Summary
Vi visar en minimalinvasiv teknik kallas neonatal subventrikulära zonen elektroporering. Tekniken består av injicera plasmid-DNA i de laterala ventriklarna hos neonatala valpar och applicera elektrisk ström för att leverera och genetiskt manipulera neurala stamceller
Abstract
Neurala stamceller (NSC) linje den postnatala laterala ventriklarna och ger upphov till flera celltyper som inkluderar neuroner, astrocyter och ependymala celler 1. Kunskap om de molekylära vägar som är ansvariga för NSC självförnyelse, engagemang och differentiering är avgörande för att utnyttja deras unika möjligheter att reparera hjärnan och bättre förstå centrala nervsystemet. Tidigare metoder för manipulering av däggdjurssystem krävde tidsödande och dyr strävan av genteknik på hela djuret nivå 2. Sålunda har de allra flesta studier undersökte funktioner NSC molekyler in vitro eller i ryggradslösa djur.
Här visar vi de enkelt och snabbt teknik för att manipulera neonatala NPC som kallas neonatal subventrikulära zonen (SVZ) elektroporering. Liknande tekniker utvecklades för tio år sedan för att studera embryonala NSCs och har hjälpt studier om corticaL utveckling 3,4. Mer nyligen detta tillämpades för att studera den postnatala gnagare framhjärnan 5-7. Denna teknik resulterar i robusta märkning av SVZ NSCs och deras avkomma. Således ger födsel SVZ elektroporering en kostnads-och tidseffektivt alternativ för däggdjur NSC genteknik.
Protocol
Detta förfarande är i enlighet med Yale IACUC krav. Forskarna bör se till att IACUC riktlinjer är godkända och följs enligt deras institutionella krav.
1. Avsnitt 1. Framställning av DNA, Solutions, och glaspipetter
- Generera hög renhet (OD 260/280> 1,80) hög koncentration (ug / ul> 2,5) endotoxin-fritt DNA.
- Bered 0,9% saltlösning och sterilfilter genom ett 22 pm filter.
- Placera 10 cm brand polerade borosilikatglas kapillärrör (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) in i en modell PP-830 Narishige PC-10 glaspipett avdragare med en Kanthal tråd. Ställ avdragare till en steg vägt drag vid 70,5 ° C. Break tips med cirkulära pincett och inspektera under ett dissektionsmikroskop för ojämna kanter. Koniska Tips och placera under en UV-lampa i 15 min. Drog pipetter skall märkas vid 2 mm från kanten av spetsen.
- Förbered 0,1% vikt / volym fast grön Solutipå genom att blanda filtrerad steril 0,9% saltlösning med torr snabb grönt.
2. Avsnitt 2. Djurpreparering, glaspipett lastning och Plasmid injektion
- Ta postnatal dag 0-1 valpar individuellt från burar, plats på ett glas petriskål förväg kyld till 4 ° C och sedan plats på våt is.
- Efter cirka 5 minuter, bestämma tillståndet för bedövning genom användning av foten nypa responsen. Om ingen rörelse sker, med förbehåll valpar till intraventrikulär injektion.
- Det är viktigt att notera att kombinationen av snabb grön, DNA och saltlösning kan resultera i snabb förångning, kristallisation, och blockad av glaspipetter. Därför genererar en stamlösning och alikvot 1-2 ul på parafilm omedelbart före injektioner.
- Sug hela alikvoterades volym med drog glaspipett.
- Håll huvudet av valpen mellan tummen och pekfingret på din mindre dominanta hand.
- Aktivera lampa ettD Håll chef för valp strax utanför ljusstråle. Om det behövs, sätter saltlösning på huvudet för att minska mängden ljus som reflekteras av valp. Ventriklarna skall nu belysas.
- Med din dominanta handen in nålen i laterala ventrikeln närmast dig (Figur 1A och 1B). Platsen för injektion skall vara ca samma avstånd från lambdoid suturen och öga och 2 mm lateralt om sagittala suturen. Sätt drog pipett till 2 mm märket för en P0 valp, vilket bör garantera inträngning i den laterala ventrikeln. Tillfällighet, kan du se återfyllning av CSF in i pipetten från utsläpp av intrakraniellt tryck. För att minska intrakraniellt tryck, som hjälper till att injektion av plasmid lossa greppet om huvudet av pup.Step 2,8. Injicera omkring 0,5 pl plasmid i sidoventrikeln med en luft-pressad injektor (Picospritzer, Parker).
3. Avsnitt 3. Elektroporation och återställning
- Set spänningen hos elektroporation generatorn för 5 fyrkantpulser, 50 ms / puls vid 100 volt, med 950 ms intervall. Den rumsliga specificitet plasmiden elektroporering dikteras av riktningen av laddningsöverföring. Stor uppmärksamhet bör ägnas placeringen Med tanke på att befolkningen stamceller längs SVZ 8. Skillnader i andelen spridning och cell öde har identifierats för ventrala-rygg-och rostral-caudal platser 9,10.
- När plasmiden injiceras, doppa pincettytoma elektroder i PBS. Detta steg är att maximera laddningsöverföring och förhindra brännskador orsakade av resistivitet.
- Placera den positiva elektroden på den dorsala laterala väggen hos valp nära örat ipsilateralt till stället för plasmiden injektion (figur 1C och 1D). Placera den negativa elektroden på den kontralaterala hemisfären ventrala laterala till valpens nos.
- Initiera strömöverföring genom att trycka på puls Bottensatserhäxa pedal och sopa elektroderna från dorsalt till lateralt med ~ 25 ° vinkel intervall.
- Plats elektroporerades valpar på en värmedyna under 5 min. Rotera försiktigt valpar var 30 sekund med mild stimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neonatala subventrikulära zonen elektroporation resulterar i märkning av nästan alla radiella Glia angränsande med den dorsala, laterala dorsala och laterala subventrikulära zonen efter "svepande" rörelse av pincettdelen elektroden (figur 1E). Däremot kan elektroporering anpassas till kravet på respektive experiment, men inte sopa elektroden och använda specifik placering och orientering som beskrivs i videon. Till exempel, eftersom dorsalt lokaliserad radiella Glia skiljer sig från de foder laterala delen av kammaren, kan man valde att endast elektroporera en enda region 9,10. Ytterligare specificitet kan också ges med mindre elektroder.
Plasmid-DNA snabbt späds inom de första tre veckorna 11. Därför identifierar genomiskt modifierade celler med plasmid-DNA rekommenderas inte. För att kringgå denna begränsning är Cre-rekombinas uttrycker plasmider Introduced tillsammans med GFP i möss som har en stoppsekvensen flankerad av lox P ställen uppströms en genomiskt uttryckta fluorescerande protein (tdTomato) 12. Vid rekombination är stoppsekvensen avlägsnades och det fluorescerande proteinet uttrycks (figur 1F). Genom fyra veckor efter elektroporation få GFP plasmid som uttrycker celler ses i subventrikulära zonen medan många fler tdTomato positiva celler förekommer. Vid sektionering luktloben är det också uppenbart att i jämförelse med tdTomato uttryckande celler, mycket mindre GFP-uttryckande celler är närvarande, men båda har förvärvat egenskaper mogna granulceller (Figur 1G).
Figur 1. Neonatal subventrikulära zonen elektroporering. (A) Schematisk bild av enP0-P1 valp med ventrikulära systemet och ryggmärgen innehållande cerebrospinalvätska (krickan) markerade injicerades med förstärkta GFP (EGFP) som kodar plasmiden (grön). (B) koronalt snitt som visar orienteringen av paddlar relativt injektionsstället och laterala ventrikeln. (C) Orientering av negativa (-).. och positiva (+) elektroder med avseende på XYZ axel på injicerad valp (D) Horisontell bild av en valp efter elektroporering (E) Bild av den laterala ventrikeln 24 timmar efter elektroporering av en EGFP-kodande vektor (Grön). (F) Bild av den laterala ventrikeln 28 dagar efter elektroporering av CRE rekombinas-och EGFP-kodande plasmider i möss som bär en stoppkodon uppströms tdTomato. Rekombination inducerar uttryck av tdTomato (Röd). Successiva spädningar av plasmid resulterar i få återstående EGFP positiva SVZ celler medan genomiskt uttryckte tdTomato är permanent uttrycks. (G)Spädning av plasmid-DNA (grön) är uppenbart med tanke på att fler celler i granul cellskiktet i luktloben uttrycker den genomiska markören, tdTomato (röd). LV: laterala ventrikeln, OB: luktloben. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här vi detalj tekniken av neonatal SVZ elektroporering, en teknik för att snabbt och robust märka och manipulera SVZ stamceller och deras avkomma. Det finns flera fördelar som elektroporering har i jämförelse med andra tekniker. Först, med tanke på fokus märkning av celler, är en möjlighet att urskilja celler autonoma och icke-cells autonoma effekter. Det andra, genetisk manipulering med inducerbara system gör att man kan jämföra effekter före eller efter synaptisk integrering. Vidare kan man kringgå användningen av flera plasmider genom electroporating CRE uttryckande möss med plasmider innehållande loxP-ställena. Det fjärde, kan gen reporterplasmider användas för att studera transkriptionell transaktivering. I detta fall kan transkriptionsaktivitet mätas enbart i celler som är manipulerade, tillsätts specificitet kan införas när subregioner är microdissected. Femte, övergående märkning av celler transit förstärkande på grund av fortsatt spridning och utspädning Of plasmiden kan användas som "birthdating" metod liknande märkning med tymidin-analoger 11. Sjätte, även om övergående märkning av celler kan ses som en nackdel, bör tekniken vara mottaglig för transposas-transposoninfogningar par för att framkalla genomisk integration 13. Alternativt kan löpande neurogenes ändras med CRE rekombinas att inducera genomisk modifiering av möss innehållande alleler flankeras av loxP-ställen 7,11. Med hjälp av detta protokoll har nyfödda nervceller identifierats upp till fyra månader efter elektroporation i Rosa26R-Stop-tdTomato möss där stoppet kassetten flankeras av loxP-ställen 12. Sammantaget är neonatal SVZ elektroporering en kostnadseffektiv och tidseffektiv minimalinvasiv verktyg för övergående eller permanent genetisk manipulation och märkning av framhjäman neurala stamceller och nyfödda neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar att göra.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från Department of Defense (idéutveckling utmärkelse, W81XWH-10-1-0041, AB), CT stamceller bidrag (AB), och en National Institute of Health NRSA 10.668.225 (DMF). Den nuvarande Materialet baseras på arbete delvis stöds av staten Connecticut under Connecticut stamcellsforskning Grants. Dess innehåll är helt och hållet av författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter i staten Connecticut, Institutionen för folkhälsovetenskap i delstaten Connecticut eller CT Innovations hade Inc. finansiärer ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
