogênese per se, uma vez que a indução da expressão de UCP1 e Cidea foi ainda significativo, mesmo que os níveis de mRNA de UCP1 e Cidea foram normalizados para os de FABP4 (Figuras 1D e E).
Para confirmar o nível de proteína aumentado de UCP1, Western Blot deve ser realizada. Como apresentado na Figura 2, uma dose elevada de rosiglitazona (500 nM) aumentou de forma robusta UCP1 proteína nas células. É importante notar que, como anteriormente mostrado na Ohno et al. 16, rosiglitazona induzível células bege mostrou elevado consumo de oxigénio total e desacopladas em resposta à estimulação de cAMP, uma importaçãont características funcionais de adipócitos marrons / células bege.
Figura 1. Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR) que mostra a indução de gordura marrom selectivos genes incluindo UCP1 (A) e Cidea (B). A expressão de um marcador FABP4 adipogênica é também mostrada (C). Quando indicado, as células foram tratadas com AMPc (forscolina a 10 uM), durante quatro horas antes da colheita. O RNA total foi extraído a partir de células diferenciadas utilizando TRIzol (Invitrogen). A transcrição reversa foi realizada utilizando um kit de transcrição reversa cDNA (iScript, Applied Biosystems) e qRT-PCR foi realizada em duplicado com SYBR corante verde fluorescente usando uma máquina ViiA7 ABI. TATA-binding protein (TBP) funcionava como um gene de referência e sequências dos iniciadores são apresentadas na Tabela 1. Rosiglitazona induziu o marrom-seleçãogenes ive UCP1 (D) e Cidea (E) após a normalização de um gene marcador adipogênica FABP4.
Figura 2. Western blot de UCP1 níveis de proteína em células primárias inguinais tratados com rosiglitazona em doses de 50 nM ou 500 nM. Lisados de células totais foram isolados e utilizados para blottings ocidentais. UCP1 anticorpo (Abcam) foi utilizado para a transferência de Western.
| Gene | Espécies | Primer forward | Reverter cartilha |
| FABP4 | mouse | ACACCGAGATTTCCTTCAAACTG | CCATCTAGGGTTATGATGCTCTTCA |
| Cidea | mouse | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT |
| Tbp | mouse | ACCCTTCACCAATGACTCCTATG | TGACTGCAGCAAATCGCTTGG |
| UCP1 | mouse | CACCTTCCCGCTGGACACT | CCCTAGGACACCTTTATACCTAATGG |
Tabela 1. Seqüências de primers para análise em tempo real qPCR.
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Discussion
Aqui apresentamos um sistema confiável celular para estudar o desenvolvimento de células bege / brite em adipócitos primários cultivados em camundongos. Em comparação com várias linhas de células imortalizadas disponíveis, este sistema é susceptível de oferecer relevância melhorada para o escurecimento do branco gordura in vivo.
Mesmo que o estudo desses adipócitos primários oferece algumas vantagens, também existem algumas limitações e preocupações que são importantes a considerar. Em primeiro lugar, este sistema é altamente dependente da potência da diferenciação das células. Expressão de gordura marrom seletivos genes como UCP1 e Cidea são especialmente diferenciação-dependente. Por exemplo, os agonistas de PPARy e BMP7 também melhorar adipogénese, por conseguinte, os "escurecimento" efeitos têm que ser razoavelmente acedida em células com graus semelhantes de diferenciação. Em alternativa, como mostrado nas Figuras 1D e E, normalizando a expressão de gordura marrom-selectivogenes com a de genes marcadores, tais como adipogênese FABP4 podem ser úteis. Em segundo lugar, a idade dos ratos é importante. Poderia talvez ser tentador usar ratos grandes, a fim de obter células como muitos como possível, mas como quedas de diferenciação com a idade. Seria interessante examinar como sinais internos e externos, tais como a exposição ao frio, a obesidade, resistência à insulina ou envelhecimento afecta a capacidade de proliferação, a auto-renovação ou de diferenciação deste tipo de célula utilizando este sistema de cultura. No nosso caso, a idade apropriada de ratinhos C57BL/6J de tipo é entre 6-8 semanas. Terceiro, células primárias são em geral mais sensível e mais frágil do que imortalizaram linhas adipócitos. Embora pré-adipócitos da BAT ou WAT subcutâneo ter uma melhor capacidade de proliferação e diferenciação do que os de WAT visceral, tendem a perder a sua capacidade de diferenciação após várias passagens. Nós normalmente induzir a diferenciação no prazo máximo de três passagens.
Outra importânciatante aspecto a considerar é que a fração estromal-vascular é uma população de células heterogêneas. Neste protocolo vamos nos concentrar na pré-adipócitos e sua capacidade de transformar em um programa de gordura marrom seletiva genética na presença de um agonista PPAR rosiglitazona. Um estudo recente mostrou que PDGFRA-bi-positivos potentes progenitores no WAT abdominal dá origem aos adipócitos castanhos em resposta à estimulação beta-adrenérgica in vivo 17. No entanto, a verdadeira origem das células bege / brite que emergem em resposta ao tratamento crônico PPARg agonista permanece obscuro. O debate tem sido ativa e pesquisadores estão preocupados com esta questão fundamental; está escurecimento da gordura branca através da conversão branco-marrom maior de gordura, através da proliferação de pré-adipócitos marrons comprometidos ou através de transdiferenciação de adipócitos brancos maduros 18,19.
Rosiglitazona tem sido conhecido por induzir o escurecimento de gordura branca in vitro in vivo e 20-26. É interessante notar que a activação de PPARy por agonistas sintéticos podem induzir o escurecimento da gordura branca, no entanto, sobre-expressão de PPARy em adipócitos brancos, não é suficiente 27. Temos anteriormente demonstrado que a induzida por agonista de PPARy efeito de escurecimento é mediada, em parte, por meio da estabilização de proteínas de PRDM16 16. Assim, a identificação de compostos ou moléculas pequenas endógeno que estabilizam PRDM16 proteína pode ser capaz de induzir especificamente a escurecimento de gordura branca. Método actual fornece um sistema robusto e fiável experimental para identificar factores que podem conduzir a uma nova intervenção terapêutica para o tratamento da obesidade e da diabetes.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
Agradecemos Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda, e Lauren Ruiz para discussão, ajuda técnica e assistência editorial no manuscrito. Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (DK087853), do Programa de Pesquisa Biomédica e de ruptura de Asubio Pharm Inc. para SKULA foi apoiado por uma AÇÃO bolsas de doutoramento da Universidade de Copenhague e da UE FP7 projeto Diabat (SAÚDE-F2 -2.011-278373) Lise de Madsen e Kristiansen Karsten. Reconhecemos também o DERC centro de subvenção (NIH P30 DK063720).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
References
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