Summary
Genetisk kodet optogenetic muliggjør ikke-invasiv manipulering av spesifikke nerveceller i
Abstract
Et økende antall av genetisk kodet verktøy blir tilgjengelig som tillater ikke-invasiv manipulering av den nevrale aktiviteten av bestemte nerveceller i Drosophila melanogaster en. Chief blant disse er optogenetic verktøy, som gjør det mulig aktivering eller stanse konkrete nevroner i intakt og fritt bevegelige dyr ved hjelp sterkt lys. Channelrhodopsin (ChR2) er et lysaktivert kation kanal som, når den aktiveres med blått lys, forårsaker depolarisering av nevroner som uttrykker det. ChR2 har vært effektiv for å identifisere nevroner kritiske for spesiell oppførsel, for eksempel CO 2 unngåelse, snabel forlengelse og gigantiske fiber mediert sjokkrespons 2-4. Men som den intense lyskilder som brukes til å stimulere ChR2 også stimulere fotoreseptorene, har disse optogenetic teknikkene ikke tidligere vært brukt i det visuelle systemet. Her kombinerer vi en optogenetic tilnærming med en mutasjon som svekker fototransduksjonskaskade til demonstrate at aktivering av en klynge av vevstol-sensitive nevroner i fly er optisk lapp, FOMA-1 nevroner, kan kjøre en flukt atferd brukes til å unngå kollisjon. Vi brukte en null allel av en kritisk komponent i fototransduksjonskaskade kaskade, til fosfolipase C-β, kodet av norpA genet, gjengi flyr blind og også bruke Gal4-UAS transcriptional aktivator systemet til å kjøre uttrykk for ChR2 i Foma-1 nerveceller. Individuelle fluer er plassert på en liten plattform omgitt av blå lysdioder. Når lysdiodene lyser, fluene raskt ta-off i flukt, på lignende måte å visuelt drevet vevstol-flukt atferd. Vi tror at denne teknikken kan enkelt tilpasses til å undersøke andre atferd i fritt bevegelige fluer.
Introduction
En voksende arsenal av genetisk kodet verktøy har blitt utviklet for å manipulere nevrale aktiviteten i bestemte celler i Drosophila melanogaster en. Disse verktøyene gjør det mulig ikke-invasiv aktivering eller stanse konkrete nevroner i intakt og fritt bevegelige dyr. Blant disse, tilbyr Channelrhodopsin2 (ChR2), en lys-aktivert kation kanal, viktige fordeler, siden det kan være temporært kontrollert og raskt indusert. Når nerveceller som uttrykker ChR2 blir utsatt for lys blå (470 nm) lys de raskt depolarize og viser forhøyede skyting priser 3-5. Slik målrettet aktivering av spesifikke nerveceller i fritt bevegelige dyr har avdekket tilstrekkelighet av bestemte nerveceller for atferd som CO 2 unngåelse 3, snabel forlengelse 2,4 og gigantiske-fiber medierte skremme svar 4. Men som den intense lyskilder er nødvendige for å stimulere ChR2 også stimulere fotoreseptorene, søker optogenetic teknikker til det visuelle systemet har vært begrenset. Ved å kombinere en optogenetic tilnærming med en mutasjon som svekker fototransduksjonskaskade har vi vist at aktiveringen av en spesifikk klynge av nerveceller i fly er optisk lapp kan kjøre flukten atferd brukes for å unngå kollisjon 6.
De fleste, om ikke alle, visuelle dyr viser en flukt atferd for å unngå kollisjoner med motgående objekter. Gå eller stasjonær fluer, når presentert med et truende kollisjon, take-off på flukt, vekk fra møtende kollisjon 7-9. Disse take-offs er preget av hevet vinger før take-off og en ustabil fly bane 10,11. Dette svaret er forskjellig fra den gigantiske fiber mediert skremmeeffekt, hopp som ikke etterfølger hevet vinger, og vanligvis resultere i en fritt fall riste 4,9. Etter å ha identifisert en bestemt klynge av vevstol sensitive nevroner i den optiske lapp, Foma-1 nevroner, som er uniquely innstilt til kode nærmer objekter, forsøkte vi å undersøke deres engasjement i fly er vevstol flukt atferd. Her har vi demonstrere bruk av optogenetics å selektivt aktivere disse nevronene og framprovosere flua flukt atferd.
Vi bruker Gal4-UAS transcriptional aktivator systemet til å kjøre uttrykk for ChR2 i FOMA-1 nerveceller. ChR2 krever kofaktor all-trans-retinal og som dette er funnet i lave nivåer i Drosophila sentralnervesystemet det må suppleres i fluene 'diett. 3,4 Som sterkt lys brukes til å aktivere ChR2 og fluer viser sterke phototactic atferd 12, søkte vi å eliminere muligheten for en visuell respons på stimulans. For å gjøre dette, brukte vi dyr som var homozygot mutant for en null allelet av norpA genet, som koder for et kritisk komponent i fototransduksjonskaskade cascade, fosfolipase C-β. Fotoreseptorene i slike muterte fluer ikke kan ansvaretd til lys 13. For å teste optogenetic stimulering av flukten respons, må vi isolere en enkel flue og bade den i lys blå lys. For å gjøre dette, legger vi enkelte fluer i pipettespisser. Ett pipettespiss er plassert i en tilpasset holder, slik at fly vil geotactically gå opp spissen og ut på en rektangulær plattform. Fly er i stand til å gå rundt fritt på toppen av denne plattformen. Plattformen er omgitt av fire blå LED arrays, hver med tre LED, fokusert på toppen av plattformen. Etter fly er på plattformen, er LED lyser, og flua svar er tatt opp med et høyhastighetskamera 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generer Channelrhodopsin Flies
- Cross UAS-ChR2 fluer med Gal4 driver som du velger, bruker vi G105-Gal4, som er uttrykt i FOMA-1 nevroner i den optiske lapp.
- For å eliminere muligheten for en visuell respons for blått lys stimulering, begge Fluesnører er i aw + norpA bakgrunn.
- Sluttresultatet: w + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Etter at de voksne fluer Eclose, sette utvalgte hunner på fersk mat, supplert med 10 uM all-trans-retinal (en co-faktor som kreves for ChR2) og beskyttes mot lys i 3 dager før utfører atferdsmessige analysen.
2. Gjøre 10 pM All-trans-retinal Enhanced Food
- Oppløs 100 mg av all-trans-retinal i 17,6 ml 95% etanol for å gjøre 20 mM retinal. Keep all-trans-retinal beskyttes mot lys til alle tider.
- Smelt standard cornmeal fly mat i mikrobølgeovn, og la avkjøle seg varm å berøre.
- Bland 50 ul av 20 mMall-trans-retinal inn hetteglass med 10 ml fly mat.
- La hetteglass avkjøle og holde beskyttet mot lys.
3. Utstyr
- Pipettespisser: Standard 1000 ul pipettespisser skjæres nær tuppen, og skaper en porediameter av ~ 2,25 mm.
- Plattform (se figur 1).
- En Delrin base, ble 17 cm x 25 cm, konstruert med gjengede hull på hvert hjørne for å passe ¼ "NPT kjølevæske slangekoblinger.
- En vertikal holderen, laget av Delrin, er festet til sentrum av basen. De totale dimensjonene er 25 mm x 40 mm x 65 mm (bredde x dybde x høyde). En 10 mm brede sporet kjører lengden av holderen, med en tommeskruen nederst. En plattform er festet til toppen av holderen, 25 mm x 40 mm x 10 mm, med en 3,5 mm diameter hull på linje med sporet i holderen.
- LED arrays (se figur 1).
- Fire armer kjølevæske slange, ~ 18 cm lang, er festet til plattformen base med kjølevæske slangen kontakten. Kjølevæske slangen brukes bare som strukturell støtte og ikke brukes til kjøling.
- Riktig avstandsplasserte spor er skåret inn i den siste delen av kjølemiddel spyling av hver arm for å påføre et varmeavløp til slutten av hver arm.
- En blå LED Rebel Tri-Stars er montert på hver kjøleribbe hjelp av pre-cut termisk tape. En CARCLO 18 ° Tri-objektivet er festet til hver Tri-Star.
- LED Tri-Stars er kablet til BuckPuck DC drivere og en strømforsyning som er angitt. Vi har arrangert vår set-up med hver BuckPuck drive to Tri-Stars i serien.
- Belysning av alle fire LED Tri-Stars på 700 mA gitt en irradians av 713 W / m 2 på vår plattform.
- Kamera: Kameraet er montert på et lite stativ og fokusert på toppen av plattformen.
4. Behavioral Assay
- Kort anaesthetize flue på isen.
- Plasser individuelle fluer i pipettespisser, med tape for å lukkebegge ender av spissen.
- Etter at fluene har vekket og er aktivt utforske pipettespiss, fjerne tapen og legg en pipette i sporet i vertikal holder. Tommeskruen brukes til å sikre den pipettespiss på plass og for å lukke bunnen av spissen.
- Som fly utforsker pipettespiss (vanligvis 30 - 60 sek), starte kameraet opptaket like før flua framgår spissen på plattformen.
- Etter fly har dukket opp på plattformen, vente 1-2 seco, og slå på den blå lysdioder. Bruk en tidtaker til manuelt måle tiden til fly starter flyturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blind flyr uttrykker enten ChR2 eller G105 driver alene viser en lav sats av take-off etter deres belysning med lys blå lys. Blind flyr utstilt samme hastighet på take-off uansett belysning (Figur 2), noe som tyder på at disse take-offs var spontan enn på grunn av belysning med blått lys. Når ChR2 er uttrykt i Foma1 nevroner, men utløser belysning med blått lys flukten respons. Over 50% av fluene ble testet tok av innen 1 sekund av belysning, og 75% i løpet av 5 sek (fig. 2). I kontrast, tok bare 10% av kontroll fluer av innen 1 sek, og 20% i løpet av 5 sek. Som G105 driveren uttrykkes både i FOMA-1 nevroner og i γ-flik av sjampinjong kroppen, vi brukte en driver spesifikt uttrykt i denne delen av sjampinjong kroppen (201Y-Gal4) som en ytterligere kontroll. Disse fluene oppviste en rate på avgang lik de andre kontroller utført (Figur 2), Noe som indikerer nemlig at optogenetic aktivering av FOMA-1 nevroner elicited flukten respons.
Høy hastighet bildebehandling tatt på 200 bilder per sekund i de optogenetically induserte svar viste at disse svarene var lik veven-fremkalt flukt atferd (figur 3). Nemlig, filmet 90% av fluene hevet vingene før avgang (n = 30) 6. Videre var den påfølgende flyturen banen mindre stabile enn frivillig avganger 10, med fly kropp være i en noe vertikal orientering (figur 3), men mer stabil enn gigantiske fiber medierte responser 9.
Figur 1. Eksperimentell oppsett som viser plattformen med den vertikale holderen og fire kjølemiddel spyling armene holder kjølelegemer med LED arrays festet til dem. A, Set-opp under ambient belysning. B, set-up når lysdiodene lyser. C, en tett opp visning av en Tri-Star LED på kjøleribben. D, et nærbilde av Tri-Star med tri-objektivet festet. E, en skjematisk av Buckpuck Driver og LED krets. F, koblingsskjema for BuckPuck og LED krets.
Figur 2. Kumulativ histogram av tid til å unnslippe hoppe for eksperimentelle og kontroll fly linjer. Alle fluene express w + norpA å gjengi dem visuelt blind. "Foma-1" fluer har G105-Gal4 sjåfør, "MB" fluer har 201Y-Gal4 driver som driver uttrykk i sjampinjong kroppen.
Figur 3. Høy hastighet videobilder av ChR2 indusert escape svar. Rammer er nummerert påfølgendeially med 5 ms mellom rammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har vist optogenetic stimulering av escape atferd ved bading fritt vandre fluer i lyse blå lys. Denne tilnærmingen kan enkelt tilpasses til å undersøke andre atferd i fritt vandre fluer, og kan skaleres til større plattformer ved å flislegging LED arrays vi brukte over et større område. Ved hjelp av enten billig kamera vi beskriver, eller andre tilgjengelige kamerasystemer kan brukeren skreddersy bildefrekvens og romlig oppløsning av bildene ervervet, spesialtilpasset oppførselen av interesse. Tillegg er vårt bildebehandling begrenset til tiden etter lysdiodene lyser, som blå lysdioder gir belysningen for kameraet samt aktivering av ChR2. Dette er tilstrekkelig for vår atferd, men hvis plasseringen eller bevegelsen av fly før LED-belysning må registreres, kan ytterligere lyskilder som gir signaler i det infrarøde området, kombinert med passende filtrering av kameraet bli tatt.
_content "> Optogenetics har blitt sett på som et non-invasiv måte å manipulere nevral aktivitet. Likevel har denne teknikken vært stor grad utilgjengelig for det visuelle systemet som lyset brukes til å aktivere ChR2 vil også aktivere visuelle trasé. I tillegg, bruk av optogenetics å sondere ikke-visuelle atferd kan også bli hemmet av fluene 'phototactic svar på sterkt lys. Bruk av norpA fluer som er visuelt blind gjør at vi kan bruke optogenetic verktøy i det visuelle systemet, og hindrer phototaxis fra å skjule andre atferd.Denne protokollen krever at ChR2 uttrykkes i neuronene av valg, at fluene mates all-trans-retinal, og at fluene bades i sterkt blått lys. Protokollen vi utviklet har møtt disse kravene, men har ikke blitt fullt optimalisert. For eksempel, tror vi mengden lys vi bruker kan være lysere enn nødvendig, og at en høyere konsentrasjon av all-trans-retinal, eller lenger feeding TImeg, kan resultere i en høyere rate av take-off. Vi har ikke systematisk undersøkt disse parametrene.
De FOMA-1 nervecellene vi aktivere finnes i lobula komplekset av fly, og er dermed ligger nær baksiden overflaten av hjernen. Det er mulig at suksessen av dette eksperimentet er avhengig nervecellene være nær overflaten, som lyset må trenge gjennom fly er cuticle å aktivere ChR2. Således kan celler ligger dypere i hjernen ikke aktivert ved hjelp av denne metoden.
Den G105-driveren er uttrykt i en klynge av 5 neuroner på hver side av den optiske lobe, den Foma-1 nevroner, samt i nevroner i γ-flik av sjampinjong kroppen. Heldigvis hadde vi en driver for å gjøre kontroll eksperimenter for å eliminere en rolle sopp kroppen nevroner i flukt atferd. Imidlertid om aktivering av alle 10 FOMA-1 nevroner kreves for dette problemet, eller om det er bare en eller tospesifikke celler er tilstrekkelig, ikke kan avgjøres på dette tidspunktet. Ettersom flere spesifikke drivere er utviklet, og interseksjonell strategier for å begrense uttrykket er raffinert 1,14, forventer vi å kunne målrette nevroner med større nøyaktighet.
Cryptochromes er fotoreseptorene involvert i døgnrytme og atferd som er følsomme for blått lys. I denne protokollen, er cryptochromes sannsynlig aktiveres av blått lys brukes til å stimulere ChR2. Dette ser ikke ut til å påvirke take-off atferd observert her, som lav sats av take-off observert i kontroll fluer (som det blå lyset aktiverer cryptochromes men ikke ChR2 i FOMA-1 nevroner) tett opp til den frekvensen av å ta -off observert i kontroll flyr uten belysning eller når belyst med grønt lys (som aktiverer ikke cryptochromes). Men for andre atferd som er mer direkte påvirket av cryptochromes, kan dette vise seg å være problematisk. En muligforbedring for å unngå dette kan være bruk av en rød-forskjøvet channelrhodopsin som aktiveres ved gul, 589 nm, 15 lys.
I våre eksperimenter, observerte vi et lavt nivå av spontan take-offs slik at ~ 10% av kontroll fluer tok av i løpet av 1 sekund av LED belysning, og 13-28% innen 5 sek. Som vi har observert den samme frekvensen av take-off når fluene ble belyst med grønt lys som ikke effektivt aktivere ChR2, samt fluer uten belysning, tror vi at disse var spontane flyreiser fremfor lys indusert take-offs. Effekten av ChR2 aktivering av FOMA-1 nevroner på flukt atferd må derfor måles på toppen av denne spontan aktivitet. For andre atferd som ikke involverer take-off, men dette kan resultere i terminerte studier hvis flyr flykte fra plattformen før gjennomføring av testet atferd. I hvilken grad disse spontane rømming representerer en eksperimentell ulempe er obviously avhengig tidsskala av atferd av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av en Stanford Dean Fellowship (SEJdV), en National Institutes of Health Regissørens Pioneer Award (TRC DP0035350), en McKnight Foundation Scholars Award (TRC) og R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
