Summary
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग optogenetic उपकरणों में विशिष्ट न्यूरॉन्स की noninvasive हेरफेर सक्षम
Abstract
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरणों की बढ़ती संख्या के लिए उपलब्ध होते जा रहे हैं कि ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 1 में विशिष्ट न्यूरॉन्स के तंत्रिका गतिविधि के गैर इनवेसिव हेरफेर की अनुमति. इनमें मुख्य optogenetic उपकरण है, जो सक्षम सक्रियण या चमकदार रोशनी का उपयोग बरकरार है और स्वतंत्र रूप से बढ़ने जानवर में विशिष्ट न्यूरॉन्स के मुंह बंद कर रहे हैं. (ChR2) Channelrhodopsin कटियन प्रकाश सक्रिय चैनल है कि, जब नीले प्रकाश से सक्रिय न्यूरॉन्स कि यह व्यक्त की विध्रुवण का कारण बनता है. ChR2 सीओ 2 परिहार, सूंड विस्तार और विशाल फाइबर मध्यस्थता डराना 2-4 प्रतिक्रिया के रूप में विशिष्ट व्यवहार, के लिए महत्वपूर्ण न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए प्रभावी किया गया है. हालांकि, तीव्र प्रकाश स्रोत के रूप में करने के लिए ChR2 भी उत्तेजित photoreceptors को प्रोत्साहित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इन optogenetic तकनीक पहले नहीं दृश्य प्रणाली में इस्तेमाल किया गया है. यहाँ, हम एक परिवर्तन है कि प्रदर्शन के लिए phototransduction impairs के साथ एक optogenetic दृष्टिकोण गठबंधनमक्खी ऑप्टिक पालि, FOMA 1-न्यूरॉन्स में करघा के प्रति संवेदनशील न्यूरॉन्स के एक क्लस्टर की है कि सक्रियण nstrate टकराव से बचने के लिए इस्तेमाल किया, एक भागने व्यवहार ड्राइव कर सकते हैं. हम phototransduction झरना के एक महत्वपूर्ण घटक के एक अशक्त एलील का उपयोग किया है, प्रस्तुत करना phospholipase सी β, norpA जीन द्वारा इनकोडिंग, अंधा मक्खियों और भी Gal4 यूएएस transcriptional उत्प्रेरक प्रणाली का उपयोग करने के लिए FOMA-1 में ChR2 की अभिव्यक्ति ड्राइव न्यूरॉन्स. व्यक्तिगत मक्खियों नीले एलईडी से घिरे एक छोटे से मंच पर रखा जाता है. जब एल ई डी प्रकाशित कर रहे हैं, जल्दी मक्खियों ले बंद उड़ान में एक नेत्रहीन प्रेरित व्यवहार करघा एस्केप-समान तरीके में. हम मानते हैं कि इस तकनीक को आसानी से करने के लिए स्वतंत्र रूप से मक्खियों को बढ़ने में अन्य कार्यों की जांच करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं.
Introduction
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरणों की बढ़ती शस्त्रागार ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 1 में विशिष्ट कोशिकाओं में तंत्रिका गतिविधि में हेरफेर करने के लिए विकसित किया गया है. ये उपकरण noninvasive या बरकरार है और स्वतंत्र रूप से बढ़ने जानवर में विशिष्ट न्यूरॉन्स के सक्रियण मुंह बंद सक्षम. इनमें (ChR2) Channelrhodopsin2, एक कटियन प्रकाश सक्रिय चैनल, महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है, क्योंकि यह अस्थायी और नियंत्रित किया जा सकता है जल्दी से प्रेरित है. जब न्यूरॉन्स है कि एक्सप्रेस ChR2 चमकदार नीली प्रकाश (470 एनएम) वे तेजी से चुम्बकत्व से वंचित करना और ऊंचा फायरिंग दर 3-5 प्रदर्शन उजागर कर रहे हैं. आज़ादी से आगे बढ़ जानवरों में विशिष्ट न्यूरॉन्स के इस तरह के लक्षित सक्रियण सीओ 2 3 परिहार, सूंड 2,4 विस्तार और विशाल फाइबर मध्यस्थता डराना प्रतिक्रियाओं 4 के रूप में इस तरह के व्यवहार के लिए विशेष रूप से न्यूरॉन्स की प्रचुरता से पता चला है. हालांकि, तीव्र प्रकाश ChR2 को प्रोत्साहित करने के लिए आवश्यक स्रोतों के रूप में भी photoreceptors को प्रोत्साहित करने के लिए, सेशन लागू करने केदृश्य प्रणाली togenetic तकनीक सीमित किया गया है. एक परिवर्तन है कि phototransduction impairs के साथ एक optogenetic दृष्टिकोण के संयोजन से, हमने दिखा दिया है कि मक्खी ऑप्टिक पालि में न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट समूह के सक्रियण भागने 6 टकराव से बचने के लिए इस्तेमाल किया व्यवहार ड्राइव कर सकते हैं.
अधिकांश, नहीं तो सब, दृश्य जानवरों आनेवाला वस्तुओं के साथ टकराव से बचने के लिए एक भागने व्यवहार दिखा रहे हैं. चलना या स्थिर मक्खियों, जब एक उभरते टक्कर के साथ प्रस्तुत, उड़ान में दूर ले, आनेवाला 7-9 टक्कर से दूर. इन नापसंद ले उठाया बंद करने और एक अस्थिर उड़ान 10,11 प्रक्षेपवक्र पहले पंख द्वारा विशेषता है. यह प्रतिक्रिया विशाल फाइबर मध्यस्थता डराना प्रतिक्रिया, कूदता है कि उठाया पंखों से पहले नहीं कर रहे हैं से अलग है, और आमतौर पर एक मुक्त गिरने टम्बल 4,9 में परिणाम. ऑप्टिक पालि FOMA-1 न्यूरॉन्स, कि uniqu हैं में करघा संवेदनशील न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट समूह की पहचान कीely आ वस्तुओं सांकेतिक शब्दों में बदलना देखते, हम मक्खी करघा बच व्यवहार में उनकी भागीदारी की जांच करने की मांग की है. यहाँ हम optogenetics का उपयोग करने के लिए चुनिंदा इन न्यूरॉन्स सक्रिय करने और मक्खी भागने व्यवहार प्रकाश में लाना प्रदर्शित करता है.
हम Gal4 यूएएस transcriptional उत्प्रेरक प्रणाली का उपयोग करने के लिए FOMA एक न्यूरॉन्स में ChR2 की अभिव्यक्ति ड्राइव. ChR2 cofactor सब पार रेटिना की आवश्यकता है और के रूप में इस ड्रोसोफिला केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में निम्न स्तर में पाया जाता है यह मक्खियों आहार में पूरक होना चाहिए 3,4 के रूप में चमकदार रोशनी ChR2 सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है और मक्खियों मजबूत phototactic प्रदर्शन व्यवहार. 12, हम प्रोत्साहन के लिए एक दृश्य प्रतिक्रिया की संभावना को खत्म करने की मांग की. ऐसा करने के लिए, हम जानवरों है कि जो phototransduction झरना के एक महत्वपूर्ण घटक है, phospholipase सी β encodes norpA जीन, के एक अशक्त एलील लिए homozygous उत्परिवर्ती थे इस्तेमाल किया. ऐसे उत्परिवर्ती मक्खियों में photoreceptors जिम्मेदारी असमर्थ हैंघ 13 प्रकाश. भागने की प्रतिक्रिया के optogenetic उत्तेजना का परीक्षण करने के लिए, हम एक मक्खी को अलग करने के लिए और यह चमकदार नीली रोशनी में स्नान करने की आवश्यकता है. ऐसा करने के लिए, हम pipet युक्तियों में व्यक्तिगत मक्खियों जगह. एक pipet टिप ऐसी है कि मक्खी geotactically टिप चलना होगा और बाहर एक आयताकार मंच पर एक कस्टम धारक, में रखा गया है. मक्खी के लिए स्वतंत्र रूप से इस मंच के शीर्ष पर चारों ओर चलने में सक्षम है. मंच चार नीली एलईडी arrays, प्रत्येक युक्त 3 एल ई डी, मंच के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित से घिरा हुआ है. बाद मक्खी मंच पर है, एलईडी प्रबुद्ध, कर रहे हैं और एक उच्च गति 6 कैमरे का उपयोग कर मक्खी की प्रतिक्रिया दर्ज की गई है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Channelrhodopsin मक्खियों उत्पन्न
- अपने को चुनने के Gal4 चालक के साथ क्रॉस यूएएस ChR2 मक्खियों, हम G105 - Gal4 का उपयोग करें, जो FOMA 1 ऑप्टिक पालि में न्यूरॉन्स में व्यक्त किया है.
- नीले प्रकाश उत्तेजना एक दृश्य प्रतिक्रिया की संभावना को समाप्त करने, दोनों मक्खी लाइनों ओ + norpA पृष्ठभूमि में हैं.
- अंतिम परिणाम: w; norpA G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- बाद वयस्क eclose मक्खियों, व्यवहार परख के प्रदर्शन से पहले ताजा भोजन, 10 (एक ChR2 लिए आवश्यक सह कारक) सभी पार रेटिना और प्रकाश से संरक्षित सुक्ष्ममापी के साथ पूरक है, पर चयनित महिलाओं में 3 दिनों के लिए डाल दिया.
2. 10 सुक्ष्ममापी अखिल पार रेटिना बढ़ी खाद्य
- 95% इथेनॉल के 17.6 मिलीलीटर में सब पार रेटिना के 100 मिलीग्राम से भंग करने के लिए 20 मिमी रेटिना. सभी समय पर रखने के लिए सभी पार रेटिना प्रकाश से संरक्षित है.
- माइक्रोवेव में मानक cornmeal मक्खी भोजन पिगलो, और शांत करते हैं जब तक गर्म को छूने के लिए.
- मिक्स 20 मिमी की 50 μlमक्खी भोजन की 10 मिलीलीटर की शीशियों में सब पार रेटिना.
- चलो शीशियों को शांत करने के लिए और प्रकाश से सुरक्षित रखना है.
3. उपकरण
- Pipet सुझाव: मानक 1,000 μl pipet युक्तियाँ टिप के पास काट रहे हैं, ~ 2.25 मिमी की एक ताकना व्यास बनाने.
- मंच (चित्रा 1 देखें).
- एक Delrin बेस के साथ, 17 X 25 सेमी, प्रत्येक के लिए ¼ "एनपीटी शीतलक नली connectors फिट कोने में लड़ी पिरोया छेद के साथ निर्माण किया गया.
- एक ऊर्ध्वाधर धारक, Delrin से बना है, आधार के केन्द्र से जुड़ा हुआ है. समग्र आयामों 25 x 40 मिमी x 65 मिमी मिमी (चौड़ाई गहराई एक्स ऊंचाई) हैं. एक 10 मिमी चौड़ी नाली तल पर एक अंगूठे स्क्रू के साथ धारक की लंबाई चलाता है. एक मंच धारक के ऊपर से जुड़ा हुआ है, 25 मिमी एक्स 40 मिमी x 3.5 मिमी व्यास धारक में नाली के साथ गठबंधन छेद के साथ 10 मिमी.
- एलईडी arrays (चित्रा 1 देखें).
- शीतलक नली के चार हथियार, ~ 18 सेमी लंबे, मंच बस से चिपका रहे हैंई शीतलक नली संबंधक का उपयोग कर. कूलेंट नली केवल संरचनात्मक समर्थन के रूप में प्रयोग किया जाता है और ठंडा प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है नहीं है.
- ठीक तरह से स्थान दिया गया है grooves शीतलक के अंतिम टुकड़ा एक हाथ के एक हाथ के अंत करने के लिए एक गर्मी सिंक प्रत्यय hosing में कटौती कर रहे हैं.
- एक नीले एलईडी विद्रोही त्रि सितारे प्रत्येक गर्मी सिंक का उपयोग कर पूर्व में कटौती थर्मल चिपकने वाला टेप करने के लिए मुहिम शुरू की है. ए 18 Carclo ° त्रिकोणीय लेंस प्रत्येक त्रि - स्टार से चिपका है.
- एलईडी त्रि सितारे BuckPuck डीसी ड्राइवरों और एक शक्ति के रूप में निर्दिष्ट की आपूर्ति तार कर रहे हैं. हम प्रत्येक BuckPuck श्रृंखला में दो त्रि स्टार शक्ति के साथ हमारे सेट अप की व्यवस्था की है.
- सभी चार रोशनी 700 त्रि स्टार एलईडी मा हमारे मंच पर 713 डब्ल्यू / 2 मीटर के एक विकिरण झुकेंगे.
- कैमरा: कैमरा एक छोटी तिपाई पर मुहिम शुरू की है और मंच के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित किया.
4. व्यवहार परख
- संक्षेप में बर्फ पर मक्खियों संज्ञाहीन करना.
- Pipet सुझावों में व्यक्तिगत मक्खियों प्लेस, टेप का उपयोग करने के लिए बंदटिप के दोनों समाप्त होता है.
- बाद मक्खियों awoken है और सक्रिय रूप से pipet टिप तलाश, टेप हटाने और ऊर्ध्वाधर धारक में नाली में एक pipet जगह. thumbscrew pipet टिप में जगह सुरक्षित करने के लिए और टिप के नीचे बंद करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- के रूप में मक्खी pipet टिप (आमतौर पर 30 - 60 सेकंड) की पड़ताल, कैमरा रिकॉर्डिंग शुरू बस से पहले उड़ मंच पर सिरे से उभर रहे है.
- बाद उड़ मंच पर उभरा है, 1-2 seco रुको, और नीले एलईडी पर बारी. एक टाइमर का प्रयोग करने के लिए मैन्युअल समय को मापने जब तक मक्खी उड़ान शुरू की.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ब्लाइंड या तो ChR2 या अकेले G105 ड्राइवर चमकीले नीले प्रकाश के साथ उनकी रोशनी के बाद बंद करने के एक कम दर दिखा व्यक्त मक्खियों. ब्लाइंड मक्खियों बंद करने की इसी दर रोशनी (2 चित्रा) की परवाह किए बिना प्रदर्शन किया, सुझाव है कि इन नापसंद ले सहज थे बजाय नीले प्रकाश के साथ रोशनी के कारण. जब ChR2 Foma1 न्यूरॉन्स में व्यक्त किया है, हालांकि, नीले प्रकाश के साथ रोशनी भागने प्रतिक्रिया elicits. परीक्षण मक्खियों के 50% से अधिक रोशनी की 1 सेकंड के भीतर दूर ले गया, और 5 सेकंड के भीतर 75% (2 चित्रा). इसके विपरीत, नियंत्रण मक्खियों का केवल 10% 1 सेकंड के भीतर ले लिया है, और 5 सेकंड के भीतर 20%. G105 ड्राइवर के रूप में दोनों FOMA 1-न्यूरॉन्स में और मशरूम शरीर की γ पालि में व्यक्त किया है, हम एक विशेष रूप से एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में मशरूम शरीर (201Y Gal4) के इस हिस्से में व्यक्त ड्राइवर का इस्तेमाल किया. इन मक्खियों को बंद करने की एक अन्य प्रदर्शन को नियंत्रित करने के लिए इसी तरह की दर का प्रदर्शन (2 चित्रा), विशेष रूप से दर्शाता है कि FOMA एक न्यूरॉन्स की optogenetic सक्रियण बच प्रतिक्रिया हासिल.
उच्च गति optogenetically प्रेरित प्रतिक्रियाओं की प्रति सेकंड 200 तख्ते पर ले लिया इमेजिंग से पता चला है कि इन प्रतिक्रियाओं करघा पैदा भागने व्यवहार (3 चित्रा) के लिए इसी तरह के थे. अर्थात्, मक्खियों की 90% उनके पंखों उठाया फिल्माया ले बंद (एन 30 =) 6 से पहले. इसके अलावा, आगामी उड़ान प्रक्षेपवक्र कम से 10 लेने नापसंद स्वैच्छिक स्थिर था, मक्खी शरीर कुछ ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास (3 चित्रा) में किया जा रहा है के साथ है, लेकिन अधिक विशाल फाइबर में मध्यस्थता 9 प्रतिक्रियाओं की तुलना में स्थिर है.
चित्रा 1 प्रायोगिक ऊर्ध्वाधर धारक और चार हथियार एलईडी उन्हें करने के लिए चिपका arrays के साथ गर्मी सिंक पकड़ hosing शीतलक के साथ मंच दिखाने के सेट अप. एकपरिवेश रोशनी के तहत सेट अप. बी, सेट अप जब एल ई डी प्रकाशित कर रहे हैं. सी, एक सप्ताह में तीन सितारा एक को निकट से देखने गर्मी सिंक पर एलईडी. विकास, स्टार त्रि एक लेंस त्रिकोणीय संलग्न के साथ करीब. ई, Buckpuck चालक और एलईडी सर्किट के एक योजनाबद्ध. एफ, BuckPuck और एलईडी सर्किट के लिए सर्किट आरेख.
चित्रा 2 प्रयोगात्मक और नियंत्रण मक्खी लाइनों के लिए भागने कूद के समय की संचयी हिस्टोग्राम. सभी मक्खियों व्यक्त + w norpA उन्हें नेत्रहीन अंधा प्रस्तुत करना. "FOMA-1" मक्खियों G105 - Gal4 ड्राइवर है, "MB" मक्खियों ड्राइवर 201Y Gal4 कि मशरूम शरीर में अभिव्यक्ति ड्राइव है.
चित्रा 3 ChR2 प्रेरित बच प्रतिक्रियाओं का उच्च गति वीडियो फ्रेम. फ्रेम्स सिलसिलेवार गिने जा रहे हैंially फ्रेम के बीच 5 मिसे के साथ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हम स्वतंत्र रूप से स्नान चमकीले नीले प्रकाश में मक्खियों चलने से बच व्यवहार के optogenetic उत्तेजना का प्रदर्शन किया है. इस दृष्टिकोण आसानी के लिए स्वतंत्र रूप से चलने मक्खियों में अन्य कार्यों की जांच करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं, और बस एलईडी arrays हम एक बड़े क्षेत्र पर इस्तेमाल किया खपरैल का छत द्वारा बड़े प्लेटफार्मों पर पहुंचा जा सकता है. हम या तो सस्ती कैमरा का वर्णन है, या अन्य उपलब्ध कैमरा सिस्टम का उपयोग, उपयोगकर्ता दर्जी फ्रेम दर और छवियों के स्थानिक संकल्प लिए ब्याज के व्यवहार के अनुरूप हासिल कर ली. इसके अतिरिक्त, हमारे इमेजिंग समय तक ही सीमित है, के बाद प्रबुद्ध एल ई डी, के रूप में नीले एलईडी सक्रियण के लिए कैमरे के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ChR2 की रोशनी प्रदान करते हैं. यह हमारे व्यवहार के लिए पर्याप्त है, लेकिन अगर एलईडी रोशनी के लिए उड़ान भरने से पहले की स्थिति या आंदोलन करने के लिए रिकॉर्ड करने की आवश्यकता है, तो अतिरिक्त प्रकाश अवरक्त रेंज, कैमरे के उचित फ़िल्टरिंग के साथ संयुक्त, में संकेत प्रदान स्रोतों को शामिल किया जा सकता है.
_content "> optogenetics को व्यापक रूप से किया गया है एक गैर इनवेसिव तंत्रिका गतिविधि में हेरफेर करने के तरीके के रूप में अभी तक पुकारा., इस तकनीक को बड़े पैमाने पर करने के लिए ChR2 सक्रिय भी दृश्य रास्ते सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल करने के लिए प्रकाश के रूप में दृश्य प्रणाली के लिए अनुपलब्ध किया गया है इसके अतिरिक्त, optogenetics के उपयोग के गैर दृश्य व्यवहार की जांच भी 'मक्खियों चमकदार रोशनी phototactic प्रतिक्रियाओं द्वारा बाधा उत्पन्न किया जा सकता है कि नेत्रहीन अंधे हैं norpA मक्खियों का उपयोग हमें दृश्य प्रणाली में optogenetic उपकरणों का उपयोग करने के लिए सक्षम बनाता है, है और अन्य व्यवहार obscuring से phototaxis रोकता है.इस प्रोटोकॉल की आवश्यकता है कि पसंद के न्यूरॉन्स में ChR2 व्यक्त किया जा, कि मक्खियों सभी ट्रांस रेटिना खिलाया जा, और है कि मक्खियों चमकदार नीली रोशनी में नहाया जा. प्रोटोकॉल हम विकसित इन आवश्यकताओं को पूरा किया है, अभी तक पूरी तरह से अनुकूलित किया गया है नहीं है. उदाहरण के लिए, हम मानते हैं कि प्रकाश की राशि का उपयोग हम आवश्यक की तुलना में उज्जवल हो सकता है, और सभी पार रेटिना, या उससे अधिक समय के एक उच्च एकाग्रता ती खिला है किमुझे, बंद करने की एक उच्च दर में हो सकता है. हम व्यवस्थित इन मापदंडों का पता लगाया है.
FOMA एक न्यूरॉन्स हम सक्रिय मक्खी की lobula परिसर में पाए जाते हैं, और इस प्रकार मस्तिष्क के पीछे की सतह के करीब स्थित है. यह संभव है कि इस प्रयोग की सफलता के सतह के पास जा रहा है न्यूरॉन्स पर निर्भर करता है, के रूप में प्रकाश मक्खी छल्ली के माध्यम से घुसना करने के लिए ChR2 को सक्रिय करना होगा. इस प्रकार, मस्तिष्क में गहरी स्थित कोशिकाओं सफलतापूर्वक इस पद्धति का उपयोग करके सक्रिय नहीं हो सकता है.
G105 चालक 5 न्यूरॉन्स की एक क्लस्टर में ऑप्टिक पालि के प्रत्येक पक्ष पर व्यक्त की है, FOMA 1 न्यूरॉन्स, के रूप में के रूप में मशरूम शरीर के γ लोब में न्यूरॉन्स में. सौभाग्य से, हम एक चालक नियंत्रण प्रयोगों बच व्यवहार में मशरूम शरीर न्यूरॉन्स की एक भूमिका को समाप्त करने के लिए किया था. बहरहाल, चाहे इस व्यवहार के लिए सभी 10 FOMA 1 न्यूरॉन्स की सक्रियता के लिए आवश्यक हैं, या कि क्या वहाँ केवल एक या दोविशिष्ट कक्षों के लिए पर्याप्त हैं, इस समय निर्धारित नहीं किया जा सकता है. के रूप में और अधिक विशिष्ट चालकों को विकसित कर रहे हैं, और अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए रणनीति अन्तरनुभागीय 1,14 परिष्कृत कर रहे हैं, हम करने के लिए अधिक से अधिक विशिष्टता के साथ न्यूरॉन्स लक्ष्य करने में सक्षम होने की उम्मीद है.
Cryptochromes photoreceptors circadian लय और व्यवहार है कि नीले प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं में शामिल कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल में, cryptochromes की संभावना ChR2 प्रोत्साहित किया नीले प्रकाश द्वारा सक्रिय कर रहे हैं. यह करने के लिए बंद करने की कम दर के नियंत्रण मक्खियों में मनाया (जिसके लिए नीले प्रकाश cryptochromes सक्रिय लेकिन नहीं FOMA 1-न्यूरॉन्स में ChR2) के रूप में ले यहाँ से मनाया व्यवहार, प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है निकट ले की दर से मेल खाता है नियंत्रण में मनाया बंद रोशनी के बिना या जब हरी बत्ती (जो cryptochromes सक्रिय नहीं है) के साथ प्रबुद्ध मक्खियों. हालांकि, अन्य व्यवहार है कि और अधिक सीधे cryptochromes से प्रभावित कर रहे हैं के लिए, इस समस्या साबित हो सकता है. एक संभावितइस से बचने के सुधार एक लाल स्थानांतरित channelrhodopsin कि पीला, 589 एनएम, 15 प्रकाश से सक्रिय है उपयोग हो सकता है.
हमारे प्रयोगों में, हम सहज - नापसंद ले जैसे कि ~ नियंत्रण मक्खियों के 10% एलईडी रोशनी के 1 सेकंड के भीतर ले लिया और 5 सेकंड के भीतर 13-28% का स्तर कम मनाया जैसा कि हम बंद करने के इस एक ही दर मनाया जब मक्खियों हरी बत्ती है कि प्रभावी ढंग से किसी भी रोशनी के बिना ChR2, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मक्खियों को सक्रिय नहीं था के साथ प्रकाशित किया गया है, हम मानते हैं कि इन सहज बजाय उड़ानों प्रकाश प्रेरित लेने नापसंद थे. FOMA 1 बच व्यवहार पर न्यूरॉन्स की ChR2 सक्रियण के प्रभाव इसलिए इस सहज गतिविधि के शीर्ष पर मापा जाना चाहिए. अन्य व्यवहार है कि बंद करने के शामिल नहीं है, लेकिन, यह समाप्त परीक्षणों में परिणाम अगर मंच से मक्खियों परीक्षण किया व्यवहार के निष्पादन से पहले से बचने हो सकता है. किस हद तक इन सहज पलायन एक प्रयोगात्मक असुविधा का प्रतिनिधित्व करते है obviously ब्याज के व्यवहार के timescale पर निर्भर है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एक स्टैनफोर्ड डीन (SEJdV) फैलोशिप, स्वास्थ्य निदेशक पायनियर पुरस्कार के राष्ट्रीय संस्थानों (DP0035350 टीआरसी), McKnight फाउंडेशन विद्वान पुरस्कार (टीआरसी) और EY022638 R01 (टीआरसी) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
