Summary
Nous démontrons une technique peu invasive appelée électroporation zone sous-ventriculaire néonatal. La technique consiste à injecter de l'ADN plasmidique dans les ventricules latéraux de chiots nouveau-nés et application d'un courant électrique à fournir et manipuler génétiquement des cellules souches neurales
Abstract
Les cellules souches neurales (NSC) en ligne les ventricules latéraux et postnatales donner lieu à plusieurs types de cellules qui comprennent les neurones, les astrocytes et les cellules épendymaires 1. Comprendre les mécanismes moléculaires responsables de la NSC auto-renouvellement, l'engagement et la différenciation est essentielle pour exploiter leur potentiel unique pour réparer le cerveau et de mieux comprendre les troubles du système nerveux. Les méthodes précédentes pour la manipulation des systèmes de mammifères nécessaire l'effort long et coûteux du génie génétique au niveau de l'animal entier 2. Ainsi, la grande majorité des études ont exploré les fonctions des molécules NSC in vitro ou chez les invertébrés.
Ici, nous démontrons la technique simple et rapide à manipuler PNJ néonatales qui est désigné comme zone sous-ventriculaire néonatal (SVZ) électroporation. Des techniques similaires ont été mis au point il ya une décennie à étudier NSCs embryonnaires et ont aidé des études sur cortical le développement 3,4. Plus récemment, elle a été appliquée pour étudier le cerveau antérieur des rongeurs postnatale 5-7. Cette technique conduit à l'étiquetage robuste de SVZ NSC et de leur progéniture. Ainsi, après la naissance SVZ électroporation offre un coût de remplacement et du temps efficace pour NSC ingénierie génétique chez les mammifères.
Protocol
Cette procédure est conforme aux exigences du IACUC Yale. Les scientifiques devraient veiller à ce que les lignes directrices du IACUC sont approuvés et suivis en fonction de leurs exigences institutionnelles.
1. Section 1. Préparation de pipettes ADN, Solutions et verre
- Générer une grande pureté (DO 260/280> 1,80) forte concentration (ug / ul> 2,5) sans endotoxine ADN.
- Préparer 0,9% de solution saline stérile et le filtre à travers un filtre 22 um.
- Placer les 10 cm polies au feu des tubes en verre borosilicate capillaires (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) dans un modèle PP-830 Narishige PC-10 en verre pipette extracteur avec un fil kanthal. Set extracteur pour un pull un peu pondérée à 70,5 ° C. Briser avec une pince circulaire conseils et inspecter sous un microscope à dissection pour les bords en escalier. Conseils coniques et les placer sous une lampe UV pendant 15 min. Pipettes tirés devraient être marqués à 2 mm du bord de la pointe.
- Préparer 0,1% en poids / volume vert rapide solutipar mélange une solution stérile de sérum physiologique à 0,9% filtrée avec du vert à séchage rapide.
2. Section 2. Préparation des animaux, verre Pipette Chargement en cours et l'injection de plasmide
- Retirer jour postnatal 0-1 chiots individuellement dans les cages, placez-les sur un plat en verre de Pétri pré-réfrigérés à 4 ° C, puis les placer sur la glace mouillée.
- Après environ 5 min, de déterminer l'état de l'anesthésie, en utilisant la réponse de pincement pied. Si aucun mouvement n'est détecté, chiots soumis à l'injection intraventriculaire.
- Il est important de noter que la combinaison de vert rapide de l'ADN, et la solution saline peut entraîner une évaporation rapide, la cristallisation et le blocage des pipettes en verre. Par conséquent, générer une solution mère et aliquote de 2.1 ul sur du parafilm immédiatement avant les injections.
- Aspirer la totalité du volume poolées avec la pipette en verre tiré.
- Maintenir la tête du chiot entre le pouce et l'index de votre main moins dominante.
- Allumez la lampe d'und tenir la tête du chiot à l'extérieur du faisceau lumineux. Si nécessaire, placez une solution saline sur la tête afin de réduire la quantité de lumière réfléchie par chiot. Les ventricules devrait maintenant être allumé.
- Avec votre main dominante, insérer l'aiguille dans le ventricule latéral le plus proche (Figure 1A et 1B). Le site d'injection doit être approximativement égale distance de la suture lambdoïde et des yeux et 2 mm en dehors de la suture sagittale. Insérez tiré pipette pour la marque de 2 mm pour un chiot P0, ce qui devrait assurer une pénétration dans le ventricule latéral. Par coïncidence, il se peut que le remblayage du LCR dans la pipette de la libération de la pression intracrânienne. Pour réduire la pression intracrânienne, ce qui aide à l'injection de plasmide, desserrez votre emprise sur la tête de la pup.Step 2.8. Injecter environ 0,5 ul de plasmide dans le ventricule latéral à l'aide d'un injecteur d'air sous pression (Picospritzer, Parker).
3. Section 3. Électroporation et récupération
- Set la tension du générateur d'impulsions d'électroporation de 5 carrés, 50 ms / impulsion à 100 volts, avec des intervalles de 950 ms. La spécificité de l'espace électroporation plasmide est dictée par la directivité de transfert de charge. Une attention particulière devrait être accordée à la mise en place compte tenu de l'hétérogénéité des populations de cellules souches le long de la SVZ 8. Les différences dans les taux de prolifération et destin cellulaire ont été identifiés pour les emplacements ventro-dorsale et caudale 9,10 rostro-.
- Une fois que le plasmide est injecté, plonger les électrodes brucelles dans le PBS. Cette étape consiste à maximiser le transfert de charge et pour éviter les brûlures causées par la résistivité.
- Placer l'électrode positive sur la paroi latérale de la dorsale petits près de l'oreille ipsilatérale au site d'injection de plasmide (Figure 1C et 1D). Placez l'électrode négative sur la partie latérale hémisphère controlatéral ventrale du chiot museau.
- Initier le transfert en cours en appuyant sur les foots impulsionssorcière pédale et balayer les électrodes de dorsale à l'aide latéral ~ 25 ° d'angle intervalles.
- Lieu électroporation chiots sur un coussin chauffant pendant 5 min. Tournez doucement chiots toutes les 30 secondes avec une légère stimulation.
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Representative Results
Néonatales ventriculaire résultats d'électroporation de zone dans l'étiquetage de la quasi-totalité glie radiale contiguë à la dorsale, zone sous-ventriculaire latéral dorsal, latéral et à la suite de la "balayage" déplacement de l'électrode pince (figure 1E). Cependant, l'électroporation peut être adapté à l'exigence de l'expérience respective, mais pas balayer l'électrode et l'utilisation de l'emplacement spécifique et l'orientation comme détaillé dans la vidéo. Par exemple, depuis dorsalement localisée cellules gliales radiales différentes de celles qui tapissent la partie latérale du ventricule, on peut choisir de ne électroporer une seule région 9,10. Spécificité complémentaires peuvent également être donnés en utilisant les petites électrodes.
L'ADN plasmidique est rapidement dilué au cours des trois premières semaines 11. Par conséquent, l'identification des cellules génomique modifiés en utilisant l'ADN plasmidique n'est pas recommandée. Pour contourner cette limitation, la CRE recombinase plasmides exprimant sont introduced avec la GFP dans des souris qui ont une séquence d'arrêt flanqué par des sites lox P amont d'une protéine exprimée génomiquement fluorescent (tdTomato) 12. Sur la recombinaison, la séquence d'arrêt est retiré et la protéine fluorescente est exprimée (figure 1F). En quatre semaines après l'électroporation de plasmides GFP quelques cellules exprimant sont vus dans la zone sous-ventriculaire alors beaucoup plus de cellules tdTomato positifs sont visibles. Lors de la coupe du bulbe olfactif, il est également évident que par rapport aux cellules exprimant tdTomato, cellules GFP exprimant beaucoup moins sont présents, mais les deux ont acquis des caractéristiques de cellules granulaires matures (figure 1G).
Figure 1. Néonatale électroporation zone sous-ventriculaire. Schéma (A) d'unP0-P1 chiot avec système ventriculaire et la moelle épinière contenant le liquide céphalorachidien (sarcelle d'hiver) a souligné injecté renforcé la GFP (eGFP) codant plasmide (vert). (B) Coupe coronale montrant l'orientation des pales par rapport au site d'injection et le ventricule latéral. (C) Orientation des négatifs (-).. électrodes et positif (+) en ce qui concerne axes XYZ sur injectés chiot (D) Vue horizontale d'un chiot électroporation (E) suivant l'image de l'électroporation h ventricule latéral 24 suivant d'un vecteur eGFP-encodage (vert). (F) L'image du ventricule latéral 28 jours après l'électroporation de la recombinase CRE-et-eGFP plasmides codant dans des souris porteuses d'un codon stop en amont de tdTomato. Recombinaison induit l'expression de tdTomato (rouge). Dilutions successives de raison plasmide dans quelques cellules restantes eGFP SVZ positifs alors que génomiquement exprimé tdTomato est définitivement exprimé. (G)La dilution de l'ADN plasmidique (vert) est évident, étant donné que plus de cellules dans la couche de cellules granulaires du bulbe olfactif exprimer le marqueur génomique, tdTomato (rouge). LV: latérale du ventricule; OB: bulbe olfactif. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Ici, nous détaillons la technique de la SVZ électroporation néonatale, une technique permettant de rapidement et vigoureusement étiqueter et de manipuler les cellules souches SVZ et de leur progéniture. Il ya plusieurs avantages que l'électroporation a par rapport à d'autres techniques. Premièrement, étant donné l'étiquetage focale des cellules, on est capable de discerner des cellules autonomes et non-autonomes cellule effets. Deuxièmement, la manipulation génétique en utilisant des systèmes inductibles permet de comparer les effets avant ou après l'intégration synaptique. En outre, on peut contourner l'utilisation de plasmides multiples par électroporation souris exprimant la CRE avec des plasmides contenant des sites loxP. Quatrièmement, les plasmides gènes rapporteurs peuvent être utilisés pour étudier la transactivation de la transcription. Dans ce cas, l'activité transcriptionnelle peut être mesurée uniquement dans les cellules qui sont manipulés; spécificité supplémentaire peut être introduite lorsque les sous-régions sont microdisséqué. Cinquièmement, l'étiquetage transitoire de cellules amplificatrices de transit en raison de la prolifération continue et la dilution of le plasmide peut être utilisé comme "birthdating" procédé similaire à un marquage avec des analogues de thymidine 11. Sixièmement, bien que l'étiquetage transitoire de cellules pourrait être perçu comme un inconvénient, la technique doit être possible d'transposase-transposon paires d'induire intégration génomique 13. Alternativement, la neurogenèse permanente peut être modifié avec la recombinase CRE pour induire la modification génomique de souris contenant allèles flanqués par des sites loxP 7,11. En utilisant ce protocole, les nouveaux neurones ont été identifiés jusqu'à quatre mois après l'électroporation dans Rosa26R-Stop-tdTomato souris dans lequel la cassette d'arrêt est flanqué par des sites loxP 12. Pris dans leur ensemble, néonatale électroporation SVZ est un moyen rentable et le temps moyen efficace minimalement invasive pour la manipulation génétique transitoire ou permanent et l'étiquetage des cellules souches neurales du cerveau antérieur et les neurones nés.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucune divulgation à faire.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère de la Défense (prix de développement d'idées, W81XWH-10-1-0041, AB), CT cellules souches subvention (AB), et un Institut national de la santé NRSA 10668225 (DMF). Le matériel actuel est basé sur le travail soutenu en partie par l'État du Connecticut Connecticut sous la tige subventions Cellulaire Programme de recherche. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l'État du Connecticut, le ministère de la Santé publique de l'État du Connecticut ou CT Innovations, Inc Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte de données et l'analyse, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
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