Summary
Genetik olarak kodlanmış optogenetic araçları belirli nöronların noninvaziv düzenlenmesini sağlayan
Abstract
Genetik olarak kodlanmış araçlar giderek artan sayıda Drosophila melanogaster 1 belirli nöronların nöral aktivitenin non-invaziv manipülasyon izin verdiği kullanılabilir hale gelmektedir. Bunların arasında en önemlisi parlak bir ışık kullanarak sağlam ve serbestçe hareket hayvan belirli nöronların aktivasyonu veya susturulması etkinleştirmek optogenetic araçları vardır. Channelrhodopsin (ChR2) mavi ışık ile aktive edildiği zaman, bu ifade nöronların depolarizasyon neden, bir ışık aktif katyon kanalı. ChR2 gibi CO 2 kaçınma, hortum uzatma ve dev-fiber aracılı irkilme tepkisi 2-4 gibi belirli davranışlar için kritik nöronlar belirlenmesi için etkili olmuştur. Bununla birlikte, aynı zamanda ChR2 teşvik fotoreseptör uyarmak için kullanılan yoğun ışık kaynağı olarak, bu teknikler, daha önce optogenetic görsel sisteminde kullanılan edilmemiştir. Burada, demo fototransdüksiyon bozar bir mutasyon ile optogenetic yaklaşım birleştirmeksinek optik lob, Foma-1 nöronlarda tezgah duyarlı nöronların bir küme aktivasyonunun nstrate, çarpışmayı önlemek için kullanılan bir kaçış davranışı sürebilirsin. Bu fototransdüksiyon kaskadı önemli bir bileşeni bir boş alleli kullanılan norpA geni tarafından kodlanan fosfolipaz C-β, kör sinekler vermek ve aynı zamanda Foma-1 ChR2 ifade sürmek için gal4-UAS transkripsiyon aktivatörü sisteminin kullanılması nöronlar. Bireysel sinekler mavi LED'ler ile çevrili küçük bir platform üzerine yerleştirilir. LED'ler yandığında, görsel tahrik tezgah-kaçış davranışına benzer bir şekilde, uçuş içine hızlı take-off uçar. Biz bu tekniği kolayca serbestçe sinek hareketli diğer davranışlarını incelemek için adapte edilebilir inanıyorum.
Introduction
Genetik olarak kodlanmış araçlar büyüyen cephanelik Drosophila melanogaster 1 belirli hücrelerde nöral aktivitenin işlemek için geliştirilmiştir. Bu araçlar sağlam ve serbestçe hareket hayvan belirli nöronların noninvaziv aktivasyonu veya susturulması etkinleştirin. Bu zamansal olarak kontrol edilen ve hızlı bir şekilde indüklenen olabilir çünkü bu arasında, Channelrhodopsin2 (ChR2), bir ışık ile aktive olan katyon kanalı, önemli avantajlar sunmaktadır. Zaman ekspres ChR2 hızla depolarize ve 3-5 yükseltilmiş ateş oranları sergilerler parlak mavi (470 nm) ışığa maruz nöronlar. Serbestçe hareket eden hayvanlar belirli nöronların Böyle hedeflenen aktivasyonu gibi CO 2 kaçınma 3, hortum uzatma 2,4, ve dev-fiber aracılı irkilme yanıtları 4 sıra davranışları özellikle nöronların yeterliliğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, ChR2 uyarmak için gerekli yoğun ışık kaynağı olarak da op uygulayarak, fotoreseptör teşvikgörsel sisteme togenetic teknikleri sınırlı kalmıştır. Fototransdüksiyon bozar bir mutasyon ile optogenetic yaklaşımla birleştirerek, biz sinek optik lob nöronların belirli bir küme aktivasyonu çarpışması 6 önlemek için kullanılan kaçış davranışının sürebilirsin olduğunu göstermiştir.
Çoğu, hepsi değilse de, görsel hayvanlar yaklaşan nesneler ile çarpışmaları önlemek için bir kaçış davranışı sergilerler. Giderek kötüleşen çarpışma sunulduğunda, sinekler Yürüyüş veya sabit, uzak yaklaşmakta çarpışma 7-9, uçuş içine take-off. Bu take-off take-off ve istikrarsız bir uçuş yörüngesini 10,11 öncesinde gündeme kanatları ile karakterizedir. Bu yanıt dev fiber aracılı irkilme tepkisi, kaldırdı kanatları önünde olmayan atlar ayrıdır ve genellikle bir serbest düşme takla 4,9 sonuçlanabilir. Uniqu olan optik lob, Foma-1 nöronlar içinde tezgah duyarlı nöronların belirli bir küme tespit ettikten sonraely yaklaşan nesnelerin kodlamak için ayarlanmış, biz sinek tezgah kaçış davranışları katılımlarını soruşturma istedi. İşte biz seçici bu nöronların etkinleştirmek ve sinek kaçış davranışı ortaya çıkarmak için optogenetics kullanımını göstermektedir.
Biz Foma-1 nöronlarda ChR2 ifade sürücü gal4-UAS transkripsiyon aktivatörü sistemini kullanın. ChR2 kofaktör all-trans-retinal gerektirir ve bu Drosophila merkezi sinir sisteminde düşük seviyelerde bulunan olarak sineklerin diyet takviye edilmelidir. Parlak ışık ChR2 aktive etmek için kullanılan ve sinekler kuvvetli phototactic davranışlarda olduğu gibi 3,4 12, biz uyarana görsel bir tepki olasılığını ortadan kaldırmak için çalıştı. Bunu yapmak için, biz fototransdüksiyon kaskad kritik bir bileşeni, fosfolipaz C-β kodlar norpA gen, bir null alleli için homozigot mutant olduğunu hayvanlar kullanılmaktadır. Böyle mutant sinekler Fotoreseptörler sorumluluğu edemiyoruzd 13 yakılır. Kaçış yanıt optogenetic stimülasyon test etmek için, tek bir sinek yalıtmak ve parlak mavi ışık içinde yıkanmak gerekir. Bunu yapmak için, biz pipet ipuçları bireysel sinekler yerleştirin. Bir pipet ucu sinek geotactically ucu kadar yürüyecek böyle ve dışarı dikdörtgen bir platform üzerine özel bir tutucu, yerleştirilir. Sinek serbestçe bu platformun üstünde dolaşmak mümkün. Platformu platformu üstüne odaklanmış dört mavi LED dizileri, her birinde 3 adet led ile çevrilidir. Sinek platformda sonra, LED'ler yanıyor ve sinek tepkisi, yüksek hızlı kamera 6 kullanılarak kaydedilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Channelrhodopsin Sinekler Oluştur
- Sizin seçtiğiniz gal4 sürücüsü ile Çapraz UAS-ChR2 sinekler, biz optik lobda Foma-1 nöron olarak ifade edilir G105-gal4 kullanın.
- Mavi ışık uyarılması için görsel bir tepki olasılığını ortadan kaldırmak için, iki sinek hatları aw + norpA arka planda bulunmaktadır.
- Sonuç: w + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Erişkin eclose uçar sonra, davranışsal tahlil yapmadan önce 3 gün boyunca 10 uM all-trans-retina (ChR2 için gerekli bir ko-faktör) ve ışıktan koruyarak ile desteklenmiş, taze gıda, seçilen kadın koymak.
2. 10 uM All-trans-retinal Geliştirilmiş Yemek Yap
- 20 mM retina yapmak için% 95 etanol 17.6 ml all-trans-retinal 100 mg çözülür. All-trans-retinal her zaman ışıktan koruyarak saklayınız.
- Mikrodalga standart mısır unu sinek gıda eritin ve sıcak dokunma kadar soğumasını bekleyin.
- 20 mM 50 ul karıştırılırUçucu gıda 10 ml şişe içine tüm-trans-retina.
- Şişeleri serin ve ışıktan korunmalıdır tutalım.
3. Ekipman
- Pipet ipuçları: Standart 1.000 ul pipet ipuçları ~ 2.25 mm gözenek çapı oluştururken, ucuna yakın kesilir.
- Platformu (bkz. Şekil 1).
- Bir Delrin tabanı, 17 cm X 25 cm, ¼ "NPT soğutucu hortum konnektörleri sığması için her köşesindeki dişli delikler ile inşa edilmiştir.
- Kemik yapılan dikey bir tutucu, baz merkezine takılır. Kaba ölçüler X 40 mm X 65 mm (genişlik x derinlik x yükseklik) 25 mm. A 10 mm genişliğinde oluk altındaki bir başparmak vida ile, sahibinin uzunluğu çalışır. Bir platform sahibinin üst bağlı, 25 mm X 40 mm tutucu oluk ile uyumlu 3,5 mm çapında delik X 10 mm. Olan
- LED diziler (bkz. Şekil 1).
- Soğutucu hortumunu Dört kol, ~ 18 cm uzunluğunda, platformu bas yapıştırılmışSoğutucu hortumu konektörü kullanarak e. Soğutma hortum yapısal destek olarak kullanılır ve soğutma amaçları için kullanılır.
- Düzgün aralıklı oluklar her kol sonuna yapıştırmayın bir soğutucu her kolun hosing soğutucu son parça halinde kesilir.
- Mavi LED Rebel Tri-Yıldız pre-cut termal yapışkan bant kullanarak her soğutucuya monte edilir. A Carclo 18 ° Tri-lens Her Tri-Star yapıştırılmıştır.
- LED Tri-Yıldız BuckPuck DC sürücüleri ve olarak belirtilen bir güç kaynağına bağlanır. Biz her BuckPuck seride iki Tri-Yıldız güç ile set-up ayarladım.
- Dört Aydınlatılması 700 Tri-Yıldız LED mA bizim platformu üzerinde 713 W / m 2 'lik bir ışınım vermiştir.
- Kamera: Kamera küçük bir üçayak üzerine monte edilmiştir ve platform üstüne odaklanmıştır.
4. Davranış Testi
- Kısaca buz üzerinde sinekler uyutmak.
- Kapatmak için bant kullanarak, pipet ipuçları bireysel sinekler yerleştirinHer iki ucu sona erer.
- Sinekler uyandı ve aktif pipeti ucu keşfetmek sonra, bandı çıkarın ve dikey tutucu oluk bir pipet yerleştirmek. Kelebek vida yerinde sabitlemek için pipet ucu ile ucunun alt kapatmak için kullanılır.
- Sinek pipeti ucu (genellikle 30 - 60 sn) araştırıyor, sinek platformu üzerine ucu çıkar hemen önce kamera kayıt başlar.
- Sinek platformu üzerine ortaya çıkmıştır sonra, 1-2 seco bekleyin ve mavi LED'ler açın. Sinek uçuşu başlatana dek elle süreyi ölçmek için bir zamanlayıcı kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kör ya ChR2 veya tek başına G105 sürücü parlak mavi ışık ile aydınlatma aşağıdaki take-off oranının düşük olduğunu göstermektedir ifade uçar. Kör bu take-off mavi ışık ile aydınlatma nedeniyle spontan vardı ziyade düşündüren, bağımsız aydınlatma (Şekil 2) take-off aynı oranda sergilenen uçar. ChR2 Foma1 nöronlarda eksprese edilir, ancak, mavi ışık ile aydınlatma kaçış yanıt verilmesini sağlar. Test sinekler üzerinde% 50 aydınlatma 1 saniye içinde çıkardı ve 5 saniye içinde% 75 (Şekil 2). Buna karşılık, kontrol sinekler sadece 10% 1 saniye içinde çıkardı ve 5 saniye içinde% 20. G105 sürücü Foma-1 nöronlarda ve mantar vücut γ-lob hem de ifade edildiği gibi, özellikle ilave bir kontrol olarak mantar gövde (201Y-gal4) bu bir parçası olarak ifade edilen bir sürücü kullanılır. Bu sinekler (Şekil 2 gerçekleştirilen diğer denetimleri benzer take-off bir oran sergiledi), Foma-1 nöronların optogenetic aktivasyon kaçış yanıtı ortaya çıkardı olduğunu özellikle belirten.
Optogenetically uyarılan yanıtların saniyede 200 kare çekilen yüksek hızlı görüntüleme bu tepkileri tezgah-uyarılmış kaçış davranışının (Şekil 3) benzer olduğunu ortaya çıkardı. Yani uçar% 90 öncesinde take-off (n = 30) 6 için kanatlarını kaldırdı filme. Ayrıca, izleyen uçuş yörüngesini sinek vücudunun biraz dikey (Şekil 3) olmak üzere, take-off gönüllü 10 daha az stabil oldu, ama dev lif aracılı yanıtları 9 daha stabil.
Şekil 1. Dikey tutucu ve onlara yapıştırılmış LED dizileri ile ısı alıcıları tutarak kollarını hosing dört soğutucu platformu gösteren set-up Deneysel. A, Ortam aydınlatması altında set-up. B, set-up LED'ler yanıyor zaman. C, ısı alıcı üzerindeki LED Tri-Star bir kadar yakın bir görünüm. D, tri-objektif takılı olan Tri-Star kadar yakın. E, Buckpuck Sürücü ve LED devresinin bir şematik. F, BuckPuck ve LED devresi için devre şeması.
Şekil 2. Deney ve kontrol sinek hatları için kaçış atlayışı zaman Kümülatif histogram. Tüm sinekler ekspres w + norpA onları görsel olarak kör hale getirmek. "Foma-1" sinekler G105-gal4 sürücüsü var; "MB" sinek mantar vücut ifade sürücüler 201Y-gal4 sürücüsü var.
Şekil 3. ChR2 indüklenen kaçış yanıtların Yüksek hızlı video kareleri. Çerçeveler sequent numaralandırılırially kareler arasındaki 5 msn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz parlak mavi ışık sinek yürürken serbestçe yıkanan tarafından kaçış davranışları optogenetic stimülasyonu göstermiştir. Bu yaklaşım kolayca serbestçe dolaştıklarını sineklerin diğer davranışlarını incelemek için adapte edilebilir ve sadece biz daha geniş bir alana kullanılan LED diziler döşeme daha büyük platformlar için ölçeklendirilebilir. Kullanıcı terzi, biz tarif ucuz kamera, ya da diğer mevcut kamera sistemleri ya kullanarak, görüntülerin kare hızı ve uzaysal çözünürlüğü ilgi davranışı uygun satın aldı. Mavi LED'ler kamera gibi ChR2 aktivasyonu için aydınlatma sağlamak gibi ışıklar aydınlatılır sonra ilaveten, görüntüleme zaman ile sınırlıdır. Bu bizim davranış için yeterli olduğunu, ancak önceki LED aydınlatma için sineğin pozisyonu veya hareketi kaydedildi gerekiyorsa, kamera uygun filtreleme ile birlikte kızılötesi aralığında, sinyaller veren Ek ışık kaynakları dahil edilebilir.
_content "> Optogenetics yaygın nöral aktivitenin işlemek için bir non-invaziv yöntem olarak selamladı olmuştur. Ancak, bu tekniğin ayrıca görme yolları aktive edecek ChR2 etkinleştirmek için kullanılan ışık gibi görsel sistem büyük ölçüde kullanılamaz olmuştur. Ayrıca, optogenetics kullanımı görsel olmayan davranışları araştırmak için de parlak ışıklara sinekler 'phototactic yanıtları tarafından engel olabilir. görsel kör norpA sinekler kullanımı bize görsel sistemdeki optogenetic araçları kullanmanıza olanak sağlar ve diğer davranışları engellemeyecek gelen phototaxis önler.Bu protokol ChR2 sinekler all-trans-retinal beslenen olması, seçim nöronlarda eksprese edilmesi ve sinekler parlak mavi ışık içinde kalmış gerektirir. Geliştirilen protokol bu gereklilikleri yerine getirdiğini, henüz tam olarak optimize edilmemiştir. Örneğin, biz kullanan ışık miktarını gerekli daha parlak olması, ve all-trans-retinal, ya da daha uzun bir yüksek konsantrasyonda ti besleyen olabilir inanıyorumBana, take-off yüksek oranda neden olabilir. Biz sistematik olarak bu parametreler keşfedilmeyi değil.
Aktif hale Foma-1 nöronların sinek lobula kompleks olarak bulunur, ve böylece beynin arka yüzeyine yakın konumda bulunmaktadır. Bu ışık ChR2 etkinleştirmek için sinek manikür nüfuz gerekir gibi bu denemenin başarısı, yüzeye yakın olan nöronlar dayanıyor olması mümkündür. Böylece, beyinde derin alan hücreler bu yöntemle başarı ile aktive olabilir.
G105 sürücünün optik lobun her bir tarafında 5 nöronların bir küme olarak ifade edilir, Foma-1 nöronlar, hem de mantar vücut γ-lob nöronlar gibi. Neyse ki, kaçış davranışı mantar vücut nöronların rol ortadan kaldırmak için kontrol deneyleri yapmak için bir sürücü vardı. Bununla birlikte, her olup olmadığını 10 Foma-1 nöronların aktivasyonu olup olmadığını bu davranış için gerekli olan, ya da sadece bir veya ikiBelirli hücreleri yeterli, şu anda tespit edilemez. Daha özel sürücüler geliştirilmekte ve ifade sınırlandırılması için intersectional stratejiler 1,14 rafine edilir, biz daha fazla özgüllük ile nöronlar hedef edebilmek bekliyoruz.
Kriptokrom sirkadiyen ritimler ve mavi ışığa duyarlı davranışları dahil fotoreseptör vardır. Bu protokolde, kriptokrom olasılıkla ChR2 uyarmak için kullanılan mavi ışık ile aktive edilir. Bu (mavi ışık Foma-1 nöronlarda ChR2 kriptokrom etkinleştirir ancak kendisi için) kontrol sinekler gözlenen take-off düşük oran olarak, burada gözlenen take-off davranışlarını etkilemek için görünmüyor yakından çekmek oranı eşleşir -off kontrolü gözlenen aydınlatma olmadan veya yeşil ışık (kriptokrom aktive değildir) ile aydınlatılmış uçar. Ancak, daha doğrudan kriptokrom etkilendiği diğer davranışları için, bu sorunlu kanıtlamak olabilir. Bir potansiyelBunu önlemek için gelişme sarı, 589 nm, 15 ışık ile aktive olan bir kırmızı-kaydırılmış channelrhodopsin kullanımı olabilir.
Deneylerde, biz spontan take-off öyle ki ~ kontrolü sineklerin% 10 LED aydınlatma 1 saniye içinde çıkardı ve 5 saniye içinde 13-28%. Düşük düzeyde gözlenen Sinekler etkili herhangi bir aydınlatma olmadan ChR2 yanı sıra sinekler aktive etmedi yeşil ışık ile aydınlatılmış zaman biz take-off bu aynı oranda görüldüğü gibi, bu kendiliğinden uçuşlar ziyade ışık indüklenen take-off olduğuna inanıyorum. Kaçış davranışı üzerindeki Foma-1 nöronların ChR2 aktivasyon etkisi bu nedenle bu spontan aktivite üzerinde ölçülür. Sinekler önce test davranış uygulama için platform kaçmasına Bununla birlikte, çıkarma ilgisi olmayan diğer davranışları için, bu iptal çalışmalarda neden olabilir. Bu kendiliğinden kaçar deneysel bir rahatsızlık temsil ölçüde obvio olduğunuilgi davranışı ölçeğinde usly bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Stanford Dekanlık Bursu (SEJdV), Sağlık Müdürü Pioneer Ödülü bir Ulusal Sağlık Enstitüleri (TRC DP0035350), bir McKnight Vakfı Scholar Ödülü (TRC) ve R01 EY022638 (TRC) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼" NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 | |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
