Summary
Determinación de quimerismo de células donantes presenta un reto en modelos de ratón trasplante de médula ósea que carecen bien definidos marcadores fenotípicos. Se presenta una metodología para cuantificar injerto macho donante de células en ratones hembras receptoras de trasplante. Este método se puede utilizar en todas las cepas de ratón para el estudio de funciones HSC.
Abstract
Murino de trasplante de médula ósea modelos constituyen una herramienta importante en la medición de células madre hematopoyéticas (HSC) y los genes que determinan las funciones / moléculas que regulan las CMH. En estos sistemas modelo de trasplante, la función de HSCs se determina por la capacidad de estas células a ratones injertan y reconstituir receptores irradiados letalmente. Comúnmente, la célula donante contribución / injerto se mide por los anticuerpos específicos de donante-proteínas de superficie celular por citometría de flujo. Sin embargo, este método depende en gran medida de la especificidad y la capacidad del marcador de superficie celular para diferenciar las células derivadas del donante de células receptoras originados, que pueden no estar disponibles para todas las cepas de ratón. Teniendo en cuenta los diversos antecedentes de cepas de ratón genéticamente modificados en el mercado, esta superficie de la célula / citometría de flujo basado en el método tiene limitaciones importantes, especialmente en las cepas de ratón que carecen bien definidos marcadores de superficie de células donantes separados de congenic destinatario cells. Aquí, se informó de una técnica basada en PCR para determinar quimerismo de células donantes / contribución en los ratones receptores de trasplante. Hemos trasplantado machos donantes de médula ósea a HSCs irradiados letalmente ratones hembra congénicos. Muestras de sangre periférica fueron recolectadas en diferentes tiempos después del trasplante puntos. Muestras de médula ósea se obtuvieron al final de los experimentos. ADN genómico se aisló y el gen específico de cromosoma Y, Zfy1, se amplificó utilizando PCR en tiempo real cuantitativa. El injerto de los machos células derivadas del donante en los ratones receptores hembra se calculó contra curva estándar con un porcentaje conocido de los ADN macho contra hembra. Bcl2 se utilizó como gen de referencia para normalizar la cantidad de ADN total. Nuestros datos sugiere que este enfoque fiable determina quimerismo de células donantes y proporciona un método útil, pero sencillo en la medición de la reconstitución de células hematopoyéticas en modelos murinos trasplante de médula ósea. Nuestro método puede ser realizada de forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios porque noequipos costosos tales como la citometría de flujo se requiere.
Introduction
Murino médula ósea (MO) trasplante modelo fue desarrollado por primera vez en 1960 1. Este modelo se ha usado ampliamente para el estudio de células madre de un donante hematopoyéticas (HSC) biología en un ratón receptor host. Médula ósea murina modelo de trasplante nos ha proporcionado valiosa información sobre las funciones de HSC y su regulación y es indispensable en la investigación HSC. Alogénico de médula ósea como modelo de transplante C57Bl/6J H2B-Balb / C H2d o modelo de trasplante congenic como C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 se utilizan en muchos laboratorios para estudiar la función de genes en la actividad HSC 2, el efecto de fármaco de tratamiento de enfermedades de función HSC 3 o trasplante relacionados, tales como la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) 4.
Marcadores de superficie celular tales como haplotipo MHC o CD45.1 son comúnmente utilizados para distinguir las células derivadas del donante de células receptoras-originaron. C57Bl/6J H2b, CD45.2 H2d y CD45.1 B6.SJL son las cepas de ratón más comúnmente usados en el trasplante de médula ósea debido a que la contribución de donantes de células pueden ser fácilmente evaluada por citometría de flujo midiendo vs CD45.1 o CD45.2 H2b vs H2D. Sin embargo, muchas otras cepas como FVB / NJ 5 y C3H también se utiliza a menudo para generar transgénicos o genéticamente ratones knockout. Estos ratones pueden ser retrocruzaron a una línea consanguínea y mantenido en una genético mixto / MHC fondo. En estos casos, la determinación de quimerismo de células donantes y la función HSC podría ser difícil como donante específico de células marcadores de superficie puede no estar disponible.
Utilizando Y-cromosoma sonda específica de ADN para detectar las células del donante masculino por Southern blot en el sexo no coincide el trasplante de médula ósea ha sido desarrollado por el grupo del Dr. Miwa 6. Entonces, una PCR en tiempo real para la región Y determinante del sexo se encontró que era un método preciso y altamente específico para cuantificar male células fetales en la sangre materna sistema 7. Este concepto fue adaptado por el grupo del Dr. Schwarzenberger para el desarrollo de una técnica de PCR en tiempo real en un modelo de trasplante de médula ósea murina para determinar quimerismo de células donantes 8. Hemos modificado adicionalmente este método para la medición de quimerismo de células donantes en FVB / NJ modelo de trasplante de médula ósea de ratón. Este método actualmente es ampliamente utilizado en nuestro grupo para estudiar el papel de Pim1 quinasa en biología HSC.
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Protocol
1. Bone Marrow celda de aislamiento
- Eutanasiar donantes masculinos FVB / NJ ratones y hembra FVB / NJ ratones utilizando CO 2 método seguido por dislocación cervical. La hembra FVB / NJ células de médula ósea se utiliza como células competitivas.
- Utilice pequeñas tijeras y pinzas, diseccionar el fémur y tibiaes de ratones y colocarlos en una placa de cultivo tisular de 60 mm que contiene 6 ml de helado de RPMI1640 con FBS inactivado por calor al 5%. Utilizar tejido Kimwipe para eliminar músculo y otros tejidos. Cortar ambos extremos de cada eje del hueso en el plato.
- Conectar el extremo del hueso con aguja 23G en la jeringa de 3 cc, enjuagar la médula ósea con RPMI1640 con FBS al 5% inactivado por calor en el plato. Desagregar los tejidos de la médula ósea por aspiraciones repetidas utilizando la misma aguja. Transferir la suspensión celular a 15 ml tubo de centrífuga.
- Centrifugue las células durante 5 min a 400 xg, eliminar el sobrenadante, resuspender las células en 1 ml de tampón a temperatura ambiente de color rojo sangre lisis celular (155 mM potassium bicarbonato, cloruro de amonio 10 mM, 0,1 mM de EDTA, 7,4 = PH) e incubar a temperatura ambiente durante 5 min y después se añade 5-10 ml de RPMI 1640 con FBS al 5% inactivado por calor.
- Pasar las células a través de un filtro de células. Recoger el flujo a través de un tubo nuevo. Centrifugue durante 5 min a 400 x g. Eliminar el sobrenadante, el pellet de células no debe contener ningún color rojo. La ausencia de color rojo indica una eliminación completa de las células rojas de la sangre. Resuspender el sedimento celular en 10 ml de RPMI1640 con FBS al 5% inactivado por calor. Vórtice suavemente para asegurarse de que la suspensión de células es completamente uniforme. Tomar una parte alícuota y se cuentan las células en un hemocitómetro. Calcular la cantidad de volumen de células necesarias para el trasplante de médula ósea y células alícuotas suficientes y mezclar células masculinas donantes con células competidor femenino en una proporción de 5:2. Centrifugue durante 5 min a 400 xg, se lava con PBS, se resuspende en PBS con la concentración final de células del donante en 5 × 10 6 células / ml y competidor en 2 × 10 6
2. Trasplante de Médula Ósea Competitiva
- Irradiar ratones hembra receptora (8-12 semanas de edad) con gamma 137Cs radiador rayos en una sola dosis de 11Gy 4-6 h antes del trasplante de médula ósea.
- Coloque los ratones irradiados femeninos en un mecanismo de contención del ratón. Se inyecta la mezcla de donante y las células de la competencia a través de la vena caudal en 0,1 ml de volumen total de tal manera que cada ratón recibe el 5 × 10 5 células del donante y 2 × 10 5 células de médula ósea de la competencia.
3. Recogida de muestras
Semana pareja después del trasplante de médula ósea, recoger muestras de sangre periférica (~ 50 l) de ratón hembra receptora por sangrado retro-orbital bajo anestesia condición. Las muestras se recogen en tubos con EDTA recubiertos. BM muestras también pueden ser recogidos al final del experimento, usualmente al menos 4 meses después del trasplante, con los mismos procedimientos que se describen anterior (Paso 1); generalmente 20-40% deUna tibia BM células son suficientes para hacer la cantidad suficiente de ADN. La sangre o muestras de la misma edad BM ratones normales de ambos sexos también se recogen para preparar la curva estándar.
4. Aislamiento de ADN genómico
- Añadir 4 × volumen de habitación lisis temperatura del tampón RBC (~ 200 l) a cada muestra de sangre. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 1 ml de PBS, a continuación, girar hacia abajo para retirar la mayor parte de la RBC lisada.
- Aislar ADN usando un kit de extracción de ADN de sangre (QIAmp DNA Blood Kit de extracción). Pre-caliente el tampón de elución (AE) a 37 º C para mejorar el rendimiento de ADN eluido. ADN masculino y femenino para la curva estándar se aíslan de manera similar.
- (Opcional) El ADN genómico puede ser purificado adicionalmente o se concentró utilizando el método de precipitación con EtOH en presencia de acetato de sodio 3 M (pH = 5,5). Los sedimentos de ADN se resuspende en agua destilada 40-50 l para el análisis inmediatamente o almacenado a -20 ° C para su uso futuro.
- Mida la concentr ADNción con fotómetro espectros Nanodrop ND-1000. Las muestras con OD 260/280 entre 1.8-2.0 se utilizan para el análisis adicional.
- Diluir el ADN con ADNasa libre de H 2 O para 4ng/μl en un volumen total de 50 l.
5. Preparación Curva Estándar
Diluir ADN masculino y femenino de ADN a una concentración de 4 ng / l, y hacer la mezcla de ADN según la Tabla 1
| % De ADN masculino en segundo plano Mujer | Volumen (l) de ADN masculino 4ng/μl | Volumen (l) de ADN femenino 4ng/μl | Volumen total (l) |
| 0,2 | 1 | 499 | 500 |
| 0,5 | 1 | 199 | 200 |
| 2,5 | 5 | 195 | 200 |
| 12,5 | 25 | 175 | 200 |
| 50 | 100 | 100 | 200 |
| 87,5 | 175 | 25 | 200 |
| 100 | 200 | 0 | 200 |
Tabla 1. Preparación de la muestra para la curva estándar. Normales macho y hembra FVB / NJ ratones a la edad de 8-12wks fueron sacrificados. Células de la sangre y el BM fueron recogidos. Los ADN de las células masculinas y femeninas células fueron aisladas y re-suspendido a una concentración de 4ng/μl. Los ADN masculino y femenino se mezclaron en diferentes proporciones para generar las mezclas de ADN de la muestra estándar.
6. PCR en tiempo real
- Configurar la placa de reacción de PCR mezclando SYBR Green Supermix reactivo con cebadores y ADN genómico. El volumen de reacción (20 l) contiene 400 nM de cada cebador y 5 l de ADN genómico de células sanguíneas (4ng/μl l x5 = 20 ng) en cada reacción. ADN samples y las normas se establecieron por triplicado. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 2.
| Nombre del gen | Adelante | Marcha atrás |
| Bcl2 | 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA | 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG |
| Zfy1 | 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA | 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC |
Tabla 2. RT-PCR cebador de secuencia de murino Bcl2 y Zfy1.
- Realizar reacción de PCR usando Biorad iQ5 máquina de PCR con las siguientes condiciones: 95 ° C 3 min, 42 ciclos de amplificación de 95 ° C durante 10 s, 58 ° C durante 25 seg y 72 ° C durante 15 segundos, seguido por una fusión de curva el paso.
- Obtener ciclo umbral (Ct) valores por Bio-Rad iQ5 2,1 Edición del sistema óptico estándar. Calcular? Ct (Ct Zfy1 </ Sup>-Ct Bcl2) valor, y Zfy1 nivel de expresión se calcula como el valor de 2-δ Ct.
- Establecer las curvas de calibración para cada serie reacción utilizando 2-? Ct lectura de conocidos / as mezclas estándar. Las curvas de calibración se generan por el trazado de la media de 2-? Ct valor de triplicados en el ADN conocida macho% en la mezcla con ajuste de regresión lineal.
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Representative Results
La Figura 1 y 2 mostraron ejemplos de las curvas de calibración trazada con valores medios de 2-? Ct contra porcentajes de ADN masculino. Figura 1A muestra la temperatura de fusión específica para Bcl2 y Zfy1 amplicones localizados a 78,5 ° C y 88,5 ° C, respectivamente. Bcl2 se utiliza como un gen de referencia para normalizar la cantidad total de ADN cargado en cada reacción de PCR. Bcl2 curvas de amplificación (vista de registro) para cada muestra estándar fusionarse entre sí independiente de la concentración de ADN masculino, lo que indica la misma cantidad de ADN cargado (Figura 1B). Sin embargo, Zfy1 curva de amplificación migrado a la izquierda al aumentar la cantidad de ADN masculino en la muestra (Figura 1C). Para validar nuestro método, hemos probado el injerto macho célula donante trasplantadas en ratones que recibieron células de la MO de WT vs Pim knockout triple (TKO) en ratones después del trasplante diferentes puntos de tiempo. Tanto la sangre periférica (6wks) y muestras (BM 16wks) w antes de analizar. HSCs de Pim ratones TKO tienen defectos en la reconstitución de ratones irradiados letalmente (An, N et al., Manuscrito en revisión). Como se esperaba, los ratones receptores trasplantados con células Pim TKO tenía un porcentaje mucho menor de células masculinas en comparación con los ratones trasplantados con las células WT (Figura 3).
Figura 1. (A) curva de fusión Representante de múltiples muestras de diferentes porcentajes de ADN masculino. El pico a 78,5 indica la amplificación de Bcl2, mientras que el pico a 88,5 ° C indica la amplificación de ZFY-1. Representante curva de amplificación a partir de muestras múltiples con diferente porcentaje ADN masculino para Bcl2 (B) y Zfy1 (C), Ct: ciclo umbral.= "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg" target = "_blank"> Haga clic aquí para ampliar la figura.
Figura 2. RT-PCR estándar para la curva de porcentaje de ADN masculino. Las muestras de ADN (20 ng en 20 l volumen total) de mezclas de ADN macho y hembra obtenidos a partir de células de médula ósea fueron procesadas para la RT-PCR como se describe en el protocolo. Los valores medios de? Ct (Ct Ct Zfy1-Bcl2) para las muestras individuales se calcularon y 2-δ Ct (eje Y) se representaron frente a porcentaje de ADN masculino (eje X) (rango de 0,2% a 100%) con regresión lineal de montaje. R2 representa el coeficiente de determinación.
Figura 3. Competitivo trasplante de médula ósea experimentos. 5 x 10 5 células totales BM de WT macho o la misma edad macho Pim triples KO (TKO) ratones junto con 2 x 10 5 células competidor femenino de médula ósea se trasplantan en irradiados hosts hembra. La sangre periférica (PB) quimerismo a las 6 semanas y quimerismo BM a 16 semanas después del trasplante se estimaron por el porcentaje de ADN masculino por RT-PCR como se censuraron en el protocolo (* p <0,05, ** P <0,01).
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Discussion
El objetivo de nuestro estudio es proporcionar a los espectadores una técnica basada en PCR para cuantificar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo trasplante de médula ósea murina. Varios estudios han descrito el uso de RT-PCR para detectar células del donante en modelos de trasplante 9-10. El grupo del Dr. Schwarzenberger la primera desarrollado un trasplante de médula ósea murina modelo de trasplante usando PCR en tiempo real para amplificar y-cromosoma específico 8. Este método se utilizó para estudiar Gli-1 en función de la actividad de HSC 11. A continuación, modificar adicionalmente el protocolo y proporcionado una detallada, paso a paso protocolo experimental en formato visualizado. La presentación visualizada de nuestro protocolo permite al público seguir el protocolo con facilidad. También comparamos los resultados de PCR usando ADN genómico de muestras de BM vs ADN de la sangre periférica. Los datos de injerto de donantes de BM y muestras de sangre son básicamente coherentes, sin embargo, por lo general menos variación se encontró en muestras de excrementos. Esprobablemente debido a la hemoglobina residual después de la lisis de glóbulos rojos en la sangre periférica que pueden comprometer la pureza / calidad del ADN genómico en las muestras de sangre.
Hay varias ventajas con nuestra PCR basado en la técnica para cuantificar quimerismo de células donantes. En primer lugar, nuestra técnica se puede realizar en la mayoría de los laboratorios. No hay necesidad de equipo especializado y caro que no sea PCR en tiempo real de la máquina. Hemos modificado adicionalmente componente de reacción de PCR y se utiliza SYBR Green Supermix en lugar de Taqman. Este cambio reduce aún más los costos y gastos en que eliminan la sonda fluorescente marcada. En segundo lugar, nuestra técnica es fiable y altamente reproducible. Se utilizó el gen de referencia Bcl2 para normalizar la cantidad total de ADN en comparación con kit de cuantificación de ADN. Gen Bcl2 se utilizó debido a que: 1) este gen no se encuentra en el cromosoma Y-. Por lo tanto, su expresión no se ve afectada por injerto macho célula donante. 2). Bcl2 no está regulado en las condiciones actuales de trasplante. Como shpropio en la Figura 1, Bcl2 gen produce un control fiable y muy consistente para la carga total de ADN independiente de la cantidad cargada de ADN masculino. Zfy1 es un gen de dedo de cinc dentro de la región determinante de testículo 12 y está localizado en el cromosoma Y. Se ha informado de que el nivel de expresión génica de Zfy1 corresponde así a la cantidad de ADN de células masculinas en un modelo de ratón trasplante 8. En tercer lugar, la técnica basada en PCR es altamente sensible y puede detectar quimerismo de células donantes a <1%. Además, las muestras se pueden almacenar durante largo tiempo para su análisis posterior. En contraste, el flujo convencional de citometría de método requiere procesamiento de la muestra inmediata. Finalmente, nuestra técnica es la cepa de ratón independiente y se puede utilizar para el fondo genético que carece bien definidos marcadores de superficie para separar las células del donante de las células receptoras. Esta es la ventaja más importante de este método.
De acuerdo con nuestra condición experimental actual (donante / competenco proporción es de 5/2), se observó alrededor de 80-90% injerto donante a las 16 semanas utilizando el método basado en PCR. Nuestros datos son bastante comparables con los sistemas convencionales, la citometría de flujo basado en método que mostró ~ injerto del 95% de donantes de células a 16 semanas después del trasplante con donante (CD45.2) / competidor (CD45.1) en proporción 4:1 2. En comparación con el método convencional que utiliza marcador de superficie celular para detectar las células del donante en los ratones receptores, la principal desventaja de este método es la incapacidad para analizar el injerto en diversas subpoblaciones de células sanguíneas tales como en células B, células T o granulocitos. Sin embargo, si es necesario, es posible recoger cada población de células utilizando la técnica de clasificación de células y sujeto a continuación, las muestras de RT-PCR para determinar la contribución del donante de células en cada población celular. Puesto que el injerto de células donantes se calculó basado en la curva estándar, la lectura de la muestra es totalmente dependiente de la pendiente y la intersección y de la curva estándar. Es posible que podamos bajar de rango readout (es decir, más del 100% del injerto). Sin embargo, estos "falsos positivos o falsos negativos" se puede evitar si: 1) los procedimientos de aislamiento de ADN de muestras analizadas y las muestras de la curva estándar son idénticas, y 2) el rango de la curva estándar elegido está cerca de la lectura de muestra prevista. Además, puesto que puede haber diferencias en cada reacción de PCR y en el estado de calibración de la máquina de PCR, las muestras de la curva estándar debe ser incluido en cada placa de PCR para evitar variaciones entre cada reacción de PCR.
Por último, hemos validado nuestra técnica usando nuestros Pim triples ratones KO. De acuerdo con el informe anterior 13, se encontró que las HSC donantes de Pim triples ratones KO son defectuosas en la reconstitución de los ratones receptores irradiados letalmente.
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Disclosures
Nosotros no tenemos intereses financieros en competencia a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Charles Greenberg para el uso de su máquina de PCR en tiempo real. Este trabajo es apoyado por MUSC Hollings Cancer Center de inicio del Fondo, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Carrera Premio de la Fundación para el Desarrollo, NIH 1K08HL 103780-01A1, y NIH 3P30CA138313-01S3. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud u otros agentes de financiación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
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