Summary
Codificados genéticamente herramientas optogenético permitir la manipulación no invasiva de neuronas específicas en el
Abstract
Un número creciente de herramientas codificados genéticamente se están haciendo disponibles que permiten la manipulación no invasiva de la actividad neuronal de neuronas específicas en Drosophila melanogaster 1. El principal de ellos son herramientas optogenética, que permiten la activación o silenciamiento de neuronas específicas en el animal intacto y moverse libremente con luz brillante. Canalrodopsina (ChR2) es un canal catiónico activado por la luz que, al ser activado por luz azul, causa la despolarización de las neuronas que lo expresan. ChR2 ha sido eficaz para la identificación de las neuronas esenciales para comportamientos específicos, como el CO 2 evitación, la extensión y la probóscide gigante de fibra de respuesta de sobresalto mediada por 2-4. Sin embargo, como las fuentes de luz intensas utilizados para estimular ChR2 también estimular fotorreceptores, estas técnicas optogenético no se han usado previamente en el sistema visual. Aquí, combinamos un enfoque optogenético con una mutación que afecta a la fototransducción demostraciónnstrate que la activación de un grupo de neuronas sensibles al telar en lóbulo óptico de la mosca, Foma-1 neuronas, puede conducir a un comportamiento de escape utilizado para evitar la colisión. Se utilizó un alelo nulo de un componente crítico de la cascada de la fototransducción, fosfolipasa C-β, codificada por el gen Norpa, para hacer que la recta ciego y también utilizar el sistema de transcripción Gal4-UAS activador para conducir la expresión de ChR2 en la Foma-1 neuronas. Moscas individuales están colocados en una pequeña plataforma rodeada por LEDs azules. Cuando los LEDs se iluminan, las moscas rápidamente despegue en vuelo, de una manera similar a la impulsada visualmente telar de escape de comportamiento. Creemos que esta técnica se puede adaptar fácilmente para examinar otras conductas en movimiento libre moscas.
Introduction
Un creciente arsenal de herramientas codificados genéticamente han sido desarrollados para manipular la actividad neural en células específicas en Drosophila melanogaster 1. Estas herramientas permiten la activación no invasivo o el silenciamiento de neuronas específicas en el animal intacto y moverse libremente. Entre estos, Channelrhodopsin2 (ChR2), un canal catiónico activado por la luz, ofrece ventajas, ya que puede ser controlado temporalmente y se indujo rápidamente. Cuando las neuronas que expresan ChR2 están expuestos al brillante azul (470 nm) que rápidamente despolarizar y presentan elevadas tasas de disparo 3-5. Esa activación selectiva de neuronas específicas en animales libres de movimiento ha puesto de manifiesto la suficiencia de las neuronas particulares de comportamientos tales como el CO 2 evitación 3, probóscide extensión 2,4, y el gigante de fibra respuestas de sobresalto mediadas 4. Sin embargo, como las fuentes de luz intensa necesarias para estimular ChR2 también estimular fotorreceptores, aplicando optécnicas genéticos en el sistema visual ha sido limitada. Mediante la combinación de un enfoque optogenético con una mutación que afecta la fototransducción, hemos demostrado que la activación de un conjunto específico de neuronas en el lóbulo óptico de la mosca puede conducir el comportamiento de escape utilizado para evitar la colisión 6.
La mayoría, si no todos, los animales visuales exhiben un comportamiento de escape para evitar colisiones con objetos que se aproximan. Caminar o moscas estacionario, cuando se le presenta una colisión inminente, el despegue en el vuelo, alejándose de la colisión inminente 7-9. Los despegues se caracterizan por las alas planteadas antes del despegue y una trayectoria de vuelo inestable 10,11. Esta respuesta es distinta de la gigante de fibra de la respuesta mediada por sobresalto, saltos que no van precedidos de alas levantadas, y suele dar lugar a una caída en caída libre 4,9. Después de haber identificado un grupo específico de neuronas sensibles al telar en el lóbulo óptico, Foma-1 las neuronas, que son uniquely sintonizado para codificar objetos que se aproximan, hemos tratado de investigar su implicación en el comportamiento de la mosca telar escape. Aquí se demuestra el uso de la optogenética para activar selectivamente estas neuronas y provocar el comportamiento de la mosca de escape.
Utilizamos el sistema transcripcional Gal4-UAS activador para conducir la expresión de ChR2 en las neuronas Foma-1. ChR2 requiere el cofactor todo-trans-retinal y como esta se encuentra en niveles bajos en la Drosophila sistema nervioso central que debe ser complementado en la dieta de las moscas. 3,4 Cuando la luz brillante se utiliza para activar ChR2 y moscas exhiben comportamientos fuertes fototácticas 12, hemos tratado de eliminar la posibilidad de una respuesta al estímulo visual. Para ello, se utilizaron animales que eran mutantes homocigóticos para un alelo nulo del gen Norpa, que codifica un componente crítico de la cascada de la fototransducción, fosfolipasa C-β. Los fotorreceptores en estas moscas mutantes son incapaces de resd a la luz 13. Para probar la estimulación optogenético de la respuesta de escape, tenemos que aislar una sola mosca y se bañan en luz azul brillante. Para ello, ponemos moscas individuales en puntas de pipeta. Una punta de la pipeta se coloca en un soporte de ratón, de tal manera que la mosca geotactically caminará hasta la punta y hacia fuera sobre una plataforma rectangular. La mosca es capaz de caminar libremente alrededor de la parte superior de esta plataforma. La plataforma está rodeada por cuatro matrices de LED de color azul, cada uno con 3 LEDs, centrados en la parte superior de la plataforma. Después de la mosca está en la plataforma, los LED se iluminan, y la respuesta de la mosca se graba con una cámara de alta velocidad 6.
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Protocol
1. Generar moscas canalrodopsina
- Cruz UAS-ChR2 moscas con el controlador de Gal4 de su elección, se utiliza G105-Gal4, que se expresa en Foma-1 neuronas en el lóbulo óptico.
- Para eliminar la posibilidad de una respuesta visual a la estimulación de la luz azul, ambas líneas de mosca son en fondo aw + Norpa.
- Resultado final: w + Norpa; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Después de moscas adultas eclose, poner las hembras seleccionadas en alimentos frescos, complementado con 10 mM todo-trans-retinal (un co-factor necesario para ChR2) y protegido de la luz, durante 3 días antes de realizar el ensayo de comportamiento.
2. Hacer 10 mM todo-trans-retinal Food mejorada
- Disolver 100 mg de todo-trans-retinal en 17,6 ml de etanol al 95% para hacer 20 mM de retina. Mantener todo-trans-retinal protegido de la luz en todo momento.
- Derrita la comida estándar mosca harina de maíz en el microondas y dejar enfriar hasta que esté caliente al tacto.
- Mezclar 50 l de 20 mMtodo-trans-retinal en viales de 10 ml de alimentos mosca.
- Deje enfriar los viales y mantener protegido de la luz.
3. Equipo
- Puntas de pipeta estándar: 1.000 puntas de pipeta mu l se cortan cerca de la punta, creando un diámetro de poro de ~ 2,25 mm.
- Plataforma (ver Figura 1).
- Una base de Delrin, 17 cm x 25 cm, se construyó con agujeros roscados en cada esquina para adaptarse a ¼ "NPT conectores de mangueras de refrigerante.
- Un soporte vertical, hecha de Delrin, está unida al centro de la base. Las dimensiones totales son de 25 mm X 40 mm X 65 mm (ancho x profundidad x altura). Una ranura 10 mm de ancho corre a lo largo del soporte, con un tornillo de pulgar en la parte inferior. Una plataforma está unida a la parte superior del soporte, 25 mm X 40 mm X 10 mm, con un agujero de 3,5 mm de diámetro alineado con la ranura en el soporte.
- Matrices de LED (ver Figura 1).
- Cuatro brazos de manguera de refrigerante, ~ 18 cm de largo, están fijadas a la plataforma base utilizando el conector de la manguera del refrigerante. Refrigeracion sólo se utiliza como soporte estructural y no se utiliza para fines de refrigeración.
- Ranuras adecuadamente espaciados se cortan en la pieza final de una manguera de refrigerante de cada brazo para la colocación del disipador de calor al extremo de cada brazo.
- A Rebel LED azul Tri-Stars está montado en cada disipador de calor con pre-corte de cinta adhesiva térmica. Un Carclo 18 ° Tri-lente está fijado a cada Tri Star-.
- LED Tri-Star se conectan a los conductores BuckPuck de CC y una fuente de alimentación como se especifica. Hemos organizado nuestra puesta a punto con cada BuckPuck alimentar dos Tri-Stars en serie.
- La iluminación de los cuatro LED Tri-Stars a 700 mA produjo una irradiancia de 713 W / m 2 en nuestra plataforma.
- Cámara: La cámara está montada en un trípode pequeño y centrado en la parte superior de la plataforma.
4. Ensayo de comportamiento
- En pocas palabras anestesiar a las moscas en hielo.
- Coloque las moscas individuales en puntas de pipeta, utilizando cinta adhesiva para cerrarAmbos extremos de la punta.
- Después de que las moscas se han despertado y están explorando activamente la punta de la pipeta, retire la cinta y coloque una pipeta en la ranura en el soporte vertical. El tornillo de apriete manual se utiliza para asegurar la punta de la pipeta en su lugar y para cerrar la parte inferior de la punta.
- Como la mosca explora la punta de la pipeta (típicamente 30 - 60 seg), inicie la grabación de la cámara justo antes de la mosca emerge desde la punta a la plataforma.
- Después de la marcha se ha convertido en la plataforma, espere 1-2 seco, y encienda el LED azul. Use un cronómetro para medir manualmente el tiempo hasta que la mosca inicia vuelo.
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Representative Results
Blind vuela manifieste ChR2 o el controlador G105 sólo muestran una baja tasa de despegue después de su iluminación con luz azul brillante. Blind vuela exhibió la misma velocidad de despegue sin iluminación (Figura 2), lo que sugiere que estos despegues eran espontáneas y no debido a la iluminación con luz azul. Cuando el ChR2 se expresa en las neuronas Foma1, sin embargo, la irradiación con luz azul provoca la respuesta de escape. Más del 50% de las moscas ensayadas despegó dentro de 1 segundo de iluminación, y 75% dentro de los 5 seg (Figura 2). En contraste, sólo el 10% de las moscas de control despegó en 1 seg, y 20% dentro de los 5 seg. Como el controlador de G105 se expresa tanto en Foma-1 neuronas y en la γ-lóbulo del cuerpo de hongo, se utilizó un controlador expresa específicamente en esta parte del cuerpo de hongo (201Y-Gal4) como un control adicional. Estas moscas mostraron una tasa de despegue similar a los otros controles realizados (Figura 2), Lo que indica específicamente que la activación optogenético de Foma-1 neuronas suscitó la respuesta de escape.
Formación de imágenes de alta velocidad tomada en 200 cuadros por segundo de las respuestas inducidas optogenetically reveló que estas respuestas fueron similares a la conducta de escape telar-evocada (Figura 3). Es decir, el 90% de las moscas filmado alzaron sus alas antes del despegue (n = 30) 6. Además, la trayectoria de vuelo resultante fue menos estable que el voluntario despegues 10, con cuerpo de la mosca estar en una orientación algo vertical (Figura 3), pero más estable que gigantes respuestas mediadas por fibra 9.
Figura 1. Experimental set-up que muestra la plataforma con el soporte vertical y el refrigerante manguera cuatro brazos de sujeción disipadores de calor con matrices de LED fijados a ellos. La, La puesta a punto bajo iluminación ambiente. B, la puesta en marcha cuando el LED se iluminan. C, una visión cercana del Tri-Star LED del disipador de calor. D, un primer plano de la Estrella de la Tri-con el objetivo de triple adjunto. E, un esquema del controlador de Buckpuck y el circuito de LED. F, diagrama de circuito para el circuito BuckPuck y LED.
Figura 2. Histograma acumulado de tiempo de salto de escape para líneas de moscas experimentales y de control. Todas las moscas express w + Norpa para hacerlos visualmente ciego. "Foma-1" moscas tiene el controlador G105-Gal4; "MB" moscas tiene el controlador 201Y-Gal4 que conduce la expresión en el cuerpo de hongo.
Figura 3. Alta velocidad de fotogramas de vídeo ChR2 respuestas de escape inducido. Los cuadros se numeran subsiguienteially con 5 mseg entre los marcos.
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Discussion
Hemos demostrado la estimulación optogenético de conductas de escape por el baño de caminar libremente las moscas a la luz azul brillante. Este enfoque puede ser fácilmente adaptado para examinar otros comportamientos en moscas libremente a pie, y se puede escalar a grandes plataformas simplemente embaldosado las matrices de LED se utilizan sobre un área mayor. Utilizando cualquiera de la cámara de bajo costo que estamos describiendo, o en otros sistemas de cámara disponibles, el usuario puede adaptar la velocidad de fotogramas y la resolución espacial de las imágenes adquiridas para adaptarse a la conducta de interés. Además, nuestra formación de imágenes está limitado a la vez después de que el LED se iluminan, como el LED azul proporcionar la iluminación para la cámara, así como la activación de ChR2. Esto es suficiente para nuestro comportamiento, pero si la posición o el movimiento de la marcha antes de la iluminación del LED debe ser registrada, fuentes de luz adicionales que proporcionan señales en el rango infrarrojo, combinado con el filtrado apropiados de la cámara, podría ser incorporado.
_content "> optogenética ha sido ampliamente reconocida como un método no invasivo para manipular la actividad neuronal. Sin embargo, esta técnica ha sido en gran parte disponible para el sistema visual como la luz que se utiliza para activar ChR2 también activar las vías visuales. Además, el uso de optogenética para investigar conductas no visuales también podría verse obstaculizado por las respuestas fototácticas de las moscas a las luces brillantes. El uso de moscas Norpa que son visualmente ciego nos permite utilizar herramientas optogenético en el sistema visual, y evita phototaxis de ocultar otros comportamientos.Este protocolo requiere que ChR2 ser expresados en las neuronas de elección, que las moscas se alimentaron todo-trans-retinal, y que las moscas se bañó en luz azul brillante. El protocolo que hemos desarrollado ha cumplido con estos requisitos, aún no ha sido totalmente optimizado. Por ejemplo, creemos que la cantidad de luz que utilizar podría ser más brillante que sea necesario, y que una concentración más alta de todo-trans-retinal, o ya alimentar time, podría resultar en una mayor tasa de despegue. No hemos explorado sistemáticamente estos parámetros.
Los Foma-1 neuronas que se activan se encuentran en el complejo lobula de la mosca, y por lo tanto se encuentra cerca de la superficie posterior del cerebro. Es posible que el éxito de este experimento se basa en las neuronas al estar cerca de la superficie, como la luz debe penetrar a través de la cutícula de la mosca para activar ChR2. Así, las células situadas más profundamente en el cerebro puede no ser activada con éxito usando este método.
El controlador de G105 se expresa en un grupo de 5 neuronas en cada lado del lóbulo óptico, la Foma-1 neuronas, así como en las neuronas de la γ-lóbulo del cuerpo de hongo. Afortunadamente, teníamos un conductor para hacer experimentos de control para eliminar el papel de las neuronas del cuerpo de hongos en el comportamiento de escape. Sin embargo, si la activación de todos los 10 Foma-1 neuronas son necesarios para este comportamiento, o si hay sólo una o doscélulas específicas son suficientes, no se puede determinar en este momento. A medida que más controladores específicos se desarrollan, y las estrategias intersectoriales para limitar la expresión se refinan 1,14, esperamos ser capaces de dirigir las neuronas con mayor especificidad.
Criptocromos son fotorreceptores que participan en los ritmos circadianos y los comportamientos que son sensibles a la luz azul. En este protocolo, se criptocromos probablemente activado por la luz azul que se utiliza para estimular la ChR2. Esto no parece influir en el comportamiento de despegue observado aquí, como la baja tasa de despegue observado en las moscas de control (para el que la luz azul activa los criptocromos pero no ChR2 en Foma-1 neuronas) se acerque a la velocidad de toma -off observado en el control de las moscas sin iluminación o cuando se ilumina con luz verde (que no activa criptocromos). Sin embargo, para otros comportamientos que están más directamente influidos por criptocromos, esto puede resultar problemático. Un potencialmejora de evitar este podría ser el uso de un desplazada al rojo canalrodopsina que se activa por el amarillo, 589 nm, la luz 15.
En nuestros experimentos, se observó un bajo nivel de espontáneo despegues tal que ~ 10% de control de las moscas despegaron en 1 seg de iluminación LED, y 13-28% dentro de 5 seg. Como se observó esta misma velocidad de despegue, cuando las moscas se ilumina con luz verde que no activar eficazmente ChR2, así como moscas sin ninguna iluminación, creemos que se trata de vuelos espontáneas en lugar de luz inducida despegues. El efecto de la activación de ChR2 Foma-1 neuronas en el comportamiento de escape por lo tanto debe ser medido en la parte superior de esta actividad espontánea. Para otros comportamientos que no implican el despegue, sin embargo, esto puede resultar en ensayos terminados si las moscas escapar de la plataforma antes de la ejecución del comportamiento probado. La medida en que estos escapes espontáneos representar un inconveniente experimental es Obviously dependiente de escala temporal de la conducta de interés.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por becas del Decano de Stanford (SEJdV), los Institutos Nacionales de Premio Pioneer del Director de Salud (TRC DP0035350), Premio de la Fundación McKnight Scholar (TRC) y R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
References
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