Summary
Genetisch kodierte optogenetische Tools ermöglichen invasiven Manipulation von spezifischen Neuronen in der
Abstract
Eine wachsende Zahl von genetisch kodierte Werkzeuge sind immer zur Verfügung, dass auch nicht-invasive Manipulation der neuronalen Aktivität bestimmter Neuronen in Drosophila melanogaster 1. Chef unter diesen sind optogenetische Werkzeuge, die die Aktivierung oder Inaktivierung von bestimmten Nervenzellen im intakten und sich frei bewegenden Tieren mit hellem Licht zu ermöglichen. Channelrhodopsin (ChR2) ist ein Licht-aktivierten Kationen-Kanal, die, wenn sie von blauem Licht aktiviert, verursacht Depolarisation von Neuronen, sie auszudrücken. ChR2 wurde zur Identifizierung Neuronen entscheidend für bestimmte Verhaltensweisen, wie z. B. CO 2-Vermeidung, Rüssel Erweiterung und Riesen-Faser-vermittelten Schreckreaktion 2-4 wirksam. Da jedoch die intensive Lichtquellen verwendet werden, um ChR2 auch stimulieren stimulieren Photorezeptoren haben diese optogenetische Techniken bisher nicht in das visuelle System verwendet worden. Hier bündeln wir eine optogenetische Ansatz mit einer Mutation, die Phototransduktion beeinträchtigt die Demonstrate dass die Aktivierung von einem Cluster von Webstuhl-Neurone im Fliegenhirn Optik Lappens Foma-1 Neuronen, fahren kann ein Entweichen Verhalten verwendet, um eine Kollision zu vermeiden. Wir verwendeten ein Null-Allel von einer kritischen Komponente des Phototransduktionskaskade, an Phospholipase C-β, durch das Gen kodierte norpA, machen die Fliegen blinde und auch mit dem Gal4-UAS-Transkriptionsaktivator System zur Expression von ChR2 im Foma-1 fahren Neuronen. Individuelle Fliegen werden auf einer kleinen Plattform durch blaue LEDs umgeben ist. Wenn die LEDs beleuchtet werden, die schnell fliegt Abheben in Flug, in einer ähnlichen Weise, um visuell angetriebenen Webmaschine Fluchtverhalten. Wir glauben, dass diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Verhaltensweisen in sich frei bewegenden entfernt untersuchen.
Introduction
Eine wachsende Arsenal von genetisch kodierte Werkzeuge wurden entwickelt, um neuronale Aktivität in bestimmten Zellen in Drosophila melanogaster 1 manipulieren. Diese Werkzeuge ermöglichen die nichtinvasive Aktivierung oder Inaktivierung von bestimmten Nervenzellen im intakten und sich frei bewegenden Tier. Unter diesen greifen Channelrhodopsin2 (ChR2), ein Licht-aktivierter Kationen-Kanal, entscheidende Vorteile, da sie zeitlich gesteuert werden können und schnell induziert. Wenn Neuronen, die ausdrückliche ChR2 zu hellen Blau (470 nm) Licht, das sie schnell depolarisiert und weisen erhöhte Feuerrate 3-5 ausgesetzt sind. Solche gezielten Aktivierung von spezifischen Neuronen in sich frei bewegenden Tieren hat die Angemessenheit bestimmter Neuronen für Verhaltensweisen wie CO 2-Vermeidung 3, Rüssel-Erweiterung 2,4 und Riesen-Faser vermittelten erschrecken Antworten 4 enthüllt. Da jedoch die intensive Lichtquellen notwendig ChR2 stimulieren stimulieren auch Photorezeptoren, die Anwendung optogenetic Techniken, um das visuelle System begrenzt wurde. Durch die Kombination eines optogenetische Ansatz mit einer Mutation, die Phototransduktion beeinträchtigt haben wir gezeigt, dass die Aktivierung einer bestimmten Gruppe von Neuronen in der Fliege optischen Loben können die Escape-Verhalten verwendet, um eine Kollision zu vermeiden 6 fahren.
Die meisten, wenn nicht alle, weisen eine visuelle Tieren Fluchtverhalten um Kollisionen mit entgegenkommenden Objekten zu vermeiden. Wandern oder stationär fliegt, wenn sie mit einer drohenden Kollision vorgestellt, Take-off in die Flucht, weg von der entgegenkommenden Kollision 7-9. Diese take-offs sind durch erhöhte Flügeln vor Take-off und einer instabilen Flugbahn 10,11 gekennzeichnet. Diese Antwort unterscheidet sich von dem Riesen-Faser-vermittelten Schreckreaktion, Sprünge, die nicht durch erhöhte Flügel voraus, und in der Regel in einem frei fallenden Wäschetrockner 4,9 führen. Nachdem eine bestimmte Cluster von Webstuhl sensiblen Neuronen in der optischen Loben, Foma-1 Neuronen, die uniqu sindely abgestimmt auf sich nähernde Objekte kodieren, haben wir versucht, ihre Beteiligung an der Fliege loom Fluchtverhalten sondieren. Hier zeigen wir die Verwendung von Optogenetik selektiv zu aktivieren diese Neuronen und entlocken der Fliege Flucht Verhalten.
Wir verwenden die Gal4-UAS-Transkriptionsaktivator System, um die Expression in den ChR2 Foma-1 Neuronen anzutreiben. ChR2 erfordert die Cofaktor all-trans-Retinal und da dies in geringen Mengen in der Drosophila zentralen Nervensystems gefunden wird, muss in der Fliegen "Ernährung ergänzt werden. 3,4 Als helles Licht verwendet wird, um ChR2 aktivieren und Fliegen zeigen eine starke phototaktischen Verhaltensweisen 12, versuchten wir, die Möglichkeit einer visuellen Antwort auf den Reiz zu eliminieren. Dazu verwendeten wir Tiere, die homozygot mutierte für eine Null-Allel des norpA Gen, das eine kritische Komponente des Phototransduktionsprozess, Phospholipase C-β kodiert waren. Photorezeptoren in solchen mutierten Fliegen sind keine Verantwortungd ans Licht 13. Um die optogenetische Stimulation der Flucht Reaktion zu testen, müssen wir eine Fliege zu isolieren und baden sie in helles blaues Licht. Um dies zu tun, legen wir individuelle Fliegen in Pipettenspitzen. Eine Pipettenspitze in einer benutzerdefinierten Halters, so dass die Fliege wird geotactically Fuß bis die Spitze und hinaus auf einer rechteckigen Plattform gesetzt. Die Fliege ist in der Lage, sich frei herumlaufen auf der Oberseite dieser Plattform. Die Plattform wird von vier blaue LED-Arrays mit jeweils 3 LEDs, auf der Oberseite der Plattform ausgerichtet umgeben. Nachdem die Fliege ist auf der Plattform sind die LEDs beleuchtet, und die Fliege Reaktion wird mittels eines High-Speed-Kamera 6.
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Protocol
Ein. Generieren Channelrhodopsin Flies
- Kreuz UAS-ChR2 Fliegen mit dem Gal4-Treiber Ihrer Wahl, verwenden wir G105-Gal4, die in Foma-1 Neuronen in der optischen Loben exprimiert wird.
- Um die Möglichkeit einer visuellen Antwort auf das blaue Licht Stimulation zu eliminieren, sind beide Leitungen in Fliege aw + norpA Hintergrund.
- End Ergebnis: w + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Nach erwachsenen Fliegen schlüpfen, legen ausgewählten Weibchen auf frische Lebensmittel, mit 10 uM all-trans-Retinal (ein Co-Faktor für ChR2 erforderlich) und vor Licht geschützt ergänzt, für 3 Tage vor der Durchführung des Verhaltens Assay.
2. Machen Sie 10 uM All-trans-Retinal Verbesserte Lebensmittel
- Man löst 100 mg des all-trans-Retinal in 17,6 ml 95% Ethanol, um 20 mM Retinal. All-trans-Retinal aus Licht halten zu allen Zeiten geschützt.
- Melt-Standard Maismehl essen fliegen in der Mikrowelle und abkühlen lassen, bis warm an.
- Mix 50 ul 20 mMall-trans-Retinal in Fläschchen von 10 ml essen fliegen.
- Lassen Fläschchen abkühlen und halten vor Licht geschützt.
3. Ausrüstung
- Pipettenspitzen: Standard 1.000 ul Pipettenspitzen sind in der Nähe der Spitze geschnitten, wodurch ein Porendurchmesser von ~ 2,25 mm.
- Platform (siehe Abbildung 1).
- Ein Delrin Base wurde 17 cm X 25 cm, mit Gewindebohrungen an jeder Ecke zu ¼ "NPT Kühlmittelschlauch Stecker passen gebaut.
- Eine vertikale Halterung aus Delrin hergestellt, ist mit dem Zentrum der Basis befestigt. Die Abmessungen sind 25 mm X 40 mm X 65 mm (Breite x Tiefe x Höhe). Eine 10 mm breite Rille läuft über die Länge des Halters, mit einer Flügelschraube an der Unterseite. Eine Plattform ist an der Oberseite des Halters befestigt ist, 25 mm x 40 mm x 10 mm, mit einer 3,5 mm Bohrung mit der Nut in dem Halter ausgerichtet ist.
- LED-Arrays (siehe Abbildung 1).
- Vier Arme Kühlmittelschlauch, ~ 18 cm lang, sind mit der Plattform angebracht base mit dem Wasserschlauch anschließen. Kühlflüssigkeitsleitung wird nur als Strukturträger verwendet und nicht für Kühlzwecke.
- Richtig beabstandeten Rillen sind in das letzte Stück des Kühlmittels Abspritzen von jedem Arm für die Anbringung eines Wärmeschilds mit dem Ende jedes Armes abgeschnitten.
- Eine blaue LED Rebel Tri-Stars wird jeder Kühlkörper mit pre-cut thermische Klebeband befestigt. A Carclo 18 ° Tri-Objektiv ist auf jeden Tri-Star angebracht.
- LED Tri-Sterne sind an den DC BuckPuck Treiber und einer Energieversorgung wie angegeben verdrahtet. Wir haben unser Set-up mit jedem BuckPuck Speisung von zwei Tri-Stars in Reihe angeordnet.
- Beleuchtung aller vier LED Tri-Stars bei 700 mA ergab eine Bestrahlungsstärke von 713 W / m 2 auf unserer Plattform.
- Kamera: Die Kamera wird auf einem kleinen Stativ montiert und konzentrierte sich auf die Oberseite der Plattform.
4. Behavioral Assay
- Kurz betäuben Fliegen auf Eis.
- Zeigen einzelnen Fliegen in Pipettenspitzen, mit Klebeband zu schließenbeide Enden der Spitze.
- Nachdem die Fliegen geweckt haben und aktiv erkunden die Pipettenspitze, entfernen Sie das Klebeband und legen Sie eine Pipette in die Nut in der vertikalen Halterung. Die Flügelschraube wird die Pipettenspitze zu befestigen und um die Unterseite der Spitze zu schließen.
- Wie die Fliege erforscht die Pipettenspitze (typischerweise 30 bis 60 sec), starten Sie die Kamera die Aufnahme kurz vor der Fliege von der Spitze auf die Plattform entsteht.
- Nachdem die Fliege auf der Plattform entstanden ist, warten 1-2 seco, und schalten Sie auf den blauen LEDs. Verwenden Sie einen Timer manuell messen die Zeit, bis die Fliege initiiert Flug.
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Representative Results
Blind fliegt, die entweder ChR2 oder das G105 Fahrer allein zeigen eine niedrige Rate von take-off nach ihrer Beleuchtung mit strahlend blauem Licht. Blind fliegt zeigte die gleiche Rate von take-off unabhängig von Beleuchtung (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass diese take-offs spontane waren eher als durch die Beleuchtung mit blauem Licht. Wenn die ChR2 in den Foma1 Neuronen exprimiert wird, jedoch löst Beleuchtung mit blauem Licht die Flucht Antwort. Über 50% der Fliegen getestet zog innerhalb von 1 Sekunde der Beleuchtung, und 75% innerhalb von 5 sec (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu nahmen nur 10% der Kontrolle Fliegen sich nach 1 sec, und 20% innerhalb von 5 Sekunden. Da der Fahrer sowohl in G105 Foma-1 Neuronen und in der γ-Lappen der Pilzkörper exprimiert wird, verwendeten wir einen Fahrer speziell in diesem Teil der Pilzkörper (201Y-Gal4) als zusätzliche Kontrolle ausgedrückt. Diese Fliegen zeigten eine Rate von take-off ähnlich wie die anderen Kontrollen (Abbildung 2), Das speziell, dass die optogenetische Aktivierung von Foma-1 Neuronen die Flucht Reaktion hervorgerufen.
High-Speed-Bildgebung bei 200 Bildern pro Sekunde der optogenetically induzierten Reaktionen ergaben, dass diese Reaktionen ähnlich dem Webstuhl-evozierte Fluchtverhalten (Abbildung 3) waren. Nämlich gefilmt 90% der fliegt ihre Flügel hob vor Take-off (n = 30) 6. Weiterhin war die anschließende Flugbahn weniger stabil als freiwilliges Rücknahme-offs 10, mit der Fliege Körper in einer etwas vertikale Ausrichtung (Abbildung 3), aber stabiler als Riesen-Faser vermittelte Reaktionen 9.
Abbildung 1. Versuchsaufbau zeigt die Plattform mit der vertikalen Halterung und die vier Kühlmittel Abspritzen haltenden Arme Kühlkörper mit LED-Arrays zu befestigen. A, Das Set-up unter Umgebungsbeleuchtung. B, der Aufbau, wenn die LEDs beleuchtet werden. C, eine Nahaufnahme eines Tri-Star auf dem Kühlkörper LED. D, eine Nahaufnahme von der Tri-Star mit dem tri-Objektiv. E, eine schematische Darstellung der Buckpuck Treiber und LED-Schaltung. F, Schaltplan für die BuckPuck und LED-Schaltung.
Abbildung 2. Kumulative Histogramm der Zeit der Flucht Sprung für Versuchs-und Kontrollgruppen fly Linien. All fliegt ausdrückliche w + norpA zu machen sie visuell blind. "Foma-1" fliegt die G105-Gal4 Treiber; "MB" fliegt die 201Y-Gal4-Treiber, der Expression in der Pilzkörper.
Abbildung 3. High Speed Video-Frames ChR2 induzierte Flucht Antworten. Frames sind nummeriert sequentially mit 5 ms zwischen Frames.
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Discussion
Wir haben optogenetische Stimulation der Flucht Verhaltensweisen durch Baden frei zu Fuß Fliegen in helles blaues Licht gezeigt. Dies kann leicht angepasst werden, um andere Verhaltensweisen in frei zu Fuß Fliegen zu untersuchen, und können zu größeren Plattformen, indem Sie einfach Tiling die LED-Arrays wir über eine größere Fläche verwendet skaliert werden. Verwenden Sie entweder die kostengünstige Kamera, die wir beschreiben, oder andere verfügbare Kamera-Systeme, kann der Anwender individuell die Bildrate und die räumliche Auflösung der Bilder erworben, um das Verhalten von Interesse anzupassen. Zusätzlich wird unsere Imaging auf die Zeit beschränkt, nachdem die LEDs beleuchtet werden, wie die blauen LEDs der Beleuchtung zu liefern für die Kamera als auch die Aktivierung von ChR2. Dies ist ausreichend für unser Verhalten, aber wenn sich die Position oder Bewegung des fly vor LED-Beleuchtung muss aufgezeichnet werden, könnten zusätzliche Lichtquellen Bereitstellen von Signalen im Infrarot-Bereich, mit entsprechender Filterung der Kamera kombiniert werden, eingearbeitet werden.
_CONTENT "> Optogenetik wurde häufig als nicht-invasive Methode zur neuralen Aktivität zu manipulieren begrüßt. Dennoch hat diese Technik weitgehend unzugänglich visuellen System als das Licht verwendet, um ChR2 Aktivierung aktiviert auch Blickbahnen. Außerdem ist die Verwendung von Optogenetik Nicht-visuelle Verhaltensweisen erforschen könnte auch durch den Fliegen phototaktischen Antworten auf helle Lichter behindert werden. Die Verwendung von norpA Fliegen, die optisch blind ermöglicht es uns, optogenetische Werkzeugen im visuellen System zu verwenden, und verhindert Phototaxis von verdunkeln andere Verhaltensweisen.Dieses Protokoll erfordert, dass ChR2 in den Neuronen der Wahl ausgedrückt werden, dass die Fliegen gefüttert all-trans-Retinal werden, und dass die Fliegen in blaues Licht getaucht werden. Das Protokoll haben wir die Anforderungen erfüllt, aber noch nicht vollständig optimiert. Zum Beispiel, glauben wir, die Menge an Licht, das wir verwenden könnte heller sein als notwendig, und dass eine höhere Konzentration an all-trans-Retinal, oder länger Zuführen timir, könnte in einer höheren Rate von take-off führen. Wir haben nicht systematisch diese Parameter untersucht.
Die Foma-1 Neuronen aktivieren wir im Lobula Komplex der Fliege gefunden und sind damit in der Nähe der hinteren Oberfläche des Gehirns. Es ist möglich, dass der Erfolg dieses Experiments auf die Neuronen ist nahe an der Oberfläche beruht, wie das Licht durch die Fliege Schuppenschicht eindringen muss, um ChR2 aktivieren. So können die Zellen tiefer in das Gehirn liegt nicht erfolgreich aktiviert werden mit dieser Methode.
Der G105-Treiber in einem Cluster von 5 Neuronen ist auf jeder Seite des optischen Lappens ausgedrückt, der Foma-1 Neuronen sowie in Neuronen in der γ-Lappen der Pilzkörper. Glücklicherweise hatten wir einen Fahrer die Kontrolle Experimenten zu tun, um eine Rolle der Pilzkörper Neuronen in der Flucht Verhalten zu beseitigen. Jedoch, ob die Aktivierung aller 10 Foma-1 Neuronen für dieses Verhalten erforderlich ist, oder ob es nur eine oder zweispezifische Zellen ausreichend sind, kann zu diesem Zeitpunkt bestimmt werden. Da immer mehr spezielle Treiber entwickelt werden und intersectional Strategien zur Begrenzung Ausdruck werden 1,14 verfeinert, erwarten wir in der Lage sein Neuronen mit größerer Spezifität Ziel.
Cryptochrome sind Photorezeptoren in zirkadianen Rhythmen und Verhaltensweisen, die empfindlich auf blaues Licht sind beteiligt. In diesem Protokoll werden Cryptochromen wahrscheinlich durch das blaue Licht zur ChR2 stimulieren aktiviert. Dies scheint nicht der Take-off Verhalten beobachtet hier beeinflussen, wie die niedrige Rate von take-off Kontrolle Fliegen beobachtet (für die das blaue Licht aktiviert die Cryptochrome aber nicht ChR2 in Foma-1 Neuronen) ehesten der von zu nehmen -off beobachtet Kontrolle fliegt ohne Beleuchtung oder bei Beleuchtung mit grünem Licht (was nicht aktivieren Cryptochrome). Bei anderen Verhaltensweisen, die direkt vom Cryptochromen beeinflusst werden, könnte dies als problematisch erweisen. Ein potentiellesVerbesserung dies zu vermeiden kann die Verwendung einer Rotverschiebung Channelrhodopsin die von gelb, 589 nm, Licht 15 aktiviert worden ist.
In unseren Experimenten konnten wir eine niedrige spontane Nebenabtriebe so dass ~ 10% der Kontrolle entfernt nahm innerhalb von 1 Sekunde der LED-Beleuchtung, und 13 bis 28% innerhalb von 5 sec. Da wir die gleiche Rate von take-off beobachtet, wenn die Fliegen mit grünem Licht, die nicht effektiv war aktivieren ChR2 sowie Fliegen ohne Beleuchtung beleuchtet wurden, glauben wir, dass diese spontane Flüge mehr als das Licht induzierten take-offs waren. Die Wirkung von ChR2 Aktivierung von Foma-1 Neuronen auf Fluchtverhalten muss daher auf Anfang der spontanen Aktivität gemessen werden. Für andere Verhaltensweisen, die nicht mit take-off, jedoch kann dies in gekündigt Studien ergeben, wenn Fliegen von der Plattform vor der Ausführung des geprüften Verhaltens zu entkommen. Das Ausmaß, in dem diese spontanen entweicht stellen einen experimentellen Nachteil ist obviously abhängig Zeitskala des Verhaltens von Interesse.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem Stanford Deans Fellowship (SEJdV), einem National Institutes of Health Director der Pioneer Award (TRC DP0035350), ein McKnight Foundation Scholar Award (TRC) und R01 EY022638 (TRC) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
References
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