Summary
Outils optogenetic génétiquement codés permettent une manipulation non invasive des neurones spécifiques dans le
Abstract
Un nombre croissant d'outils codés génétiquement sont désormais disponibles qui permettent une manipulation non invasive de l'activité nerveuse des neurones spécifiques chez Drosophila melanogaster 1. Parmi ceux-ci sont des outils qui permettent optogenetic, l'activation ou inactivation des neurones spécifiques chez l'animal intact et se déplacer librement en utilisant une lumière vive. Channelrhodopsin (ChR2) est un canal cationique activé par la lumière qui, lorsqu'il est activé par la lumière bleue, provoque une dépolarisation des neurones qui l'expriment. ChR2 a été efficace pour identifier les neurones essentiels à des comportements spécifiques, tels que le CO 2 d'évitement, extension du proboscis et le géant en fibre de réaction de sursaut médiation 2-4. Cependant, comme les sources lumineuses intenses utilisées pour stimuler ChR2 également stimuler les photorécepteurs, ces techniques optogenetic n'ont pas déjà été utilisé dans le système visuel. Ici, nous combinons une approche optogenetic avec une mutation qui altère phototransduction à la démonstrate que l'activation d'un groupe de métier à tisser les neurones sensibles à lobe optique de la mouche, Foma-1 neurones, peut entraîner un comportement de fuite permet d'éviter une collision. Nous avons utilisé un allèle nul d'une composante essentielle de la cascade de phototransduction, la phospholipase C-β, codée par le gène NORPA, pour rendre les mouches aveugles et également utiliser le Gal4-UAS système activateur de la transcription pour diriger l'expression de ChR2 dans le Foma-1 neurones. Mouches individuels sont placés sur une petite plate-forme entourée de LED bleues. Lorsque les voyants sont allumés, la vole vite décoller en vol, d'une manière similaire à visuellement conduit métier-évasion comportement. Nous pensons que cette technique peut être facilement adapté à examiner les comportements des autres en se déplaçant librement mouches.
Introduction
Un arsenal de plus en plus d'outils génétiquement codés ont été développés pour manipuler l'activité neuronale dans des cellules spécifiques chez Drosophila melanogaster 1. Ces outils permettent l'activation non invasive ou réprimer des neurones spécifiques chez l'animal intact et libre de ses mouvements. Parmi ceux-ci, Channelrhodopsin2 (ChR2), un canal cationique activé par la lumière, offre des avantages importants, car il peut être contrôlé dans le temps et rapidement induite. Lorsque les neurones qui expriment ChR2 sont exposés à bleu clair (470 nm) ont rapidement dépolariser et présentent des taux élevés de tir 3-5. Une telle activation ciblée des neurones spécifiques chez les animaux se déplaçant librement a révélé le caractère suffisant des neurones particuliers pour des comportements tels que le CO 2 d'évitement 3, trompe l'extension 2,4, et le géant en fibre de réactions effarouchées médiation 4. Cependant, les sources intenses de lumière nécessaires pour stimuler ChR2 également stimuler les photorécepteurs, en appliquant optogenetic techniques du système visuel a été limité. En combinant une approche optogenetic avec une mutation qui altère phototransduction, nous avons démontré que l'activation d'un ensemble spécifique de neurones du lobe optique de la mouche peut conduire le comportement de fuite utilisé pour éviter la collision 6.
La plupart, sinon la totalité, des animaux visuels présentent un comportement de fuite pour éviter les collisions avec des objets venant en sens inverse. La marche ou arrêt mouches, lorsqu'ils sont présentés avec une collision imminente, le décollage en vol, loin de la collision venant en sens inverse 7-9. Ces décollages sont caractérisés par des ailes soulevées avant le décollage et une trajectoire de vol instable 10,11. Cette réponse est distinct du géant en fibre de réaction de sursaut médiation, sauts qui ne sont pas précédés par des ailes soulevées, et le plus souvent se traduire par une chute en chute libre 4,9. Après avoir identifié un ensemble spécifique de neurones sensibles métier dans le lobe optique, Foma-1 neurones, qui sont uniquely accordé à coder des objets approchant, nous avons cherché à sonder leur implication dans le comportement de la mouche métier évasion. Ici, nous démontrons l'utilisation de optogénétique pour activer sélectivement les neurones et susciter des comportements d'évasion de la mouche.
Nous utilisons le système de Gal4-UAS activateur transcriptionnel pour diriger l'expression de ChR2 dans les Foma-1 neurones. ChR2 nécessite le cofacteur tout-trans-rétinal et comme cela se trouve dans des niveaux faibles dans le système nerveux central chez la drosophile elle doit être complétée dans le régime alimentaire des mouches. 3,4 Comme la lumière vive est utilisée pour activer ChR2 et les mouches des comportements phototactiques forts 12, nous avons cherché à éliminer la possibilité d'une réponse visuelle au stimulus. Pour ce faire, nous avons utilisé les animaux qui étaient mutant homozygote pour un allèle nul du gène NORPA, qui code pour une composante essentielle de la cascade de phototransduction, la phospholipase C-β. Photorécepteurs de ces mouches mutantes sont incapables de responsabilitéd à la lumière 13. Pour tester la stimulation de la réponse optogenetic évasion, nous avons besoin d'isoler une seule mouche et se baigner dans la lumière bleue brillante. Pour ce faire, nous plaçons les mouches individuelles dans les embouts de pipettes. Un embout de la pipette est placé dans un support personnalisé, tel que la mouche geotactically marcher sur la pointe et sur une plate-forme rectangulaire. La mouche est capable de se promener librement autour de la partie supérieure de cette plate-forme. La plate-forme est entourée de quatre rangées de LED bleues, chacune contenant 3 LED, axés sur le dessus de la plate-forme. Après la mouche est sur la plate-forme, les LED sont allumées, et la réponse de la mouche est enregistrée à l'aide d'une caméra grande vitesse 6.
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Protocol
1. Générer mouches channelrhodopsin
- Croix SAMU-CHR2 mouches avec le pilote Gal4 de votre choix, nous utilisons G105-Gal4, qui est exprimée dans Foma-1 neurones dans le lobe optique.
- Pour éliminer la possibilité d'une réponse à la stimulation visuelle bleu clair, les deux lignes de vol sont en aw + NORPA arrière-plan.
- Résultat final: w + NORPA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Après mouches adultes éclosent, mis femelles sélectionnées sur les produits frais, complété avec 10 uM tout-trans-rétiniennes (un co-facteur nécessaire à la ChR2) et à l'abri de la lumière, pendant 3 jours avant d'effectuer le test comportemental.
2. Faire 10 uM tout-trans-rétinal alimentaire améliorée
- Dissoudre 100 mg de tout-trans-rétinal dans 17,6 ml d'éthanol à 95% à 20 mM faire rétinienne. Gardez tout-trans-rétinal abri de la lumière à tout moment.
- Faire fondre norme alimentaire mouche semoule de maïs au micro-ondes et laisser refroidir jusqu'à ce que chaud au toucher.
- Mélanger 50 ul de 20 mMtout-trans-rétinal dans des flacons de 10 ml de nourriture volée.
- Laissez refroidir et conserver les flacons abri de la lumière.
3. Équipement
- Embouts de pipette: Standard 1.000 embouts de pipette ul sont coupées près de la pointe, la création d'un diamètre de pore d'environ 2,25 mm.
- Plate-forme (voir figure 1).
- Une base de Delrin, 17 cm x 25 cm, a été construit avec des trous filetés à chaque coin pour s'adapter ¼ "NPT raccords de tuyaux de liquide de refroidissement.
- Un support vertical, fait en Delrin, est fixé au centre de la base. Les dimensions hors tout de 25 mm X 40 mm X 65 mm (largeur x profondeur x hauteur). Une rainure 10 mm de largeur s'étend sur la longueur du support, avec une vis de serrage à la base. Une plate-forme est fixée à la partie supérieure du support, 25 mm X 40 mm X 10 mm, avec un trou de 3,5 mm de diamètre alignée avec la rainure dans le support.
- Tableaux à LED (voir Figure 1).
- Quatre bras de tuyau de réfrigérant, ~ 18 cm de long, sont fixés à la plate-forme base en utilisant le raccord de tuyau de liquide de refroidissement. Tuyau de refroidissement est utilisé seulement comme un soutien structurel et n'est pas utilisé à des fins de refroidissement.
- Rainures espacées correctement sont découpées dans la dernière pièce du liquide de refroidissement arrosage de chaque bras pour fixer un dissipateur de chaleur à l'extrémité de chaque bras.
- A Rebel LED bleue Tri-étoiles est monté à chaque puits de chaleur à l'aide de pré-découpe du ruban adhésif thermique. A 18 ° Carclo Tri-lentille est apposée sur chaque Tri Star-.
- LED Tri-Stars sont raccordés aux conducteurs BuckPuck DC et une alimentation électrique comme indiqué. Nous avons organisé notre set-up avec chaque BuckPuck alimenter deux Tri-étoiles en série.
- Illumination des quatre LED Tri-étoiles de 700 mA a donné un rayonnement de 713 W / m 2 sur notre plateforme.
- Appareil photo: L'appareil est monté sur un trépied de petite et axée sur le dessus de la plate-forme.
4. Essai de comportement
- En bref anesthésier les mouches sur de la glace.
- Placez les mouches individuelles dans les embouts de pipettes, avec du ruban adhésif pour fermerles deux extrémités de la pointe.
- Après les mouches se sont réveillés et sont activement explorer la pointe de la pipette, retirez la bande et placez une pipette dans la rainure dans le support vertical. La vis est utilisé pour sécuriser la pointe de la pipette en place et de fermer le fond de la pointe.
- Comme la mouche explore la pointe de la pipette (typiquement 30 - 60 sec), démarrez l'enregistrement de la caméra juste avant la mouche sort de l'embout sur la plate-forme.
- Après la mouche a émergé sur la plate-forme, attendez 1-2 seco, et allumez la diode bleue. Utilisez une minuterie pour mesurer manuellement le temps jusqu'à ce que la mouche initie vol.
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Representative Results
Aveugle vole exprimant son ChR2 ou le pilote G105 eux seuls montrent un faible taux de décollage après leur illumination avec une lumière bleu vif. Aveugle vole présentait le même taux de décollage quel que soit l'éclairage (Figure 2), ce qui suggère que ces décollages étaient spontanées plutôt qu'à cause de l'éclairage avec la lumière bleue. Lorsque le ChR2 est exprimé dans les neurones Foma1, cependant, l'illumination avec de la lumière bleue provoque la réaction de fuite. Plus de 50% des mouches testés a décollé à 1 sec de l'illumination, et 75% dans les 5 secondes (Figure 2). En revanche, seulement 10% des mouches de contrôle a décollé à 1 sec, et 20% dans les 5 sec. Que le conducteur G105 est exprimée à la fois dans les neurones Foma-1 et dans la γ-lobe du corps de champignon, on utilise un pilote spécifiquement exprimé dans cette partie du corps de champignon (201Y-Gal4) comme une commande supplémentaire. Ces mouches ont affiché un taux de décollage similaires aux contrôles effectués les autres (figure 2), Indiquant spécifiquement que l'activation optogenetic de Foma-1 neurones suscité la réaction de fuite.
Imagerie à haute vitesse prise à 200 images par seconde des réponses induites optogenetically révélé que ces réponses étaient similaires au comportement d'évasion métier-évoquée (figure 3). Plus précisément, 90% des mouches filmé augmenté leurs ailes avant le décollage (n = 30) 6. En outre, la trajectoire de vol qui a suivi était moins stable que volontaire décollages 10, avec le corps de la mouche étant dans une orientation verticale quelque peu (figure 3), mais plus stable que géants réponses médiées par fibre 9.
Figure 1. Dispositif expérimental montrant la plate-forme avec le support vertical et le liquide de refroidissement arrosage quatre bras tenant les dissipateurs de chaleur avec des tableaux à LED apposées sur eux. A, La mise en place sous l'éclairage ambiant. B, la mise en place lorsque la DEL sont allumées. C, une vue rapprochée d'un Tri-Star LED sur le dissipateur thermique. D, un gros plan sur l'étoile du Tri-avec l'objectif tri-joint. E, un schéma du pilote Buckpuck et les circuits LED. F, schéma des connexions du circuit BuckPuck et LED.
Figure 2. Histogramme cumulé des temps de saut d'échappement pour lignes de vol expérimental et témoin. Tous les mouches expresse w + NORPA pour les rendre visuellement aveugle. "Foma-1" vol d'avoir le pilote G105-Gal4; "MB" vol d'avoir le pilote 201Y-Gal4 qui commande l'expression dans le corps de champignon.
Figure 3. Haute vitesse des images vidéo de CHR2 réactions de fuite induits. Les cadres sont numérotés séquentsially avec 5 ms entre trames.
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Discussion
Nous avons démontré une stimulation optogenetic des comportements de fuite en se baignant librement marcher mouches dans la lumière bleue brillante. Cette approche peut être facilement adaptée à examiner les comportements des autres mouches librement à pied, et peut être adapté aux grandes plates-formes par un simple carrelage des réseaux de DEL, nous avons utilisé sur une grande surface. En utilisant soit la caméra bon marché, nous décrivons, ou d'autres systèmes de caméras disponibles, l'utilisateur peut adapter le taux de trame et la résolution spatiale des images acquises en fonction du comportement de l'intérêt. En outre, notre imagerie est limitée à la période après la voyants sont allumés, comme les LED bleues pour fournir un éclairage de la caméra ainsi que l'activation de ChR2. Cela est suffisant pour notre comportement, mais si la position ou le mouvement de la mouche avant éclairage LED doit être enregistré, d'autres sources de lumière émettant des signaux dans la gamme infrarouge, combinée à un filtrage approprié de la caméra, pourraient être incorporés.
_content "> optogénétique a été largement saluée comme un moyen non invasif pour manipuler l'activité neuronale. Pourtant, cette technique a été très peu disponibles pour le système visuel comme la lumière utilisée pour activer ChR2 également activer des voies visuelles. De plus, l'utilisation de optogénétique pour sonder non visuels comportements pourraient aussi être entravée par des réponses phototactiques les mouches à des lumières vives. L'utilisation de mouches NORPA qui sont visuellement aveugle qui nous permet d'utiliser des outils optogenetic dans le système visuel, et empêche phototaxie de masquer d'autres comportements.Ce protocole exige que ChR2 être exprimé dans les neurones de choix, que les mouches être nourris tout-trans-rétinal, et que les mouches sont baignées de lumière bleu vif. Le protocole que nous avons développé a satisfait à ces exigences, mais n'a pas été entièrement optimisé. Par exemple, nous croyons que la quantité de lumière que nous utilisons pourrait être plus lumineux que nécessaire, et qu'une concentration plus élevée de tout-trans-rétinal, ou plus nourrir timoi, pourrait se traduire par un taux plus élevé de décollage. Nous n'avons pas exploré systématiquement ces paramètres.
Les Foma-1 neurones nous activons se trouvent dans le complexe lobula de la mouche, et sont donc situé à proximité de la surface arrière du cerveau. Il est possible que le succès de cette expérience s'appuie sur les neurones en étant proche de la surface, car la lumière doit pénétrer à travers la cuticule de la mouche pour activer ChR2. Ainsi, les cellules situées plus profondément dans le cerveau ne peut pas être activé avec succès en utilisant cette méthode.
Le pilote G105 est exprimée dans un groupe de 5 neurones de chaque côté du lobe optique, le Foma-1 neurones, ainsi que dans les neurones de la γ-lobe du corps de champignon. Heureusement, nous avions un chauffeur pour faire des expériences de contrôle pour éliminer un rôle des neurones du corps de champignons dans le comportement de fuite. Toutefois, si l'activation de l'ensemble des 10 Foma-1 neurones sont nécessaires pour ce comportement, ou s'il ya seulement un ou deuxcellules spécifiques sont suffisants, ne peut être déterminée pour le moment. De plus en plus de pilotes spécifiques sont développés, et les stratégies intersectorielles pour limiter l'expression sont raffinés 1,14, nous nous attendons à être en mesure de cibler des neurones avec une plus grande spécificité.
Cryptochromes sont les photorécepteurs impliqués dans les rythmes circadiens et les comportements qui sont sensibles à la lumière bleue. Dans ce protocole, cryptochromes sont probablement activé par la lumière bleue utilisée pour stimuler ChR2. Cela ne semble pas influer sur le comportement au décollage observer ici, comme le faible taux de décollage observé chez les mouches de contrôle (pour lesquels la lumière bleue active les cryptochromes mais pas ChR2 dans Foma-1 neurones) correspond étroitement le taux de prendre d'arrêt observé dans le contrôle vole sans éclairage ou lorsqu'il est éclairé avec une lumière verte (qui n'active pas cryptochromes). Cependant, pour d'autres comportements qui sont plus directement influencés par cryptochromes, cela pourrait s'avérer problématique. Un potentielamélioration afin d'éviter ce qui pourrait être l'utilisation d'un décalage vers le rouge channelrhodopsin qui est activé par le jaune, 589 nm, la lumière 15.
Dans nos expériences, nous avons observé un faible niveau de spontané décollages tel que ~ 10% des mouches de contrôle a décollé à 1 sec d'éclairage LED, et 13-28% dans les 5 sec. Comme nous l'avons observé ce même taux de décoller lorsque les mouches étaient éclairés par une lumière verte qui n'a pas activer efficacement ChR2, ainsi que les mouches sans illumination, nous croyons que ces vols ont été spontanées plutôt que de légères provoquées par des décollages. L'effet de l'activation de Foma ChR2-1 neurones sur le comportement de fuite doit donc être mesuré au-dessus de cette activité spontanée. Pour d'autres comportements qui n'impliquent pas le décollage, cependant, il peut en résulter des essais terminés, si les mouches échapper à la plate-forme avant l'exécution du comportement testé. La mesure dans laquelle ces fuites spontanées représentent un inconvénient expérimentale est obviously délai dépendant du comportement de l'intérêt.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par une bourse de Dean Stanford (SEJdV), un National Institutes of Pioneer Award directeur de la santé (TRC DP0035350), le Prix de la Fondation McKnight Scholar de (TRC) et R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
References
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