Summary
Strumenti optogenetic geneticamente codificati consentono la manipolazione non invasiva dei neuroni specifici del
Abstract
Un numero crescente di strumenti geneticamente codificati sono sempre a disposizione che permettono la manipolazione non invasiva dell'attività neurale dei neuroni specifici in Drosophila melanogaster 1. Primo fra questi sono strumenti optogenetic, che consentono l'attivazione o silenziamento dei neuroni specifici nel intatta di un animale e muoversi liberamente con la luce brillante. Channelrhodopsin (CHR2) è un fotoattivabile canale cationico che, attivato dalla luce blu, provoca depolarizzazione dei neuroni che lo esprimono. CHR2 è stato efficace per identificare i neuroni critiche per comportamenti specifici, come ad esempio evitare di CO 2, l'estensione proboscide e gigante in fibra di risposte di allarme mediata 2-4. Tuttavia, poiché le sorgenti luminose utilizzate per stimolare CHR2 anche stimolare fotorecettori, queste tecniche optogenetic non sono stati precedentemente utilizzati nel sistema visivo. Qui, uniamo un approccio optogenetic con una mutazione che altera fototrasduzione a demonstrate che l'attivazione di un gruppo di telaio sensibili neuroni nel lobo ottico della mosca, FOMA-1 neuroni, può guidare un comportamento di fuga utilizzato per evitare la collisione. Abbiamo utilizzato un allele nullo di un componente critico della cascata phototransduction, fosfolipasi C-β, codificata dal gene norpA, per rendere l'aria cieco e anche usare la Gal4-UAS sistema attivatore trascrizionale per guidare l'espressione del CHR2 in Foma-1 neuroni. Mosche individuali sono posto su una piccola piattaforma circondata da LED blu. Quando i LED sono illuminati, le mosche rapidamente decollo in volo, in un modo simile a quello visivo guidato telaio-escape comportamento. Riteniamo che questa tecnica può essere facilmente adattato per esaminare altri comportamenti liberi di muoversi in mosche.
Introduction
Un arsenale crescente di strumenti geneticamente codificati sono stati sviluppati per manipolare attività neurale in cellule specifiche in Drosophila melanogaster 1. Questi strumenti consentono l'attivazione non invasiva o silenziamento di neuroni specifici nel intatta di un animale e liberi di muoversi. Tra questi, Channelrhodopsin2 (CHR2), un fotoattivabile canale cationico, offre vantaggi, poiché può essere controllata temporalmente e rapidamente indotta. Quando i neuroni che esprimono CHR2 esposti a brillante blu (470 nm), luce che rapidamente depolarizzare e presentano elevati tassi di cottura 3-5. Tale attivazione mirata dei neuroni specifici negli animali liberi di muoversi ha rivelato la sufficienza dei neuroni particolari per comportamenti come la CO 2 evitamento 3, estensione 2,4 proboscide, e gigante in fibra di startle risposte mediate 4. Tuttavia, poiché le sorgenti luminose intense necessarie per stimolare CHR2 anche stimolare fotorecettori, applicando optecniche togenetic al sistema visivo è stato limitato. Combinando un approccio optogenetic con una mutazione che altera fototrasduzione, abbiamo dimostrato che l'attivazione di uno specifico cluster di neuroni nel lobo ottica della mosca può guidare il comportamento di fuga utilizzata per evitare la collisione 6.
La maggior parte, se non tutti, gli animali visivi presentano un comportamento di fuga per evitare collisioni con oggetti che sopraggiungono. Camminare o stazionario mosche, quando sono presentati con una collisione incombente, decollo in volo, lontano dalla collisione imminente 7-9. I decolli sono caratterizzati da ali alzate prima del decollo e una traiettoria di volo instabile 10,11. Questa risposta è distinto da gigante in fibra di risposta mediata trasalimento, salti che non sono preceduti da ali alzate, e di solito portare a una caduta in caduta libera 4,9. Dopo aver individuato un gruppo specifico di neuroni sensibili telaio nel lobo ottico, Foma-1 neuroni, che sono uniquely sintonizzati per codificare gli oggetti che si avvicinano, abbiamo cercato di sondare il loro coinvolgimento nel comportamento telaio della mosca fuga. Qui mostriamo l'uso di optogenetics per attivare selettivamente questi neuroni, da attuarsi con il comportamento di fuga della mosca.
Usiamo il Gal4-UAS sistema attivatore trascrizionale per guidare l'espressione di CHR2-1 nei neuroni FOMA. CHR2 richiede il cofattore tutto-trans-retinica e come questo si trova in bassi livelli del sistema nervoso centrale Drosophila deve essere integrato nella dieta delle mosche. 3,4 Come luce è utilizzato per attivare CHR2 e vola mostrare comportamenti phototactic forti 12, si è cercato di eliminare la possibilità di una risposta allo stimolo visivo. Per fare questo, abbiamo utilizzato gli animali che erano mutante omozigote per un allele nullo del gene norpA, che codifica per un componente critico della fototrasduzione a cascata, fosfolipasi C-β. Fotorecettori in tali mosche mutanti sono in grado di responsabilitàd alla luce 13. Per testare la stimolazione optogenetic della risposta di fuga, abbiamo bisogno di isolare una sola mosca e fare il bagno in brillante luce blu. Per fare questo, abbiamo posto le mosche singole puntali. Una punta della pipetta è posto in un supporto personalizzato, in modo tale che la mosca si geotactically a piedi fino alla punta e fuori su una piattaforma rettangolare. La mosca è in grado di camminare liberamente sulla parte superiore di questa piattaforma. La piattaforma è circondata da quattro matrici LED blu, contenenti ciascuno 3 LED, focalizzati sulla parte superiore della piattaforma. Dopo la mosca è sulla piattaforma, i LED sono illuminati, e la risposta della mosca è registrati con un telecamera ad alta velocità 6.
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Protocol
1. Genera mosche channelrhodopsin
- Croce UAS-CHR2 mosche con il driver Gal4 di vostra scelta, usiamo G105-Gal4, che si esprime in foma-1 neuroni nel lobo ottico.
- Per eliminare la possibilità di una risposta alla stimolazione visiva luce blu, entrambe le linee mosca sono in aw sfondo + norpA.
- Risultato finale: w + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Dopo adulto vola Eclose, messo femmine selezionati alimenti freschi, integrata con 10 pM tutto-trans-retiniche (un co-fattore necessario per CHR2) e al riparo dalla luce, per 3 giorni prima di eseguire il test del comportamento.
2. Prova del 10 pM All-trans-retinale cibo avanzato
- Sciogliere 100 mg di tutto-trans-retinale nel 17,6 ml di etanolo al 95%, che il 20 mM retina. Tenere tutto-trans-retinale al riparo dalla luce in ogni momento.
- Melt standard alimentari fly farina di mais in forno a microonde, e lasciare raffreddare fino a caldo al tatto.
- Mescolare 50 ml di 20 mMtutto-trans-retinale in flaconcini da 10 ml di cibo mosca.
- Lasciare raffreddare e conservare fiale al riparo dalla luce.
3. Attrezzatura
- Puntali: Standard 1.000 puntali ul vengono tagliati vicino alla punta, la creazione di un diametro dei pori di ~ 2,25 millimetri.
- Piattaforma (vedi Figura 1).
- Una base Delrin, 17 cm x 25 cm, è stato costruito con fori filettati ad ogni angolo per adattarsi ¼ "NPT raccordi del tubo del liquido di raffreddamento.
- Un supporto verticale, realizzato in Delrin, è attaccata al centro della base. Le dimensioni di ingombro sono 25 mm x 40 mm x 65 mm (larghezza x profondità x altezza). Una scanalatura 10 mm di larghezza corre la lunghezza del supporto, con una vite sul fondo. Una piattaforma è fissato alla parte superiore del supporto, 25 mm x 40 mm x 10 mm, con un foro di diametro 3,5 mm allineata con la scanalatura nel supporto.
- Array di LED (si veda la Figura 1).
- Quattro braccia di tubo di raffreddamento, ~ 18 cm di lunghezza, vengono fissate sulla bas piattaformae utilizzando il connettore del tubo del liquido di raffreddamento. Tubo del liquido di raffreddamento viene utilizzato solo come supporto strutturale e non viene utilizzato per il raffreddamento.
- Scanalature distanziate correttamente vengono tagliati nel pezzo di refrigerante finale getti di ciascun braccio di apporre un dissipatore di calore al fine di ogni braccio.
- A Rebel LED blu Tri-Stars è montato ad ogni dissipatore di calore utilizzando pre-taglio del nastro adesivo termico. Un Carclo 18 ° Tri-obiettivo viene apposto su ogni Tri-Star.
- LED Tri-Stars sono collegati ai driver DC BuckPuck e un alimentatore come specificato. Abbiamo organizzato il nostro set-up con l'alimentazione BuckPuck due Tri-Stars in serie.
- Illuminazione di tutti e quattro LED Tri-Stars a 700 mA ha prodotto un irraggiamento di 713 W / m 2 sulla nostra piattaforma.
- Camera: La camera è montata su un cavalletto piccola e focalizzata sulla parte superiore della piattaforma.
4. Saggio comportamentale
- Brevemente anestetizzare mosche su ghiaccio.
- Mettere mosche singoli puntali, con nastro per chiudereentrambe le estremità della punta.
- Dopo che le mosche si sono svegliati e stanno esplorando attivamente la punta della pipetta, rimuovere il nastro e mettere una pipetta nella scanalatura nel supporto verticale. La vite viene utilizzato per fissare la punta della pipetta in posizione e chiudere il fondo della punta.
- Come la mosca esplora la punta della pipetta (in genere 30 - 60 sec), avviare la registrazione della videocamera poco prima al volo emerge dalla punta sulla piattaforma.
- Dopo il cavalcavia è emerso sulla piattaforma, attendere 1-2 seco, e accendere il LED blu. Utilizzare un timer per misurare manualmente il tempo fino al volo avvia volo.
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Representative Results
Cieco vola che ha espresso CHR2 o il G105 solo conducente mostrano un basso tasso di decollo in seguito alla loro illuminazione con la luce blu. Cieco vola esposto lo stesso tasso di decollo senza illuminazione (Figura 2), suggerendo che i decolli erano spontanei, piuttosto che a causa della illuminazione con luce blu. Quando il CHR2 è espresso nelle FOMA1 neuroni, tuttavia, illuminazione con luce blu suscita la risposta di fuga. Oltre il 50% delle mosche testati tolse entro 1 secondo di illuminazione, e il 75% entro 5 secondi (Figura 2). Al contrario, solo il 10% delle mosche di controllo si spegne entro 1 secondo, e il 20% entro 5 secondi. Come G105 driver è espresso sia in foma-1 neuroni e nella γ-lobo del corpo fungo, abbiamo utilizzato un driver specificamente espresso in questa parte del corpo fungo (201Y-Gal4) quale ulteriore controllo. Queste mosche esibito un tasso di decollo simile agli altri controlli effettuati (Figura 2), Indicando in particolare che l'attivazione optogenetic di Foma-1 neuroni suscitato la reazione di fuga.
Imaging alta velocità presa a 200 fotogrammi al secondo delle risposte indotte optogenetically rivelato che queste risposte erano simili al comportamento di fuga telaio evocato (Figura 3). Vale a dire, il 90% del filmato vola alzarono le ali prima del decollo (n = 30) 6. Inoltre, la traiettoria di volo successivo era meno stabile volontaria decolli 10, con il corpo della mosca essendo in un orientamento leggermente verticale (figura 3), ma più stabile di risposte mediate giganti fibre 9.
Figura 1. Sperimentale set-up che mostra la piattaforma con il supporto verticale e il liquido di raffreddamento quattro getti le braccia che tengono i dissipatori di calore con array di LED apposte sul giocattolo stesso. La, Il set-up in luce ambiente. B, il set-up quando i LED sono illuminati. C, una vista stretta di un Tri-Star LED sul dissipatore. D, un primo piano del Tri-Star con la tri-lente. E, uno schema del driver Buckpuck e circuito LED. F, schema elettrico per la BuckPuck e circuito LED.
Figura 2. Istogramma cumulativo del tempo di salto fuga per le linee mosca sperimentali e di controllo. Tutte le mosche express w + norpA per renderli visivamente cieco. "Foma-1" mosche hanno il G105-Gal4 conducente; "MB" mosche hanno il 201Y-Gal4 driver che pilota l'espressione nel corpo funghi.
Figura 3. Alta velocità fotogrammi video della fuga CHR2 risposte indotte. I frame sono numerati sequentiially con 5 msec tra i fotogrammi.
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Discussion
Abbiamo dimostrato la stimolazione optogenetic di comportamenti di fuga da bagno liberamente a piedi mosche in brillante luce blu. Questo approccio può essere facilmente adattato ad esaminare altri comportamenti nelle mosche liberamente a piedi, e può essere scalata a grandi piattaforme semplicemente le piastrelle array di LED che abbiamo usato su un'area più grande. Utilizzando la telecamera a basso costo descriviamo, o altri sistemi di telecamere disponibili, l'utente può personalizzare il frame rate e risoluzione spaziale delle immagini acquisite in base al comportamento di interesse. Inoltre, la nostra imaging è limitato al tempo dopo i LED sono illuminati, come i LED blu forniscono l'illuminazione per la telecamera e l'attivazione di CHR2. Questo è sufficiente per il nostro comportamento, ma se la posizione o il movimento della mosca prima illuminazione a LED deve essere registrato, ulteriori sorgenti luminose che forniscono segnali nella gamma degli infrarossi, combinato con filtraggio appropriate della fotocamera, potrebbe essere incorporato.
_content "> optogenetics è stato ampiamente riconosciuto come un modo non invasivo per manipolare attività neurale. Tuttavia, questa tecnica è stata ampiamente disponibile per il sistema visivo della luce utilizzata per attivare CHR2 attiverà anche vie visive. Inoltre, l'uso di optogenetics per sondare non visuali comportamenti potrebbe essere ostacolata dalle risposte phototactic le mosche 'a luci. L'uso di mosche norpA che sono visivamente ciechi ci permette di utilizzare strumenti optogenetic nel sistema visivo, e impedisce fototassi da oscurare altri comportamenti.Questo protocollo richiede che CHR2 essere espressa nei neuroni di scelta, che le mosche da alimentare tutto-trans-retina, e che le mosche essere inondata di luce blu brillante. Il protocollo che abbiamo sviluppato possiede i requisiti prescritti, ma non è stato completamente ottimizzato. Per esempio, crediamo che la quantità di luce che usiamo potrebbe essere più luminoso di quanto sia necessario, e che una maggiore concentrazione di all-trans-retinica, o più a lungo di alimentazione time, potrebbe tradursi in un più alto tasso di decollo. Non abbiamo esplorato sistematicamente questi parametri.
I-1 foma neuroni che attivano si trovano nel complesso lobula della mosca, e sono quindi situati vicino alla superficie posteriore del cervello. E 'possibile che il successo di questo esperimento si basa sui neuroni essendo vicino alla superficie, come la luce deve penetrare attraverso cuticola della mosca per attivare CHR2. Così, cellule situate più profondo nel cervello non può essere attivato con successo utilizzando questo metodo.
Il G105 driver è espressa in un cluster di 5 neuroni su ogni lato del lobo ottico, la Foma neuroni-1, così come in neuroni del γ-lobo del corpo fungo. Fortunatamente, avevamo un autista per fare esperimenti di controllo per eliminare il ruolo dei neuroni del corpo fungo nel comportamento di fuga. Tuttavia, se l'attivazione di tutte le Foma-1 10 neuroni sono necessari per questo comportamento, o se ci sono solo uno o duecellule specifiche sono sufficienti, non può essere determinato in questo momento. Mentre sempre più specifici driver sono sviluppati, e le strategie intersettoriali per limitare l'espressione sono raffinati 1,14, ci aspettiamo di essere in grado di indirizzare i neuroni con una maggiore specificità.
Criptocromi fotorecettori sono coinvolti in ritmi circadiani e comportamenti che sono sensibili alla luce blu. In questo protocollo, criptocromi sono probabilmente attivato dalla luce blu utilizzato per stimolare CHR2. Questo non sembra influenzare il decollo comportamento osservato qui, come il basso tasso di decollo osservato in linea di controllo (per il quale la luce blu attiva i criptocromi ma non CHR2 in foma neuroni-1) corrisponde esattamente il tasso di prendere -off osservato nel controllo vola senza illuminazione o quando illuminato con luce verde (che non si attiva criptocromi). Tuttavia, per altri comportamenti che sono più direttamente influenzati da criptocromi, questo potrebbe risultare problematica. Un potenzialemiglioramento per evitare questo potrebbe essere l'uso di un rosso-spostato channelrhodopsin che viene attivato dal giallo, 589 nm, la luce 15.
Nei nostri esperimenti, abbiamo osservato un basso livello di spontanea decolli in modo tale che circa il 10% delle mosche di controllo si spegne entro 1 secondo di illuminazione a LED, e il 13-28% entro 5 secondi. Come abbiamo osservato questo stesso tasso di decollo quando le mosche sono state illuminate con luce verde che non ha effettivamente attivare CHR2, così come le mosche, senza illuminazione, noi crediamo che questi erano voli spontanee piuttosto che la luce indotte decolli. L'effetto di attivazione di CHR2 foma-1 su neuroni comportamento di fuga deve essere misurato in cima a questa attività spontanea. Per altri comportamenti che non coinvolgono il decollo, tuttavia, questo può provocare studi terminati se mosche fuoriuscire dalla piattaforma prima dell'esecuzione del comportamento testato. La misura in cui queste fughe spontanee rappresentano un inconveniente sperimentale è obvione ed dipendono tempistica del comportamento di interesse.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio della Stanford Dean (SEJdV), il National Institutes of Pioneer Award Direttore Salute (TRC DP0035350), un premio McKnight Foundation studioso (TRC) e R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
References
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