Summary
我々は、新生児の脳室下帯のエレクトロポレーションと呼ばれる低侵襲技術を実証した。テクニックは、新生児の仔の側脳室にプラスミドDNAを注入し、提供し、遺伝的に神経幹細胞を操作するために電流を印加することで構成されています
Abstract
神経幹細胞（NSC）ライン生後側脳、ニューロン、アストロサイト、上衣細胞1を含む複数の細胞型を生じさせる。 NSCの自己複製、コミットメント、および分化に関わる分子経路を理解することは、活用のための脳を修復し、より良いの中枢神経系障害を理解するための独自の可能性が重要です。哺乳類のシステムを操作するための従来の方法は、全体の動物レベル2で、遺伝子工学の時間がかかり、高価な努力が必要でした。したがって、研究の大半は、in vitroまたは無脊椎動物におけるNSCの分子の機能を検討されている。
ここでは、新生児の脳室下帯（SVZ）エレクトロポレーションと呼ばれている新生児のNPCを操作するための簡単かつ迅速な技術を実証した。同様の技術は、胚NSCを研究するために十年前に開発されcorticaに関する研究を支援している3,4リットル開発。さらに最近では、これは5月7日出生後のげっ歯類の前脳を研究するために適用した。この手法は、SVZのNSCおよびその子孫の堅牢なラベリング結果。したがって、生後SVZエレクトロポレーションは、哺乳動物のNSCの遺伝子工学のためのコストと時間の効果的な代替手段を提供します。
Protocol
この手順では、エール大学動物実験委員会の要求に従ったものである。科学者は、動物実験委員会のガイドラインは、その制度上の要件に応じて承認され、使用されていることを確認する必要があります。
1。第1節。 DNAは、ソリューション、およびガラスピペットの作製
- 高純度（OD 280分の260> 1.80）、高濃度（μg/μlの> 2.5）エンドトキシンフリーのDNAを生成します。
- 22μmのフィルターを通して0.9％生理食塩水や滅菌フィルターを準備します。
- カンタル線を使用したモデルのPP-830ナリシゲPC-10ガラスピペットプラー場所に10cmの火災洗練されたホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ（1.10 mm外径：1.5ミリメートル、ID）を指定します。 70.5一歩ずつ加重プル℃にプーラーをセット円形の鉗子とのヒントを破ると、ギザギザの縁のための解剖顕微鏡で検査します。 15分間UVランプ下ベベルのヒントや場所。引っ張らピペットは先端の端から2ミリメートルでマークする必要があります。
- 重量/体積速いグリーンsoluti 0.1パーセントを準備乾いた速いグリーンで滅菌濾過0.9％食塩水を混合することにより、上の。
2。第2節。動物の準備、ガラスピペットの読み込みおよびプラスミドインジェクション
- ガラスシャーレ4〜予冷に、ケージ0から1までの子犬生後個別に場所を取り外し℃にした後、濡れた氷の上に置きます。
- 約5分後、足のピンチ応答を利用することによって、麻酔の状態を確認してください。脳室内注射への移動が発生しない場合は、件名子犬。
- ファストグリーン、DNA、および食塩水の組み合わせは急速な蒸発、結晶化、ガラスピペットの封鎖をもたらすことができることに注意するのは重要です。したがって、原液や注射直前にパラフィルム上にアリコート1から2μlを生成します。
- 引っ張らガラスピペットで分注し全体音量を吸引します。
- 親指とあなたの小さい利き手の人差し指で子犬の頭を保持する。
- ランプを点灯させdがちょうど光ビームの外に子犬の頭を保持する。必要であれば、子犬によって反射された光の量を減らすために、頭の上に生理食塩水を入れた。心室は現在点灯しなければならない。
- あなたの利き手を使用すると、（ 図1Aおよび1B）に最も近い側脳室に針を挿入します。注射部位は、ラムダ縫合および目と矢状縫合に横2ミリメートルからほぼ等距離にあるべきである。挿入は、側脳室への浸透性を確保すべき、P0は子犬のために2mmのマークにピペットを引っ張った。偶然にも、あなたは、頭蓋内圧のリリースからピペット内に髄液の充填バック表示される場合があります。プラスミドの注入を支援頭蓋内圧を減少させるために、pup.Step 2.8の頭の上にあなたのグリップを緩めます。エアプレッシャーインジェクター（Picospritzer、パーカー）を使用して、側脳室へのプラスミドの約0.5μLを注入します。
3。第3節。エレクトロポレーションおよびリカバリ
- SEトン5平方パルス、950ミリ秒間隔で100ボルトで50ミリ秒/パルス、エレクトロポレーション用の発電機の電圧。プラスミドエレクトロの空間特異性は、電荷転送の方向性によって決定される。細心の注意は、SVZ 8に沿って幹細胞集団の異質性を与えられた配置に与えられるべきである。増殖と細胞の運命のレートの違いは、腹と背吻側-尾位置9,10ために特定されました。
- プラスミドを注入された後、PBSにピンセット電極を浸す。このステップでは、電荷移動を最大にし、抵抗による熱傷を防止するためである。
- プラスミド注射部位（ 図1Cおよび1D）と同側の耳の近くに子犬の背側壁上に正極を配置します。子犬の鼻面に対側半球腹側部に負極を配置します。
- パルスフーツを押すことによって、現在の転送を開始する魔女は、背から約25°の角度間隔を使用して横方向に電極をペダルと掃く。
- 5分間加熱パッド上にエレクトロポレーションした子犬を置きます。優しく穏やかな刺激で子犬を30秒毎に回転させます。
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Representative Results
背側、背側、そしてピンセット電極の"抜本的な"運動（ 図1E）に続く横下帯と連続してほぼすべての放射状グリアの標識における新生児の脳室下帯エレクトロポレーション結果。しかし、エレクトロポレーションは、それぞれの実験の要件に合わせたが、電極を席巻し、ビデオに記載されている特定の配置と向きを使用していないことができます。例えば、背側に限局放射状グリアは、それらのライニングから心室の横断面を異なるため、1つは単一の領域9,10エレクトロポを選ぶことができます。さらに特異性も小さい電極を使用して指定することができます。
プラスミドDNAを迅速に最初の3週間11内に希釈される。したがって、プラスミドDNAを用いて同定するゲノム改変された細胞は推奨されません。この制限を回避するには、CREリコンビナーゼ発現プラスミドはIntrod学アールゲノム的に発現して蛍光タンパク質（tdTomato）12の上流のlox P部位に隣接停止シーケンスを持っているマウスへのGFPと共にuced。換え時には、停止シーケンスが削除され、蛍光タンパク質（ 図1F）で表されます。より多くのtdTomato陽性細胞が見られているのに対し、4週間後にエレクトロポレーション少数GFPプラスミド発現する細胞は脳室下帯で見られている。それはtdTomato発現細胞に比べて、はるかに少ないGFP発現細胞が存在することも明らかである嗅球を区画すると、しかし、両方が成熟顆粒細胞（ 図1G）の機能を取得しています。
図1。新生児の脳室下帯のエレクトロ。 （A）の模式図脳脊髄液（小ガモ）を含む脳室系と脊髄と子犬P0-P1（緑）をコードするプラスミドを増強GFP（EGFP）を注射強調した（B）の冠状断面は、注射部位と側脳室への相対的なパドルの向きを示す。（C）マイナス（ - ）の向き。注入子犬上でXYZ軸に対して（+）と正極子犬以下のエレクトロポレーション（D）の水平方向のビューは、EGFPをコードするベクターの（E）側脳室の画像が24時間以下のエレクトロポレーション。 （緑）（F）側脳室の画像は28日間tdTomatoの上流に終止コドンを持つマウスにCreリコンビナーゼおよびeGFPをコードするプラスミドをエレクトロポレーション後。組換えはtdTomato（赤）の発現を誘導する。ゲノム的に発現してtdTomato一方数少ないEGFP陽性SVZ細胞内のプラスミド結果の連続希釈物を、恒久的に表現されます。（G）プラスミドDNAの希釈（緑）は嗅球の顆粒細胞層でより多くの細胞は、ゲノムマーカー、tdTomato（赤）を発現することを考えれば明らかである。 LV：側脳室、OB：嗅球。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
ここでは詳細新生児SVZのエレクトロポレーションの技術は、急速かつ確実にラベルを付けたり、SVZの幹細胞およびその子孫を操作するためのテクニックを。エレクトロポレーションは、他の技術と比較して持っていることはいくつかの利点があります。まず、セルの焦点ラベリングを考えると、1は細胞自律的かつ非細胞自律的な効果を識別することです。誘導系を用いて、第2の、遺伝子操作は、1つのシナプス統合の前または後の効果を比較することができます。また、1は、loxP部位を含むプラスミドで、CRE発現するマウスをエレクトロポレーションによって、複数のプラスミドの使用を回避することができます。第四に、遺伝子レポータープラスミドは転写トランスを研究するために使用することができます。このケースでは、転写活性のみ操作された細胞で測定することができる;サブ領域が顕微解剖されるとき追加された特異性を導入することができる。第五に、一時的な継続的な増殖によるトランジット増幅細胞の標識と希釈OFプラスミドがチミジン類似体11で標識と同様の"birthdating"メソッドとして使用することができます。細胞の一過性の標識が欠点として見ることができるが、第六に、この技術は、ゲノム統合13を誘導するトランスポザーゼトランスポゾンペアに従順でなければならない。代わりに、現在進行中の神経新生はloxP部位7,11に挟まれた対立遺伝子を含むマウスのゲノム修飾を誘導するためにCREリコンビナーゼで変更できます。このプロトコルを使用して、新生ニューロンは、停止カセットがloxP部位12が隣接しているRosa26R·ストップ·tdTomatoマウスでは4ヶ月後のエレクトロまで同定された。一緒になって、新生児SVZのエレクトロポレーションは、一時的または永続的な遺伝子操作および前脳の神経幹細胞と新生ニューロンの標識のための費用効果的かつ効率的な時間の低侵襲なツールです。
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Disclosures
著者が作る全く開示していません。
Acknowledgments
この作品は、国防総省（アイデア開発賞、W81XWH-10-1-0041、AB）、CTの幹細胞助成金（A-B）、および健康NRSA 10668225ホルムアミド（DMF）の国立研究所からの補助金によって支えられている。本材料は、部分的にコネチカット幹細胞研究助成金プログラムの下コネチカット州によってサポートされた仕事に基づいています。その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもコネチカット、コネチカットやCTイノベーションの州の公衆衛生学教室の国の公式見解を示すものではない、（株）出資者は、データ収集を研究デザインに何の役割を持っていませんと分析、公表することを決定、または原稿の準備。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
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