Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Electroporation האזור Subventricular ילודים

Published: February 11, 2013 doi: 10.3791/50197

Summary

אנחנו מדגימים את טכניקה פולשנית המכונית electroporation האזור subventricular ילוד. הטכניקה מורכבת של הזרקת DNA פלסמיד לתוך חדרי לב לרוחב של גורים ילודים ויישום זרם חשמלי כדי לספק ולתפעל גנטיים תאי גזע עצביים

Abstract

תאי גזע עצביים (NSCs) קו רוחב חדרי לב לאחר הלידה ולהצמיח סוגי תאים רבים הכוללים נוירונים, האסטרוציטים, ותאי ependymal 1. הבנת המסלולים המולקולריים האחראים למל"ל התחדשות עצמית, מחויב, וההתמיינות היא קריטית לרתימת הפוטנציאל הייחודי שלהם כדי לתקן את המוח ולהבין טובים יותר את הפרעות במערכת עצבים מרכזיות. קודם שיטות למניפולציה של מערכות יונקים נדרשו זמן מאמץ רב ויקר של הנדסה גנטית ברמת החיים השלמה 2. לכן, הרוב המכריע של מחקרים בחן את הפונקציות של מולקולות המל"ל במבחנה או בחסרי חוליות.

הנה, אנחנו מדגימים את הטכניקה הפשוטה ומהירה כדי לתפעל NPCs יילודים המכונה האזור electroporation subventricular יילודים (SVZ). טכניקות דומות פותחו לפני עשור כדי ללמוד NSCs העוברי וסייעו מחקרים על cortical פיתוח 3,4. לאחרונה זה יושם ללמוד המוח הקדמי המכרסם לאחר לידת 5-7. טכניקה זו מביאה לתיוג חזק של SVZ NSCs וצאצאיהם. לפיכך, לאחר לידת SVZ electroporation מספק עלות וזמן חלופי יעילה להנדסה גנטית של יונקי המל"ל.

Protocol

הליך זה בהתאם לדרישות ייל IACUC. מדענים צריכים לוודא שהנחיות IACUC מאושרות ואחריו על פי הדרישות המוסדיות שלהם.

1. סעיף 1. הכנת דנ"א, פתרונות, וזכוכית פיפטות

  1. צור טוהר גבוה (OD 260/280> 1.80) ריכוז גבוה (מיקרוגרם / μl> 2.5) אנדוטוקסין נטול ה-DNA.
  2. הכן תמיסת מלח 0.9% ומסנן סטרילי דרך מסנן מיקרומטר 22.
  3. 10 צינורות Place סנטימטר אש מלוטשים ורוסיליקט זכוכית נימים (OD: 1.5 מ"מ, מזהה: 1.10 מ"מ) למודל PP-830-10 Narishige מחשב זכוכית פיפטה חולץ עם חוט kanthal. הגדר חולץ למשיכת צעד אחד משוקללת ב70.5 מעלות צלזיוס לשבור טיפים עם מלקחיים מעגליים ולבדוק תחת מיקרוסקופ לנתח לקצוות משוננים. טיפי שיפוע ומקום תחת מנורת UV במשך 15 דקות. pipettes משך צריך להיות מסומן ב 2 מ"מ מהקצה של הקצה.
  4. הכן 0.1% משקל / נפח המהיר הירוק solutiעל ידי ערבוב פתרון סטרילי מסונן 0.9% עם מלח ירוק מהיר יבשה.

2. סעיף 2. הכנת בעלי חיים, זכוכית פיפטה טוענת והזרקת פלסמיד

  1. הסר יום לאחר לידה בנפרד 0-1 גורים מכלובים, מקום על צלחת פטרי זכוכית מראש צוננת עד 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מקום על קרח רטוב.
  2. לאחר כ 5 דקות, לקבוע את המצב של הרדמה על ידי ניצול את תגובת דחק הרגל. אם אין תנועה מתרחשת, גורי בכפוף להזרקה תוך חדרים.
  3. חשוב לציין כי שילוב של ירוק מהיר, ה-DNA, ותמיסת מלח יכול לגרום לאידוי מהיר, התגבשות, ומצור על pipettes זכוכית. לכן, לייצר פתרון מניות ו1-2 μl aliquot על parafilm מייד לפני זריקות.
  4. לשאוב נפח aliquoted כל עם הכוס טפטפה משך.
  5. החזק את הראש של הגור בין אגודל ואצבע המורה של היד הדומיננטית פחות שלך.
  6. הפעל מנורהד להחזיק את הראש של גור, ממש מחוץ לאלומת אור. במידת צורך, לשים מלח על ראש כדי להפחית את כמות האור מוחזר על ידי גור. חדרי הלב עכשיו צריכים להיות מוארים.
  7. עם היד הדומיננטית שלך, הכנס את המחט לתוך חלל רוחב הקרוב אליך (האיור 1A ו-1B). במקום הזרקה צריך להיות כ מרחק שווה מהתפר והעין ו2 מ"מ לרוחב כדי תפר sagittal lambdoid. הכנס משכתי פיפטה לסימן המ"מ 2 עבור P0 גור, שאמור להבטיח חדירה לתוך חלל הרוחב. בצירוף מקרים, אתה עשוי לראות חזרה של מילוי CSF לתוך פיפטה משחרור לחץ תוך גולגולתי. כדי להפחית את לחץ תוך גולגולתי, המסייע בהזרקה של פלסמיד, לשחרר את האחיזה שלך על ראש pup.Step 2.8. להזריק כ -0.5 μl של פלסמיד לתוך חדר לב לרוחב באמצעות הזרקת אוויר בלחץ (Picospritzer, פארקר).

3. סעיף 3. Electroporation ושחזור

  1. Seלא המתח של הגנרטור electroporation במשך 5 פולסים מרובעים, 50 msec / דופק של 100 וולט, עם 950 מרווחי msec. הסגולי המרחבי של electroporation פלסמיד מוכתב על ידי הכיוון של העברת תשלום. תשומת לב צריכה להינתן למיקום נתון ההטרוגניות של אוכלוסיות תאי גזע לאורך SVZ 8. הבדלים בשיעורי התפשטות וגורל תא זוהו למקומות גחון גב וזנב מקוריים-9,10.
  2. ברגע פלסמיד מוזרקת, לטבול אלקטרודות פינצטה לתוך PBS. צעד זה הוא למקסם את העברת תשלום וכדי למנוע כוויות שנגרמו על ידי התנגדות.
  3. הנח את האלקטרודה החיובית על הקיר לרוחב הגב של הגור ליד אוזן ipsilateral לאתר של הזרקת פלסמיד (האיור 1C ו1D). הנח את האלקטרודה השלילית על רוחב גחון ההמיספרה נגדית לחוטמו של הגור.
  4. ליזום העברה נוכחית על ידי לחיצה על רגלי הדופקמכשפת דוושה ולסחוף את האלקטרודות מהגבה לרוחב באמצעות ~ 25 ° מרווחי זווית.
  5. מקום electroporated גורים על כרית חימום למשך 5 דקות. בעדינות לסובב גורים בכל 30 שניות עם גירוי קל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות ילודות subventricular אזור electroporation בתיוג של כמעט כל גליה הרציפה עם האזור הגבה, לרוחב גב, ורוחב subventricular בעקבות התנועה "הגורפת" של האלקטרודה פינצטה (האיור 1E) רדיאלי. עם זאת, electroporation ניתן להתאים לדרישה של הניסוי המתאים אך לא מטאטא את האלקטרודה ושימוש במיקום ואורינטציה מסוימים כמפורט בוידאו. לדוגמה, מאז גליה רדיאלי dorsally המקומית שונה מאלה רירית סעיף הרוחב של חדר, אחד יכול לבחור electroporate אזור אחד 9,10 בלבד. ייחוד נוסף גם יכול להינתן באמצעות אלקטרודות קטנות יותר.

DNA פלסמיד מדולל במהירות בתוך שלושת השבועות הראשונים 11. לכן, תאים מזהים שונו genomically באמצעות פלסמיד דנ"א אינו מומלצים. כדי לעקוף מגבלה זו, פלסמידים מבטאים Cre recombinase הם introduced יחד עם ה-GFP לעכברים שבו יש רצף תחנה מוקפת אתרים מעושנים P מעלה זרם של חלבון בטא genomically ניאון (tdTomato) 12. על רקומבינציה, רצף התחנה מוסר והחלבון פלואורסצנטי מתבטא (האיור 1F). בארבעה שבועות כמה תאים להביע GFP פלסמיד לאחר electroporation נראים באזור subventricular אילו תאים רבים חיוביים יותר tdTomato הם ראו. עם חתך נורת חוש הריח זה בא לידי ביטוי גם כי בהשוואה לתאים לבטא tdTomato, תאים להביע GFP הרבה פחות נוכחים, עם זאת הן רכשו תכונות של תאי גרגר בוגרים (האיור 1G).

איור 1
איור 1. Electroporation האזור Subventricular ילודים. () תרשים סכמטי שלP0-P1 גור עם מערכת חדרית וחוט שדרה המכילה נוזל השדרתי (צהבהב) הדגיש הוזרק המשופר GFP (eGFP) קידוד פלסמיד (ירוק). (ב) סעיף עטרה מראה כיוון של משוטים יחסית לאזור זריקה וחדר לרוחב. (C) כיוון של שליליות (-).. וחיוביות (+) אלקטרודות לגבי ציר XYZ ב (ד) תצוגה אופקית מוזרקת גור של electroporation הבא גור (ה ') תמונה של electroporation לרוחב החלל 24 השעות הבא של וקטור eGFP קידוד (ירוק). (F) תמונה של חדר לרוחב 28 ימים לאחר electroporation של Cre recombinase ופלסמידים eGFP קידוד לעכברים שנשאו קודון עצירת זרם של tdTomato. רקומבינציה גורמת לביטוי של tdTomato (אדום). דילולים רצופים של תוצאת פלסמיד בכמה תאים נותרים eGFP חיוביים SVZ אילו tdTomato הביע genomically מתבטאים באופן קבוע. (G)הדילול של ה-DNA פלסמיד (ירוק) ניכר בהתחשב בכך יותר תאים בשכבת תאי הגרגר של נורת חוש הריח להביע את הסמן הגנטי, tdTomato (אדום). LV: לרוחב חדר לב; OB: נורת חוש ריח. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנחנו פירוט הטכניקה של electroporation SVZ יילודים, טכניקה במהירות ובאופן עמיד לתייג ולטפל בתאי גזע SVZ וצאצאיהם. ישנם מספר יתרונות שיש electroporation בהשוואה לשיטות אחרות. ראשית, מאחר תיוג המוקד של תאים, אחד הוא מסוגל להבחין סלולריות השפעות אוטונומיות אוטונומיות ולא תא. מניפולציה שנייה, תוך שימוש במערכות גנטית מושרות מאפשרת להשוות תופעות לפני או אחרי שילוב הסינפטי. יתר על כן, אפשר לעקוף את השימוש בפלסמידים מרובים electroporating Cre עכברים מבטאים עם פלסמידים המכילים אתרי loxP. הרביעית, פלסמידים כתב גנטי יכולים לשמש ללמוד transactivation תעתיק. במקרה זה, פעילות תעתיק יכולה להימדד רק בתאי המניפולציות; סגולי הוסיף יכול להיות הציגה כשהם microdissected אזורי משנה. החמישי, התיוג הזמני של תאי הגברת מעבר בשל המשך התפשטות והדילול oF פלסמיד יכול לשמש כשיטה "birthdating" דומה לסימון בתימידין 11 אנלוגים. השישית, למרות התיוג הזמני של תאים יכול להיתפס כחסרון, הטכניקה צריכה להיות נוחה לזוגות transposase-transposon לגרום לאינטגרציה הגנומי 13. לחלופין, neurogenesis המתמשך ניתן לשנות עם Cre recombinase לגרום לשינוי גנטי של עכברים המכילים אללים מוקפים אתרי loxP 7,11. באמצעות פרוטוקול זה, נוירונים יילוד זוהו עד ארבעה חודשים שלאחר electroporation בעכברים-Stop-tdTomato Rosa26R שבקלטת התחנה מוקפת באתרי loxP 12. יחדיו, electroporation SVZ ילוד הוא עלות האפקטיבית וזמן כלי פולשנית יעיל למניפולציה הגנטית החולפת או קבועה והסימון של תאי מוח הקדמיים עצביים גזע ונוירונים יילוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין גילויים שיבצעו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממשרד ההגנה (פרס פיתוח רעיון, W81XWH-10-1-0041, א.ב.), CT תאי גזע המענק (א.ב.), והמכון לאומי לבריאות NRSA 10668225 (DMF). החומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת בחלקו על ידי מדינת קונטיקט במסגרת התכנית לקונטיקט לתאי הגזע למחקר המענקים. התוכן שלה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ואינם מייצג בהכרח את עמדתה הרשמית של מדינת קונטיקט, המחלקה לבריאות ציבור של מדינת קונטיקט או CT חידושים, Inc הממנים לא היו כל תפקיד בתכנון מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heavy Polished Borosilicate Tubing Sutter Instrument BF150-110-10
Dual-Stage Glass Micropipette Puller Narishige PC-10H
Fast Green Fischer Scientific 0521192205
ECM 830 Square Wave Pulse generator Harvard Apparatus 45-0052
Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0488
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-562-36
Tungsten Halogen lamp USHIO America, Inc 1002247
Picospritzer II Parker Instruments 052-0312-900

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
  3. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
  6. Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
  7. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  8. Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
  9. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
  10. de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
  11. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
  12. Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
  13. Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).

Tags

Neuroscience גיליון 72 ביולוגיה התפתחותית נוירוביולוגיה ביולוגיה מולקולרית ביולוגיה תאית פיזיולוגיה אנטומיה הנדסה ביו רפואית ביולוגיה של תאי גזע גנטיקה Neurogenesis צמיחה והתפתחות כירורגיה אזור Subventricular electroporation תאי גזע עצביים המועצה לביטחון לאומי אזור subventricular מוח ה-DNA זריקה הנדסה גנטית גורים ילודים מודל חיה
Electroporation האזור Subventricular ילודים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., More

Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197, doi:10.3791/50197 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter