Summary
确定供体细胞移植在小鼠骨髓移植模型中，缺乏定义的表型标记提出了挑战。我们描述了一种方法来量化男性捐赠者的细胞植入女性移植受体小鼠。此方法可用于研究HSC功能在所有的小鼠品系。
Abstract
小鼠骨髓移植模型提供了一个重要的工具，在测量造血干细胞（HSC）功能，并确定基因/分子，调节造血干细胞。在这些移植模型系统，是由这些细胞的能力，嫁接和重组致死剂量照射的受体小鼠的造血干细胞的功能。一般情况下，供体细胞的贡献/植活测定用流式细胞仪供体特异性的细胞表面蛋白的抗体。然而，该方法在很大程度上依赖于特异性和区分来自供体的细胞的细胞表面标志物的能力，从收件人起源的细胞，这可能不是可用于所有的小鼠品系。考虑到各种不同的背景在市场上的转基因小鼠品系，该细胞表面/流量流式细胞仪为基础的方法具有显着的局限性，特别是在缺少界定良好的从同类系收件人策单独的供体细胞的表面标志物的小鼠品系LLS。在这里，我们报道了基于PCR的技术来确定移植的受体小鼠的体细胞移植/贡献。男性捐赠者的骨髓造血干细胞移植到致死剂量照射的同源雌性小鼠。在不同时间点移植后外周血标本收集。在实验结束后获得的骨髓标本。分离基因组DNA和Y染色体的特定基因，Zfy1，采用实时定量PCR扩增。在女性受体小鼠的植入男性捐赠者来源的细胞对标准曲线的男性与女性的DNA与已知的百分比计算。 Bcl2蛋白被用作参照基因正常化的总DNA量。我们的数据表明，这种方法可靠地确定供体细胞植入，并提供了一个有用的，但简单的方法，测量造血干细胞重建小鼠骨髓移植模型。我们的方法可以在大多数实验室常规进行的，因为没有需要昂贵的设备，如流式细胞仪。
Introduction
小鼠骨髓（BM）移植模型最早是在20世纪60年代1。这个模型已被广泛用于造血干细胞（HSC）在宿主受体小鼠的生物学研究。小鼠骨髓移植模型为我们提供了宝贵的知识HSC功能及其调控，造血干细胞的研究是必不可少的。异基因骨髓移植模型，例如C57BL/6J H2B-BALB / C的H2D或同源移植模型如C56Bl/6J CD45.2 B6.SJL CD45.1中使用的许多实验室研究基因的功能，影响HSC活动2 HSC功能3或移植相关的疾病，如移植物抗宿主病（GvHD）4上的药物治疗。
通常用于区分来自供体的细胞，从收件人-起源的细胞的细胞表面标志物，如MHC单倍型或CD45.1。 C57BL/6J H2B，CD45.2 H2D和B6.SJL的CD45.1是最常用的小鼠品系，在骨髓移植的供体细胞的贡献，因为可以很容易地用流式细胞仪，CD45.1 与 CD45.2或H2B与评估H2D。 FVB / NJ 5 C3H然而，许多其他菌株也经常被用来生成基因工程转基因或基因敲除小鼠。这些小鼠可回交自交系和保持在混合的遗传/ MHC背景。在这种情况下，确定供体细胞移植和造血干细胞的功能可能是困难的，因为供体特异性的细胞表面标志物可能无法使用。
Y-染色体特异DNA探针来检测Southern杂交性别不匹配的骨髓移植供体雄性细胞最早是由美和博士的研究小组6。然后，在实时PCR的性别决定区Y被认为是准确的和高度特异性的方法来定量毫安乐胎儿细胞在母体血液系统7。这个概念被改编由博士Schwarzenberger的研究小组开发的实时PCR技术在小鼠骨髓移植模型，以确定供体细胞植入8。我们进一步修改FVB / NJ小鼠骨髓移植模型中的体细胞移植的测量方法。这种方法是目前广泛使用于本集团PIM1激酶在造血干细胞生物学作用的研究。
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Protocol
1。骨髓细胞分离
- 安乐死男性捐赠者FVB / NJ小鼠和雌性FVB / NJ小鼠使用CO 2的方法，随后用颈脱位。竞争力的细胞将被用作阴FVB / NJ骨髓细胞。
- 用小剪刀和镊子，解剖小鼠和股骨和tibiaes，将它们放置在60毫米组织培养皿含6毫升冰冷的5％热灭活FBS培养液。使用kimwipe组织，去除肌肉和其他组织。在盘子里，切断两端的每个骨干。
- 用23G针3毫升注射器的一端连接的骨，冲洗掉骨髓与5％热灭活FBS的RPMI1640入菜。个体骨髓组织中重复使用同一个针头的愿望。细胞悬浮液转移到15毫升离心管中。
- 降速的细胞在400×g离心5分钟，除去上清液，细胞悬浮在1ml室温红血细胞溶解缓冲液（155毫米Potassium碳酸氢钠，氯化铵的10mM，0.1mM的EDTA，PH = 7.4），并在室温下孵育5分钟，然后加入5-10毫升，用5％热灭活的FBS的RPMI 1640。
- 通过细胞通过细胞过滤网。收集流过到新的试管中。自旋向下的5分钟，于400×g。去除上清，细胞沉淀，不应该包含任何红色。红色的情况下指示一个完整的红血细胞的去除。与5％热灭活的FBS，细胞沉淀重悬在10毫升的RPMI1640。轻轻涡旋以确保细胞悬浮液是完全均匀的。分装在一个血球细胞计数。计算多少体积所需的骨髓移植和等分试样足够的细胞的细胞，并与竞争对手的雌性细胞在以5:2的比例混合男性供体细胞。降速在400×g离心5分钟，用PBS洗涤，重悬浮在PBS中的供体细胞的最终浓度在5×10 6个 / ml和竞争对手的细胞以2×10 6个
2。竞争骨髓移植
- 照射雌性受体小鼠（8-12周龄），铯-137伽玛射线散热器在一个单一的剂量为11Gy骨髓移植前的4-6小时。
- 放置在小鼠阻挡照射的雌性小鼠。经尾静脉注入混合的供体和竞争对手的细胞在0.1毫升的总体积，使得每个鼠标接收5×10 5个供体细胞和2×10 5的竞争对手骨髓细胞。
3。样品采集
情侣周后，骨髓移植，收集雌性受体小鼠外周血样本（约50微升）从麻醉状态下的眼窝出血。样品被收集到EDTA涂层管。 BM样品也被收集在实验结束时，通常至少为4个月后移植，用相同的方法与前面描述的（步骤1），通常为20-40％的1胫骨骨髓细胞足以让足量的DNA。也收集血液或骨髓样本从年龄匹配的正常雌性和雄性小鼠制备标准曲线。
4。基因组DNA提取
- 加入4倍体积的：室温红细胞裂解缓冲液（200微升），各血液试样。搅拌均匀，室温孵育5分钟。加入1毫升的PBS，然后停止旋转，以去除大部分的裂解RBC的。
- 使用血液DNA提取试剂盒（QIAmp DNA血液提取试剂盒）提取DNA。预温（AE）的洗脱缓冲液在37℃下洗脱的DNA，以提高产率。同样是孤立的男性和女性DNA的标准曲线。
- （可选）的基因组DNA可以进一步纯化，或在3 M醋酸钠（pH = 5.5）的存在下，用乙醇沉淀法浓缩。然后将DNA沉淀再悬浮在40-50微升蒸馏水立即进行分析，或储存在-20℃下，以备将来使用。
- 测量的DNA concentr“ATION的NanoDrop ND-1000光谱光度计。样品OD 260/280之间的,1.8-2 .0用于进一步的分析。
- 稀释的DNA与DNA酶游离H 2 O以4ng/μl在总体积为50μl。
5。标准曲线的制备
男性DNA和女性DNA稀释4纳克/微升的浓度，并根据表1的DNA混合物中
| ％的女性背景的男性DNA | 4ng/μl男性DNA的体积（μl） | 4ng/μl女性DNA的体积（μl） | 总体积（μl） |
| 0.2 | 1 | 499 | 500 |
| 0.5 | 1 | 199 | 200 |
| 2.5 | 5 | 195 | 200 |
| 12.5 | 25 | 175 | 200 |
| 50 | 100 | 100 | 200 |
| 87.5 | 175 | 25 | 200 |
| 100 | 200 | 0 | 200 |
表1。样品制备标准曲线。正常男性和女性的FVB / NJ小鼠在年龄8 12wks的牺牲。收集血液和骨髓细胞。从雄性细胞和雌性细胞的DNA中分离出，并将其再悬浮在浓度4ng/μl。男性和女性的DNA在不同的比例混合，以产生DNA标准样品混合物。
6。实时PCR
- 设置PCR SYBR Green超与引物和基因组DNA的试剂混合的反应板。反应体积（20微升）包含400 nM的各引物和5微升的血细胞的基因组DNA（4ng/μlX5的微升= 20毫微克）在每一个反应。 DNA桑普成立于一式三份文件和标准。引物序列示于表2。
| 基因名称 | 前 | 逆转 |
| Bcl2的 | 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA | 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG |
| Zfy1 | 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA的 | 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC |
表2中。RT-PCR引物序列Bcl2和Zfy1小鼠。
- 进行PCR反应，使用Biorad公司iQ5 PCR机具备以下条件：95℃3分钟，42个扩增循环：95°C为10秒，58℃下为25秒和72℃，持续15秒，然后通过熔融曲线步骤。
- 获取由Bio-Rad iQ5 2.1标准版光学系统的循环阈值（Ct）值。计算ΔCT（CT Zfy1 </ SUP>-CT Bcl2的 ）值，和Zfy1表达水平的计算公式为2-δCT值的。
- 建立标准曲线，从已知的男/女标准混合使用2-ΔCT阅读的每个系列反应。所产生的标准曲线绘制2-ΔCT值的平均值的一式三份的已知％男性DNA的混合物用线性回归拟合。
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Representative Results
图1和图2显示对男性的DNA的百分比，平均2-ΔCT值绘制标准曲线的例子， 图1A中显示的特定的熔点温度Bcl2和Zfy1的扩增子定位于78.5℃和88.5℃，分别。 Bcl2蛋白被用作参照基因正常化加载的每个PCR反应的DNA的总量。 Bcl2的扩增曲线（日志视图），对于每个标准样品合并男性DNA浓度与彼此独立，表示加载的DNA（ 图1B）的等量。然而，Zfy1迁移的扩增曲线的左侧，与男性的DNA样品中的量的增加（ 图1C）。为了验证我们的方法，我们测试的男性捐赠者的细胞植入WT 与 PIM三基因敲除小鼠（TKO）在不同时间点移植后小鼠骨髓细胞移植。周边的血（6wks）和BM的样品（16wks）瓦特 ERE进行了分析。造血干细胞从PIM将军澳小鼠有缺陷的重组致死剂量照射的小鼠（AN，N 等人 ，稿件修改）。正如预期的那样，与皮姆将军澳细胞移植的受体小鼠移植小鼠与野生型细胞（ 图3）相比，有低得多的百分比的雄性细胞。
图1（A）代表从多个样品的熔解曲线与不同的男性DNA百分比。在78.5的峰表明了Bcl2的扩增，而在88.5℃的峰值C表示扩增ZFY-1。代表多个样品的扩增曲线，与不同的男性DNA Bcl2的（B）和Zfy1（C），CT：循环阈值的百分比。=“http://www.jove.com/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg”目标=“_blank”>点击这里查看大图。
图2。男性DNA百分比的RT-PCR检测的标准曲线。男性和女性DNA的混合物从骨髓细胞获得的样品（20 ng的DNA在20μl的总体积）中描述的协议用于RT-PCR进行了处理。 ΔCT（衣原体Zfy1-CT Bcl2蛋白 ）为个别样品的平均值进行了计算和2-δ的CT（Y-轴）对男性DNA百分比（X-轴）作图（范围从0.2％到100％），用线性回归恰当不过了。 R2代表的决定系数。
图3。竞争骨髓移植经验riments。 5×10 5总骨髓细胞从男性的WT或年龄匹配的男性的，皮姆三KO（TKO）随着2×10 5女选手骨髓细胞的小鼠被移植到照射的女主持人。外周血（PB）嵌合体在第6周和BM嵌合体在移植后16周，估计由男性的DNA的百分比通过RT-PCR为谴责在协议（* P <0.05，** P <0.01）。
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Discussion
我们目前的研究目标是提供观众一个基于PCR技术定量供体细胞移植在竞争激烈的小鼠骨髓移植模型。一些研究已经用RT-PCR检测供体细胞移植模型9-10。第一博士Schwarzenberger的研究小组开发出了小鼠骨髓移植模型，采用实时PCR扩增Y染色体特定的8。这种方法被用来研究GLI-1在造血干细胞的功能活动11。然后，我们进一步修改了协议，在可视化的格式，并提供了一个详细的，一步一步的实验方案。我们的协议的可视化演示，使观众能够轻松地按照我们的协议。我们还比较了从骨髓样本与DNA从外周血基因组DNA的PCR结果。供体细胞植入从骨髓和血液样本的数据是基本一致的，但是，通常较小的变化被发现在骨髓样本。这是可能是由于在外周血中，可能会损害的血液样本中的基因组DNA的纯度/质量红细胞裂解后残留血红蛋白。
与我们的PCR为基础的技术有几个优点量化供体细胞的植入。第一;我们的技术可以在大多数的实验室中进行。有没有必要专门的和昂贵的设备以外的实时PCR机。我们进一步修改PCR反应成分和使用，而不是荧光定量SYBR Green超。这种变化进一步降低了成本和费用，我们消除了荧光标记的探针。第二，我们的技术是可靠，重现性好。我们使用Bcl2的参照基因正常化反对DNA定量试剂盒的总DNA量。 Bcl2的基因，因为：1）没有位于Y染色体上，这种基因是使用。因此，其表达不影响男性捐赠者的细胞植入。 2）。根据目前的移植条件Bcl2的不规范。为SH自己的在图1中，Bcl2的基因产生一个可靠的和高度一致的控制独立加载的男性DNA量的总DNA加载。 zfy1睾丸决定区域12内是一个锌指蛋白基因，并位于Y染色体上的。据报，该基因的表达水平的Zfy1很好地对应于男性细胞在小鼠移植模型8的 DNA的量。第三，我们的PCR为基础的技术是高度敏感的，而且可以检测到供体细胞移植在<1％。此外，样品可以保存以供日后分析的很长一段时间。与此相反，传统的基于流式细胞术的方法需要立即样本处理。最后，我们的方法是独立于小鼠品系，并可以用于遗传背景，缺乏明确定义的分开从受体细胞的供体细胞的表面标志物。这是这种方法的最重要的优势。
根据我们目前的实验条件下（供体/竞赛或比率是5/2），我们周围观察到80-90％的供体的植入在16周使用基于PCR的方法。我们的数据是相当与传统，流式细胞仪为基础的方法，表明〜95％的供体细胞植入16周后移植供体（CD45.2），/竞争对手（CD45.1）的比例为4:1 2。与常规的细胞表面标志物的方法，该方法使用检测供体细胞在受体小鼠相比，我们的方法的主要缺点是无法分析在各种血细胞，如B细胞，T细胞或粒细胞亚群的植入。然而，如果需要的话，它是能够收集每个人口的细胞，用细胞分选技术，然后受用于RT-PCR的样品，以确定每个细胞种群中的供体细胞的贡献。由于供体细胞植入计算出标准曲线的基础上，的样品读出标准曲线的斜率和y轴截距是完全依赖于。这是可能的，我们可以得到范围外READOUT（ 即超过100％的植入）。然而，这些“假阳性或假阴性”结果可以可以避免的，如果：1）测试样品和标准曲线样品的DNA分离程序是相同的，以及2）标准曲线的选择的范围是接近预期的样本读数。此外，因为可能会出现在每个PCR反应中的差异和在PCR仪的校准状态，标准曲线样品应当被包括在每个PCR板，以避免每个PCR反应之间的差异。
最后，我们使用我们的PIM三KO小鼠证实了我们的技术。与以前的报告13，我们发现，从皮姆三基因敲除小鼠的供体造血干细胞是有缺陷的重组致死剂量照射的受体小鼠。
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Disclosures
我们没有竞争披露的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢查尔斯·格林伯格博士利用他的实时PCR仪。 MUSC霍林斯癌症中心的启动资金，霍林斯癌症中心的ACS IRG，ASCO征服癌症基金会事业发展奖，美国国立卫生研究院1K08HL 103780-01A1，和美国国立卫生研究院3P30CA138313-01S3这项工作是支持的。的内容完全是作者的责任，并不一定代表官方意见的国家机构的健康或其他资金剂。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
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