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Neuroscience

Neonatale Elettroporazione zona subventricolare

Published: February 11, 2013 doi: 10.3791/50197

Summary

Dimostriamo una tecnica minimamente invasiva denominata neonatale elettroporazione zona subventricolare. La tecnica consiste nell'iniettare DNA plasmidico nei ventricoli laterali di cuccioli neonati e l'applicazione di corrente elettrica per fornire e manipolare geneticamente le cellule staminali neurali

Abstract

Cellule staminali neurali (NSC) linea ventricoli postnatali laterali e danno luogo a diversi tipi cellulari che includono neuroni, astrociti e cellule ependimali 1. La comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della NSC auto-rinnovamento, l'impegno, e la differenziazione è fondamentale per sfruttare il loro potenziale unico per riparare il cervello e capire meglio disturbi del sistema nervoso centrale. Metodi precedenti per la manipolazione dei sistemi di mammifero richiede l'impegno lungo e costoso dell'ingegneria genetica a livello animale intero 2. Così, la maggior parte degli studi hanno esplorato le funzioni di molecole NSC in vitro o in invertebrati.

Qui, una dimostrazione della tecnica semplice e rapida per manipolare NPC neonatali che si riferisce a come neonatale zona subventricolare (SVZ) elettroporazione. Tecniche simili sono state sviluppate una decina di anni fa per studiare cellule staminali neurali embrionali e hanno aiutato studi sulla cortica3,4 l di sviluppo. Più di recente questo è stato applicato per studiare il proencefalo roditore postnatale 5-7. Questa tecnica comporta l'etichettatura robusto SVZ cellule staminali neurali e la loro progenie. Così, postnatale SVZ elettroporazione fornisce un costo e un'alternativa tempo efficace per mammiferi ingegneria genetica NSC.

Protocol

Questa procedura è in conformità con i requisiti IACUC Yale. Gli scienziati dovrebbero fare in modo che le linee guida IACUC sono approvati e seguiti secondo le proprie esigenze istituzionali.

1. Sezione 1. Preparazione di Pipette DNA, soluzioni, e vetro

  1. Generazione di elevata purezza (OD 260/280> 1,80) ad alta concentrazione (mg / ul> 2.5) privo di endotossine DNA.
  2. Preparare soluzione fisiologica 0,9% e filtro sterile attraverso un filtro 22 micron.
  3. Posto 10 centimetri tubi di fuoco lucido vetro borosilicato capillari (OD: 1,5 mm, ID: 1.10 mm) in un modello PP-830 Narishige PC-10 estrattore pipetta di vetro con un filo kanthal. Impostare estrattore ad un pull un passo ponderato a 70.5 ° C. Rompere le punte con pinza circolari e ispezionare sotto un microscopio da dissezione per i bordi frastagliati. Punte coniche e posto sotto una lampada UV per 15 minuti. Pipette tirato devono essere marcati a 2 mm dal bordo della punta.
  4. Preparare 0,1% peso / volume soluzione molto veloce verdedalla miscelazione sterile filtrata soluzione salina allo 0,9% a secco verde veloce.

2. Sezione 2. Preparazione degli animali, pipetta di vetro di caricamento e iniezione Plasmid

  1. Rimuovere giorno postnatale 0-1 cuccioli individualmente dalle gabbie, posto su un piatto di vetro Petri pre-refrigerato a 4 ° C, e quindi posto in ghiaccio.
  2. Dopo circa 5 minuti, determinare lo stato di anesthetization utilizzando la risposta pinch piede. Se non si verifica il movimento, cuccioli di soggetti ai iniezione intraventricolare.
  3. È importante notare che la combinazione di verde veloce, DNA, e soluzione salina può provocare una rapida evaporazione, cristallizzazione, e il blocco di pipette di vetro. Di conseguenza, generare una soluzione di riserva ed aliquota 1-2 microlitri su parafilm immediatamente prima di iniezioni.
  4. Aspirare l'intero volume aliquotate con la pipetta di vetro tirato.
  5. Tenere la testa del cucciolo tra il pollice e l'indice della mano meno dominante.
  6. Accendere una lampadad tenere la testa del cucciolo appena fuori del fascio di luce. Se necessario, mettere salino sulla testa per ridurre la quantità di luce riflessa da pup. I ventricoli dovrebbe essere illuminato.
  7. Con la mano dominante, inserire l'ago nel ventricolo laterale più vicino a voi (Figura 1A e 1B). Il sito di iniezione deve essere approssimativamente equidistante dalla sutura lambdoidea e occhio e 2 mm lateralmente alla sutura sagittale. Inserire tirato pipetta a volume 2 mm per un cucciolo P0, che dovrebbe garantire una maggiore penetrazione nel ventricolo laterale. Casualmente, è possibile visualizzare il riempimento del liquido cerebrospinale nella pipetta dal rilascio della pressione intracranica. Per ridurre la pressione intracranica, che aiuta a iniezione di plasmide, allentare la presa sulla testa del pup.Step 2.8. Iniettare circa 0,5 l di plasmide nel ventricolo laterale che utilizza l'aria compressa-iniettore (Picospritzer, Parker).

3. Sezione 3. Elettroporazione e recupero

  1. Set la tensione del generatore di elettroporazione per 5 impulsi quadrati, 50 msec / impulso a 100 volt, con 950 msec. La specificità spaziale di elettroporazione plasmide è dettata dalla direzionalità del trasferimento di carica. Particolare attenzione dovrebbe essere data al collocamento data l'eterogeneità delle popolazioni di cellule staminali lungo la SVZ 8. Le differenze nei tassi di proliferazione e il destino della cellula sono stati individuati per le posizioni-dorsale e ventrale rostrale-caudale 9,10.
  2. Una volta che il plasmide viene iniettato, dip elettrodi pinzetta in PBS. Questo passo è quello di massimizzare il trasferimento di carica e per evitare ustioni causate da resistività.
  3. Posizionare l'elettrodo positivo sulla parete dorsale laterale del cucciolo vicino all'orecchio omolaterale al sito di iniezione plasmide (Figura 1C e 1D). Posizionare l'elettrodo negativo sul laterale dell'emisfero controlaterale ventrale al cucciolo muso.
  4. Avviare il trasferimento corrente premendo i piedini di impulsistrega pedale e spazzare gli elettrodi da dorsale a laterale che utilizza ~ 25 ° intervalli angolari.
  5. Posto elettroporata cuccioli su un rilievo di riscaldamento per 5 min. Ruotare delicatamente cuccioli ogni 30 secondi con una lieve stimolazione.

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Representative Results

Neonatali subventricolare elettroporazione risultati della zona nella etichettatura di quasi tutti glia radiale contigua alla dorsale, zona dorsale subventricolare laterale e laterale seguendo il movimento "spazzare" dell'elettrodo pinzetta (Figura 1E). Tuttavia, elettroporazione può essere adattato al requisito dell'esperimento rispettivo ma non spazzare l'elettrodo e utilizzando il posizionamento e l'orientamento specifico come dettagliato nel video. Ad esempio, poiché localizzata dorsalmente glia radiale differiscono da quelli fodera sezione laterale del ventricolo, si può scegliere di electroporate solo una singola regione 9,10. Ulteriore elemento specifico può anche essere somministrato utilizzando piccoli elettrodi.

DNA plasmidico è rapidamente diluito entro le prime tre settimane 11. Pertanto, individuando le cellule genomically modificati, utilizzando DNA plasmidico non è raccomandato. Per aggirare questa limitazione, CRE plasmidi esprimenti ricombinasi sono Introduced con GFP in topi che hanno una sequenza di arresto fiancheggiata da siti lox P a monte di una proteina espressa genomically fluorescente (tdTomato) 12. Sulla ricombinazione, la sequenza di arresto viene rimossa e la proteina fluorescente è espressa (Figura 1F). Con quattro settimane dopo l'elettroporazione poche cellule GFP plasmide che esprime sono visti nella zona subventricolare considerando che molte cellule più tdTomato positivi si vedono. Su sezionamento bulbo olfattivo è anche evidente che in confronto a cellule esprimenti tdTomato, cellule esprimenti GFP molti meno sono presenti, tuttavia entrambi hanno acquisito caratteristiche dei granuli maturi (Figura 1G).

Figura 1
Figura 1. Neonatale elettroporazione zona subventricolare. (A) Rappresentazione schematica di unP0-P1 cucciolo con sistema ventricolare e del midollo spinale che contiene liquido cerebrospinale (verde acqua) ha evidenziato iniettato con una maggiore GFP (eGFP), che codifica plasmide (verde). (B) Sezione coronale che mostra l'orientamento delle pale rispetto al sito di iniezione e il ventricolo laterale. (C) Orientamento del negativo (-).. elettrodi e positivo (+) rispetto all'asse XYZ su iniettato pup (D) Vista orizzontale di un cucciolo elettroporazione seguente (E) Immagine del ventricolo laterale elettroporazione 24 ore di seguito di un eGFP-vettore codificante (verde). (F) Immagine del ventricolo laterale 28 giorni dopo l'elettroporazione della ricombinasi CRE-e-eGFP codifica plasmidi in topi portatori di un codone di stop a monte del tdTomato. Ricombinazione induce l'espressione di tdTomato (Rosso). Diluizioni successive di risultato plasmide in pochi rimasti cellule SVZ eGFP positive mentre genomically espresso tdTomato è permanentemente espressa. (G)Diluizione del DNA plasmidico (verde) risulta dato che più cellule dello strato dei granuli cellule del bulbo olfattivo esprimono il marcatore genomico, tdTomato (rosso). LV: ventricolo laterale; OB: bulbo olfattivo. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Discussion

Qui dettaglio la tecnica di elettroporazione neonatale SVZ, una tecnica per etichettare in modo rapido e robusto e manipolare le cellule staminali SVZ e la loro progenie. Ci sono diversi vantaggi che elettroporazione ha rispetto ad altre tecniche. Prima, data l'etichettatura focale di cellule, si è in grado di discernere cellule effetti autonomi e non autonomi cella. In secondo luogo, la manipolazione genetica utilizzando sistemi inducibili permette di confrontare gli effetti prima o dopo l'integrazione sinaptica. Inoltre, si può ignorare l'uso di plasmidi multipli electroporating topi CRE esprimono con plasmidi contenenti siti loxP. Quarto, plasmidi reporter gene può essere usato per studiare transattivazione trascrizionale. In questo caso, l'attività trascrizionale può essere misurata solo in cellule che sono manipolati, specificità aggiunte possono essere introdotte quando sottoregioni sono microdissezione. In quinto luogo, l'etichettatura transitoria delle cellule amplificazione di transito a causa della continua proliferazione e la diluizione of il plasmide può essere utilizzato come metodo "birthdating" simile a marcatura con timidina analoghi 11. Sesto, sebbene l'etichettatura transiente di cellule potrebbe essere visto come uno svantaggio, la tecnica deve essere predisposto alla transposasi-trasposoni coppie di indurre integrazione genomica 13. In alternativa, la neurogenesi in corso può essere modificato con ricombinasi CRE per indurre la modifica genomico di topo contenenti alleli fiancheggiati da siti loxP 7,11. Con questo protocollo, nuovi neuroni sono stati individuati fino a quattro mesi dopo l'elettroporazione in Rosa26R-Stop-tdTomato topi in cui è affiancata la cassetta fermata di siti loxP 12. Nel loro insieme, neonatale elettroporazione SVZ è un efficiente dei costi e in tempi strumento minimamente invasiva per la manipolazione transitori o permanenti genetica e l'etichettatura delle cellule staminali neurali del proencefalo e neuroni neonati.

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Disclosures

Gli autori non hanno rivelazioni da fare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del Dipartimento della Difesa (sviluppo premio Idea, W81XWH-10-1-0041, AB), CT cellule staminali di assegnazione (AB), e di un Istituto Nazionale della Salute NRSA 10668225 (DMF). Il materiale presente è basato sul lavoro in parte sostenuto da parte dello Stato del Connecticut sotto la ricerca sulle cellule staminali Connecticut programma di sovvenzioni. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali dello Stato del Connecticut, del Dipartimento di Sanità Pubblica dello Stato del Connecticut o TC Innovations, Inc. I finanziatori avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta dei dati e l'analisi, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heavy Polished Borosilicate Tubing Sutter Instrument BF150-110-10
Dual-Stage Glass Micropipette Puller Narishige PC-10H
Fast Green Fischer Scientific 0521192205
ECM 830 Square Wave Pulse generator Harvard Apparatus 45-0052
Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0488
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-562-36
Tungsten Halogen lamp USHIO America, Inc 1002247
Picospritzer II Parker Instruments 052-0312-900

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References

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Neuroscienze Numero 72 Biologia dello Sviluppo Neurobiologia Biologia Molecolare Biologia Cellulare Fisiologia Anatomia umana Ingegneria Biomedica biologia delle cellule staminali Genetica neurogenesi la crescita e lo sviluppo Chirurgia zona subventricolare elettroporazione cellule staminali neurali NSC zona subventricolare il cervello il DNA l'iniezione l'ingegneria genetica i cuccioli neonati modello animale
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Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., More

Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197, doi:10.3791/50197 (2013).

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