Summary
Генетически закодированный инструменты optogenetic позволяет неинвазивным манипуляции конкретных нейронов в
Abstract
Все большее число генетически закодирована инструменты становятся доступны, которые позволяют неинвазивным манипуляции с нейронной активности специфических нейронов дрозофилы 1. Главными среди них являются optogenetic инструменты, которые позволяют активации или глушителей конкретных нейронов в нетронутой и свободно движущихся животных с использованием яркого света. Channelrhodopsin (ChR2) является светло-активированных катионов канал, который при активации синий свет, вызывает деполяризацию нейронов, что выразить это. ChR2 была эффективна для выявления нейроны важны для конкретного поведения, такие как CO 2 избегания, хоботок расширение и гигантские волокна опосредованная реакция испуга 2-4. Однако, как яркие источники света используются для стимуляции ChR2 также стимулировать фоторецепторы, эти optogenetic методы ранее не были использованы в зрительной системе. Здесь мы объединяем optogenetic подход с мутацией, которая ухудшает фототрансдукции для демонстрацииnstrate, что активация кластера ткацкий станок-чувствительных нейронов в оптической доле мухи, Фома-1 нейроны, может управлять поведением побег используется, чтобы избежать столкновения. Мы использовали нулевой аллель из важнейших компонентов фототрансдукции каскада, фосфолипазы C-β, кодируемого геном norpA, оказывать летит слепым, а также использовать Gal4-UAS транскрипционных активаторов системы для управления экспрессией ChR2 в Фома-1 нейронов. Индивидуальные мух помещают на небольшой платформе окружении синих светодиодов. Если светодиоды горят, летит быстро взлета в полете, подобно визуально приводом станка-выход поведения. Мы считаем, что этот метод может быть легко адаптирована для изучения других поведения в свободном перемещении мухи.
Introduction
Растущий арсенал генетически закодирована инструменты были разработаны для работы нейронной активности в отдельных клетках дрозофилы 1. Эти инструменты позволяют неинвазивной активации или глушителей конкретных нейронов в нетронутой и свободно движущихся животных. Среди них Channelrhodopsin2 (ChR2), светло-активированных катионов канал, предлагает основные преимущества, так как он может быть временно управлять и быстро индуцированной. Когда нейроны, которые выражают ChR2 подвергаются ярко-синий (470 нм) света они быстро деполяризовать и обладают повышенной теплотехнической 3-5. Такие целевые активации специфических нейронов в свободном перемещении животных показали достаточность частности нейронов поведения, такие как CO 2 избежании 3, хоботок расширения 2,4, и гигантские волокна опосредованный ответ испуга 4. Однако, как интенсивный источник света необходимо стимулировать ChR2 также стимулировать фоторецепторы, применяя опtogenetic методов зрительной системы была ограничена. Объединив optogenetic подход с мутацией, которая ухудшает фототрансдукции, мы показали, что активация конкретного кластера нейронов в оптической доле мухи может управлять поведением побег используется, чтобы избежать столкновения 6.
Большинство, если не все, визуально животные проявляют побег поведение, чтобы избежать столкновения с встречным объектов. Ходьба или стационарного мух, когда представлены надвигающегося столкновения, взлет в полете, от встречного столкновения 7-9. Эти взлетов характеризуется поднятыми крыльями до взлета и неустойчивую траекторию полета 10,11. Эта реакция отличается от гигантского волокна опосредованной реакции испуга, прыжки, которые не предшествовали поднятыми крыльями, и обычно приводят в свободном падении падение 4,9. После определения конкретного кластера ткацкий станок чувствительных нейронов в зрительных долей, Фома-1 нейроны, которые uniquЭли настроен для кодирования приближается объектов, мы стремились исследовать их участие в ткацком станке поведения побег мухи. Здесь мы демонстрируем использование optogenetics выборочно активировать эти нейроны и вызывает бегство поведение мухи.
Мы используем Gal4-UAS транскрипционных активаторов системы управления экспрессией ChR2 в Фома-1 нейроны. ChR2 требует кофакторов все-транс-ретиналь и как этому можно найти в низких уровнях в Drosophila центральной нервной системы, оно должно быть дополнено в рационе мух. 3,4 Как яркий свет используется для активации ChR2 и мухи проявляют сильное поведение phototactic 12, мы стремились исключить возможность визуального ответ на стимул. Для этого мы использовали животных, которые были гомозиготных мутантных по нулевой аллель гена norpA, который кодирует одним из важнейших компонентов фототрансдукции каскада, фосфолипазы C-β. Фоторецепторов в таких мутантных мух не могут ответственD на свет 13. Чтобы проверить optogenetic стимуляции побег ответ, мы должны изолировать одну муху и купать его в ярко-синим светом. Чтобы сделать это, мы размещаем отдельные мухи в пипетки советов. Одна пипетка головка помещена в специально держателя, так что муха будет geotactically ходить кончик и выходит на прямоугольной платформе. Муха может свободно ходить на вершине этой платформы. Платформа окружен четырьмя синий светодиод массивов, каждый из которых содержит 3 светодиода, ориентированных на верхней части платформы. После того, как муха на платформе, светодиоды горят, и ответ мухи записывается с помощью высокоскоростной камеры 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создание Channelrhodopsin мух
- Крест UAS-ChR2 мух с Gal4 водитель по вашему выбору, мы используем G105-Gal4, которая выражается в Фома-1 нейроны в оптической доле.
- Чтобы исключить возможность визуального ответ на синей световой стимуляции, как муха линии в AW фоне + norpA.
- Конечный результат: W + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- После взрослых мух eclose, положить выбранный женщин на свежие продукты питания, с добавлением 10 мкМ полностью транс-ретиналь (кофактор необходимых для ChR2) и защищенном от света месте, за 3 дня до проведения поведенческого анализа.
2. Сделайте 10 мкМ All-транс-ретиналь Расширение питания
- Растворите 100 мг полностью транс-ретиналь в 17,6 мл 95% этанола, чтобы сделать 20 мМ сетчатки. Храните все-транс-ретиналь, защищенном от света во все времена.
- Растопить стандартной пищи лету кукурузной муки в микроволновой печи, и дайте остыть до теплого на ощупь.
- Смешать 50 мкл 20 мМвсе-транс-ретиналь во флаконы по 10 мл лету пищи.
- Пусть флаконы охладить и хранить в защищенном от света.
3. Оборудование
- Внесите советы: Стандартный 1.000 мкл советы пипетки срезают вблизи острия, создавая поры диаметром ~ 2,25 мм.
- Платформа (см. Рисунок 1).
- База Delrin, 17 см х 25 см, была построена с резьбовыми отверстиями на каждом углу, чтобы соответствовать ¼ "NPT разъемы шланг охлаждающей жидкости.
- Вертикальный держатель, изготовленный из Delrin, присоединен к центру базы. Габаритные размеры составляют 25 мм х 40 мм х 65 мм (ширина х глубина х высота). Шириной 10 мм паз проходит вдоль держателя, с накатанной головкой на дне. Платформа крепится к верхней части держателя 25 мм X 40 мм X 10 мм, с диаметром 3,5 мм отверстие в соответствие с паз в держателе.
- Светодиодные массивы (см. Рисунок 1).
- Четыре руки шланг охлаждающей жидкости, ~ 18 см длиной, прикреплены к платформе барельефыэлектронной использованием разъема шланг охлаждающей жидкости. Шланг охлаждающей жидкости используется только в качестве структурной поддержки и не используется для целей охлаждения.
- Правильно расположенные канавки нарезать последний кусочек шланга охлаждающей жидкости из каждой рукой, чтобы прикрепить радиатор к концу каждой руке.
- Синий светодиод Rebel Tri-Stars устанавливается на каждый радиатор использованием нарезанные тепловой липкой ленты. Carclo 18 ° Tri-объектив прикреплен к каждой Tri-Star.
- Светодиодные Tri-Stars подключены к BuckPuck DC драйверов и блока питания, как указано. Мы устроили нашу установку с каждой BuckPuck питание два Tri-Звезды в серии.
- Освещение всех четырех светодиодных Tri-Звезды на 700 мА дали освещения из 713 Вт / м 2 на нашей платформе.
- Камера: камера установлена на небольшой штатив и сосредоточились на верхней части платформы.
4. Анализ поведенческих
- Коротко обезболивания мух на льду.
- Поместите отдельные мухи в пипетку советов, с помощью липкой ленты, чтобы закрытьОба конца чаевых.
- После того, как мухи проснулись и активно изучают пипетки наконечник, удалите пленку и поместить пипеткой в паз в вертикальный держатель. Винт используется для защиты кончика пипетки на место и закрыть нижнюю часть чаевых.
- Как муха исследует пипетки чаевые (обычно 30 - 60 сек), начало записи камеры непосредственно перед муха выходит из наконечника на платформу.
- После того, как муха вышли на платформу, подождите 1-2 SECO, и включить синих светодиодов. Используйте таймер вручную измерять время, пока муха начинает полет.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Слепой летит выражения либо ChR2 или G105 драйвера только показывают низкую скорость взлета после их освещения с ярко-синим светом. Слепой летит выставлены с той же скоростью взлета независимо от освещения (рис. 2), предполагая, что эти взлетов было спонтанным, а не за счет освещения с голубым светом. Когда ChR2 выражается в Foma1 нейронов, однако, освещение синим светом вызывает бегство ответ. Более 50% из мухи испытания сняли в течение 1 сек освещения, и 75% в течение 5 сек (рис. 2). Напротив, только 10% от контроля мух сняла в течение 1 сек, а 20% в течение 5 сек. Как G105 Драйвер выражается как в Фома-1 нейроны и в γ-доля грибов тела, мы использовали драйвера конкретно выраженные в этой части тела гриба (201Y-Gal4) в качестве дополнительного контроля. Эти мухи выставлена скорость взлета похож на другие элементы управления выполнены (рис. 2), Что свидетельствует о том, что конкретно optogenetic активации Фома-1 нейроны вызвало бегство ответ.
Высокая скорость визуализации, принятые на 200 кадров в секунду optogenetically индуцированных ответов показал, что эти ответы были похожи на ткацком станке, вызвали бегство поведения (рис. 3). А именно, 90% летит снят подняли свои крылья перед взлетом (n = 30) 6. Кроме того, в последующие траектория полета была менее стабильной, чем добровольное взлета 10, с телом мух быть в несколько вертикальной ориентации (рис. 3), но более стабильна, чем гигантское волокно опосредованный ответ 9.
Рисунок 1. Экспериментальная установка показывающие платформы с вертикальным держателем и четыре шланга охлаждающей жидкости оружия проведении радиатора со светодиодным массивов прикреплены к ним., Настройка под окружающее освещение. B, настройка, когда светодиоды горят. С крупным планом зрения Tri-Star светодиод на радиаторе. D, крупным планом Tri-Star с три-объективом. E, схема драйвера Buckpuck и светодиодной цепи. F, схема для BuckPuck и светодиодной цепи.
Рисунок 2. Полезных гистограмма время побега скачок для линий экспериментальных и контрольных мух. Все летает экспресс-W + norpA, чтобы сделать их визуально слепых. "Фома-1" мухи имеют G105-Gal4 водителя; "MB" мухи-201Y Gal4 водитель, который управляет выражения в теле гриба.
Рисунок 3. Высокая скорость видео кадры из ChR2 индуцированные ответы побег. Кадры нумеруются секвенцииially с 5 мс между кадрами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы показали, optogenetic стимуляции побег поведения, купаясь свободно гуляющих мух в ярко-синий свет. Этот подход может быть легко адаптирована для изучения поведения в других свободно гуляющих мух, и можно масштабировать до больших платформ просто плитка светодиодных массивов мы использовали на большую площадь. Используя либо недорогую камеру, мы описали, или других имеющихся систем камеры, пользователь может адаптировать частоту кадров и пространственное разрешение изображений, полученных в соответствии с поведением интерес. Кроме того, наши изображений ограничено время после того, светодиоды горят, как синие светодиоды обеспечивают освещение для камеры, а также активация ChR2. Этого вполне достаточно для нашего поведения, но если положение или движение лету до светодиодная подсветка должно быть записано, дополнительные источники света предоставления сигналы в инфракрасном диапазоне, в сочетании с соответствующей фильтрацией камеры, могут быть включены.
_content "> Optogenetics было широко воспринято как неинвазивный способ манипулирования нейронной активности. Тем не менее, эта техника была в значительной степени недоступным для зрительной системы, как свет используется для активации ChR2 также будет активировать зрительные пути. Кроме того, использование optogenetics чтобы исследовать невизуальных поведение также может быть затруднено из-за мух phototactic ответов на яркие огни. использование мух norpA, которые визуально слепой позволяет использовать optogenetic инструментов в зрительной системы, а также предотвращает фототаксис от затемняя другие виды поведения.Этот протокол требует, чтобы ChR2 быть выражены в нейронах выбор, что мухи подавать все-транс-ретиналь, и что мухи быть залито ярким синим светом. Протокол был разработан встретился с этими требованиями, но еще не полностью оптимизирована. Например, мы считаем, что количество света, мы используем могли бы быть ярче, чем это необходимо, и, что более высокая концентрация всех-транс-ретиналь, или более кормления тиМне, может привести к более высокой скорости взлета. Мы не систематически исследовал эти параметры.
Фома-1 нейроны мы активируем находятся в lobula комплекс лету, и, таким образом, в непосредственной близости от задней поверхности мозга. Вполне возможно, что успех этого эксперимента зависит от нейронов близко к поверхности, а свет должен проникать через кутикулу лету, чтобы активировать ChR2. Таким образом, клетки, расположенные глубоко в мозгу не может быть успешно активирована с помощью этого метода.
G105 Драйвер выражается в кластере из 5 нейронов с каждой стороны зрительного доли, Фома-1 нейроны, а также в нейронах γ-доля грибов тела. К счастью, у нас был водитель, чтобы сделать контрольные эксперименты, чтобы устранить роли грибов нейронов тело в бегство поведения. Однако, независимо от активации всех 10 Фома-1 нейроны, необходимые для такого поведения, или есть только один или дваспецифические клетки являются достаточными, не может быть определено в это время. В качестве более конкретного драйвера разрабатываются, и межсекторного стратегии для ограничения выражения уточняются 1,14, мы ожидаем, чтобы быть в состоянии нейронов-мишеней с большей специфичностью.
Криптохромы являются фоторецепторы, участвующих в циркадных ритмов и моделей поведения, которые чувствительны к синему свету. В этом протоколе криптохромы, вероятно, активизируется синий свет используется для стимуляции ChR2. Это, кажется, не влияют на взлете поведение наблюдается здесь, как низкая скорость взлета в контрольной мух (для которого голубой свет активизирует криптохромы, но не ChR2 в Фома-1 нейроны) точно соответствует скорости взять -офф в контрольной летает без освещения или при освещении зеленым светом (которая не включает криптохромы). Тем не менее, для других поведения, которые более непосредственно связаны с криптохромы, это может оказаться проблематичным. Одним из возможныхулучшения, чтобы избежать этого может быть использование красное смещение channelrhodopsin, который активируется желтый, 589 нм, свет 15.
В наших экспериментах мы наблюдали низкий уровень спонтанных взлетов такой, что ~ 10% от контрольных мух сняла в течение 1 сек светодиодной подсветкой, и 13-28% в течение 5 сек. Как мы наблюдали эту же скорость взлета, когда мухи были освещены зеленый свет, который не эффективно активировать ChR2, а также мухами без освещения, мы считаем, что это было спонтанное рейсы, нежели свет индуцированного взлетов. Эффект ChR2 активации Фома-1 нейроны на побег поведение должно быть измерено на вершине этой спонтанной активности. Для других типов поведения, которые не связаны взлет, однако, это может привести к прекращены испытания, если мухи уйти от платформы до выполнения испытания поведения. В какой степени эти спонтанные побеги представляют собой экспериментальную неудобство заключается в obviously зависит от сроков поведения интерес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась стипендий Стэнфордского Дин (SEJdV), Национальные институты здравоохранения Pioneer Award директора (TRC DP0035350), премии Фонда Мак-Найт ученого (TRC) и R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
