Summary
基因编码的optogenetic的工具，使非侵入性的操作，在特定的神经元
Abstract
越来越多的基因编码的工具，正成为可用，允许非侵入性操作，在果蝇的特定神经元的神经活动。其中最主要的是optogenetic工具，激活或沉默的完整和自由移动的动物在特定的神经元，使用明亮的光线，使。 channelrhodopsin（CHR 2）是激活时，由蓝色光，使反映它的神经元的去极化的光激活的阳离子通道。 CHR 2已经有效地确定神经元的特定行为，如CO 2避税，长鼻延伸和巨纤维介导的惊吓反应2-4的关键。然而，作为用来刺激CHR 2也刺激感光体的强光源中，这些optogenetic技术已经以前没有被使用的视觉系统。在这里，我们结合的optogenetic的方法的突变，会影响演示的光传导nstrate集群的织机敏感的神经元在果蝇视叶，福马-1神经元的激活，可以开车逃逸行为，以避免碰撞。我们使用了无效等位基因的光传导级联的重要组成部分，磷脂酶C-β，编码基因的norpA，导致苍蝇盲目的，也可以使用CHR 2的福马-1表达的GAL4-UAS转录的激活系统神经元。个人的苍蝇被放置在一个小平台，周围环绕着蓝色的LED。当LED被点亮，过得很快起飞，飞行，视觉驱动的织机逃逸行为方式类似。我们相信，这种技术可以很容易地适应检查的其他行为，在自由移动的苍蝇。
Introduction
越来越基因编码的工具库已经发展到操纵的神经活动在特定的细胞在果蝇 1。这些工具使非侵入性的完整和自由移动的动物在特定的神经元的激活或沉默。的光激活的阳离子通道，Channelrhodopsin2（CHR 2），其中，提供了重要的优势，因为它可以在时间控制，并迅速诱导。当神经元表达CHR 2暴露在明亮的蓝色（470 nm）的光，他们迅速去极化，表现出升高的发射率3-5。这种有针对性的激活特定的神经元在自由活动动物，揭示了充足的特定神经元的行为，如长鼻延长2,4，3，CO 2避免和巨纤维介导的惊吓反应。然而，由于激烈的光源要刺激CHR 2也刺激光感受器，施加运算togenetic视觉系统的技术，已经被限制。通过相结合的optogenetic的方法的突变，会影响光传导，我们已经表明，在果蝇视叶神经元激活一个特定的集群可以开车逃逸行为，以避免碰撞6。
大多数情况下，如果不是全部的，视觉的动物表现出逃避行为，以避免与迎面而来的物体发生碰撞。步行或固定荏苒，当一个迫在眉睫的冲突，进入飞行，起飞距离迎面而来的碰撞7-9。这些起飞的特点是起飞和飞行轨迹不稳定，10,11之前提出的翅膀。这种反应是与巨纤维介导的惊吓反应，跳之前没有提出翅膀不同，通常会导致在自由下落的滚筒4,9。在确定了具体的织机敏感的神经元群在视叶，福马-1神经元，这是尹居良伊利调整到接近对象进行编码，我们试图探讨其参与果蝇的织机逃逸行为。在这里，我们演示了如何使用光遗传学选择性地激活这些神经元，引起果蝇的逃逸行为。
我们使用驱动CHR 2的FOMA-1神经元表达的GAL4-UAS转录的激活系统。 CHR 2需要的辅助因子全反式视黄醛，因为这是发现在果蝇中枢神经系统在较低水平，必须要补充在果蝇的饮食。3,4明亮的光线来激活CHR 2和果蝇表现出强烈的趋光行为12，我们试图以消除可能的刺激的视觉反应。要做到这一点，我们使用的动物，它编码的光传导级联反应的重要组成部分，磷脂酶C-β的norpA基因为无效等位基因的纯合突变。在这样的突变果蝇的感光器无法respond来点亮13。的逃避反应要测试optogenetic的刺激，我们需要隔离一只苍蝇，沐浴在明亮的蓝色光线。要做到这一点，我们把个人的苍蝇在枪头。一个枪头放置在一个自定义的夹持器，使得飞将geotactically步行尖端和流出到一个矩形平台。苍蝇是能够自由地走动这个平台的顶部。该平台所包围四个蓝色LED阵列，各含3个LED，重点的顶部上的平台。苍蝇在该平台后，指示灯亮起，并使用高速摄像机6苍蝇的反应记录。
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Protocol
1。生成Channelrhodopsin苍蝇
- 跨UAS-CHR 2的苍蝇与GAL4您所选择的驱动程序，我们使用G105-GAL4，表示这是在福马-1在视叶神经元。
- 为了消除可能的蓝色光刺激的视觉反应，无论是飞线是在AW + norpA背景。
- 最终的结果：W + norpA“G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- 后成蝇E关闭，把选中的女性在10μM全反式视黄醛（辅助因子所需的CHR 2），避光，新鲜的食物，补充前3天进行行为分析。
2。 10μM全反式视黄醛的强化食品
- 在17.6毫升的95％乙醇中溶解100毫克的全反式视黄醛，使20mM的视网膜。保持全反式视黄醛避光，在任何时候。
- 标准的玉米面飞的食物在微波炉融化，放凉，直到温暖的触摸。
- 混合50微升的20mM全反式视黄醛的10毫升粉煤灰食品到小瓶中。
- 让瓶冷却，并保持避光。
3。设备
- 枪头：标准1000μL枪头附近的尖被切断，创造〜2.25毫米的孔径。
- 平台（参见图1）。
- 一个聚甲醛基地，17厘米X 25厘米，被修建在每一个角落，以适应¼“不扩散核武器条约”冷却液软管接头的螺纹孔。
- 由Delrin制成，甲垂直支架，安装的碱的中心。整体尺寸为25毫米X 40毫米X 65毫米（宽X深X高）。运行一个10毫米宽的凹槽的保持器的长度，在底部具有翼形螺钉。 A平台安装的支架的顶部，25毫米×40毫米×10毫米，用3.5毫米直径的孔与在支架中的槽对齐。
- 发光二极体（LED）阵列（参见图1）。
- 冷却液软管，四臂〜18厘米长，都贴有平台BASE使用的冷却液软管连接器。冷却剂软管仅被用作结构支撑和不用于冷却的目的。
- 切槽，到最后一块冷却液软管，每个臂，每个臂的末端贴上了散热片，以适当的距离。
- 使用预切的热胶带安装在每个散热片上的蓝色LED反叛的三星级。一个CARCLO 18°三镜头贴在每个三星级。
- 的BuckPuck DC驱动器和电源连接到LED三连星。我们已经安排我们的设置，与每个BuckPuck供电两个三连星系列。
- 所有四个LED照明的三连星在700 mA时产生的辐射为713瓦/米2，在我们的平台上。
- 摄像头：摄像头是装在一个小三脚架和重点顶部的平台上。
4。行为检测
- 简单地说，麻醉苍蝇冰。
- 将个人苍蝇在枪头，用胶带将关闭两端部的前端。
- 苍蝇后语惊醒梦中人，并正在积极探索枪头，取出磁带，然后将移液管在垂直支架的凹槽中。的指旋螺丝，用于固定枪头，并关闭底部的尖端。
- 一样的飞走探索枪头（一般为30 - 60秒），启动相机记录之前出现的飞行从尖端到这个平台上。
- 后飞已经出现在平台上，等待1-2塞科和打开的蓝色LED。使用一个定时器来手动测量的时间，直到飞启动飞行。
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Representative Results
盲飞表达无论是CHR 2或G105驱动程序独秀率较低起飞后带有明亮的蓝色光照明。盲飞，无论照明（ 图2）表现出同样的速度起飞，起飞，这是自发的，而不是由于蓝色光的照明。当CHR 2 Foma1神经元中的表达，然而，与蓝色光的照射引发逃避反应。超过50％的测试苍蝇起飞，在1秒内的照明，75％的5秒内（ 图2）。相比之下，只有10％的控制苍蝇起飞，在1秒内，20％的5秒内。表示福马-1神经元和叶的蘑菇体中的γ-G105驱动程序，我们使用一个驱动程序，具体表现在这部分的蘑菇体（201Y-GAL4）作为一个额外的控制。这些苍蝇表现出类似的其他控件进行的速度起飞（ 图2），表示特别的optogenetic引起的福马-1神经元激活的逃避反应。
采取在200帧每秒的optogenetically诱导的反应的高速成像显示，这些反应是相似的到织机诱发的逃避行为（ 图3）。也就是说，90％的苍蝇拍摄前提出了自己的翅膀起飞（N = 30）6。另外，随后的飞行轨迹比自愿起飞10不太稳定，与果蝇的身体处于一个有点垂直的方向（ 图3），但更稳定的比巨纤维介导的反应9。
图1实验装置平台的垂直支架和四个冷却液冲洗怀里抱着散热片的LED阵列贴。一，设置根据周围环境的照度。 B中，设置当LED被照亮。 C，一个视图的三星级LED在散热片上。 D，密切了三星级的三镜头安装。 E，一个示意性的Buckpuck驱动器和LED电路。 F，为BuckPuck和LED电路的电路图。
图2。实验组和对照飞线跳逃生的时间累积直方图。所有果蝇表达W + norpA使他们直观地盲目。 “FOMA”苍蝇G105-GAL4驱动器“MB”苍蝇的的201Y-GAL4驱动程序，驱动在蕈状体的表达。
图3。高速视频帧CHR 2诱导的逃生反应。帧编号后续的ially与帧之间的5毫秒。
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Discussion
我们已经证明的逃逸行为optogenetic刺激，洗澡自由地走在明亮的蓝色光线的苍蝇。这种方法可以很容易地适应自由行走苍蝇检查的其他行为，并且可以扩展到更大的平台，通过简单地平铺在一个较大的区域中使用的LED阵列，我们。使用廉价的摄像机，我们描述，或其他可用的相机系统中，用户可以调整图像的帧速率和空间分辨率获得的适应行为兴趣。此外，我们的成像后的时间是有限的LED被照亮，作为蓝色LED提供的摄像机的照明以及激活CHR 2。我们的行为，这是足够的，但如果飞之前，LED照明的位置或运动的需要被记录，提供信号，并结合有适当的滤波的相机，在红外范围内的额外的光源可以被纳入。
_content“>光遗传学已广泛誉为一种非侵入性的方式来操纵的神经活动，但是，这种技术已经很大程度上是不可用的视觉系统，所用的光来激活CHR 2也将激活视觉通路。此外，使用光遗传学探测非可视化的行为，也可以阻碍了果蝇的趋光性反应，明亮的灯光。在视觉上盲目的norpA苍蝇，使我们能够使用的视觉系统使用optogenetic工具，趋光性，并防止模糊的其他行为。该协议规定，CHR 2表达的神经元的选择，苍蝇饲喂全反式视网膜，沐浴在明亮的蓝色光线，果蝇。我们开发的协议满足了这些要求，但还没有经过充分的优化。例如，我们相信我们所使用的光的量可能会对必要的亮度比，和较高浓度的全反式视网膜，或更长的时间供给钛我，可能会导致较高的起飞。我们还没有系统地探讨这些参数。
福马-1我们激活的神经元被发现在飞小叶络合物，因此，位于接近大脑的背表面。这是可能的，本实验的成功依赖于接近表面的神经元，作为光必须穿过蝇角质层激活CHR 2。因此，位于更深的大脑中的细胞可能不能成功激活使用此方法。
G105驱动程序表示在5星神经元群集视神经叶的每一侧上，福马-1神经元，以及在叶蘑菇体的γ-神经元的。幸运的是，我们有一个驱动程序做对照实验，消除蕈状体神经元的作用，在逃跑的行为。然而，是否所有10个福马-1神经元的激活所需的这种行为，或是否有一个或两个特定的细胞是足够的，不能确定在这个时候。随着越来越多的特定驱动程序的开发，细化和交错的策略限制表达1,14，我们希望能够有更大的特异性靶神经元。
隐是参与昼夜节律和行为，是对蓝色光敏感的感光细胞。在该协议中，隐花色素可能被激活的蓝色光刺激CHR 2。这似乎并没有影响这里起飞行为观察，观察到在控制苍蝇起飞（其中蓝色光激活的隐花色素，但不CHR 2在福马-1神经元）的低利率密切相匹配的速度采取过观察控制无照明或照明与绿色照明（不激活隐花色素）时，飞行。然而，对于其他行为，更直接地由隐花色素的影响，这可能证明是有问题的。一个潜在的来避免这种改善可能是使用的红移channelrhodopsin由黄色，589nm的光15被激活。
在我们的实验中，我们观察到低水平的自发起飞〜10％的控制苍蝇的LED照明起飞，在1秒内，并在5秒内的13-28％。我们观察到同样的速度起飞时照明与绿色照明，没有有效地激活CHR 2，没有任何照明以及苍蝇，苍蝇，我们认为，这是自发的航班，而不是光致起飞。 CHR 2激活的FOMA-1神经元逃逸行为的影响，因此必须测量这种自发的活动。对于其他行为，不涉及起飞，但是，这可能会导致终止试验，如果苍蝇逃跑的平台之前执行的测试行为。在何种程度上这些自发逃逸的实验不便obviously依赖于时间尺度利益的行为。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由斯坦福大学的院长奖学金（SEJdV），美国国立卫生署署长的先锋奖（TRC DP0035350），一个McKnight基金会学者奖（TRC）和R01 EY022638的（TRC）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
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