Summary
Vi viser en minimalt invasiv teknikk kalt neonatal subventricular sone electroporation. Teknikken består i innsprøyting plasmid DNA inn i laterale ventrikkel av neonatale valper og tilføre elektrisk strøm for å levere og genetisk manipulere nevrale stamceller
Abstract
Nevrale stamceller (NSCs) linje postnatal sideventriklene og gi opphav til flere celletyper som inkluderer nevroner, astrocytes og ependymal celler en. Forstå de molekylære veier som er ansvarlige for NSC selvfornyelse, engasjement og differensiering er kritisk for å utnytte deres unike potensial til å reparere hjernen og bedre forstå sentrale nervesystemet lidelser. Tidligere metoder for manipulering av pattedyr systemer kreves det tidkrevende og dyrt bestrebelse av genteknologi ved hele dyret nivå 2. Dermed har det store flertallet av studier utforsket funksjonene NSC molekyler in vitro eller in virvelløse dyr.
Her viser vi den enkle og raske teknikk for å manipulere neonatal NPCer som er referert til som neonatal subventricular sone (SVZ) electroporation. Lignende teknikker ble utviklet for et tiår siden for å studere embryonale NSCs og har hjulpet studier på cortical utvikling 3,4. Mer nylig denne ble brukt til å studere postnatal gnager forebrain 5-7. Denne teknikken resulterer i robust merking av SVZ NSCs og deres avkom. Dermed gir postnatal SVZ electroporation en kostnadseffektiv og tidsbesparende alternativ for pattedyr NSC genteknologi.
Protocol
Denne fremgangsmåten er i samsvar med Yale IACUC krav. Forskere bør sørge for at IACUC retningslinjer er godkjent og fulgt i henhold til deres institusjonelle krav.
1. § 1. Utarbeidelse av DNA, Solutions, og Glass Pipettes
- Generere høy renhet (OD 260/280> 1,80) høy konsentrasjon (ug / pl> 2,5) endotoksin-fri DNA.
- Forbered 0,9% saltløsning og sterilt filter gjennom et 22 um filter.
- Sted 10 cm brann polert borosilicate glass kapillarrør (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) i en modell PP-830 Narishige PC-10 glass pipette avtrekker med en kanthal wire. Still puller til en ett skritt vektet trekke på 70,5 ° C. Break tips med sirkulære tang og inspisere under et disseksjonsmikroskop for skarpe kanter. Bevel tips og sted under en UV-lampe for 15 min. Trukket pipetter bør merkes ved 2 mm fra kanten av spissen.
- Forbered 0,1% vekt / volum raskt grønne solutipå ved å blande sterilfiltrert 0,9% saltløsning med tørr raskt grønne.
2. § 2. Animal Forberedelse, Glass Pipetter Lasting og Plasmid Injection
- Fjern postnatal dag 0-1 valper individuelt fra merdene, sted på et glass petriskål pre-kjølt til 4 ° C, og deretter sted på våt is.
- Etter ca 5 min, fastslå anesthetization ved å utnytte foten klype respons. Hvis ingen bevegelse oppstår, underlagt valper til intraventrikulære injeksjon.
- Det er viktig å merke seg at kombinasjonen av raskt grønne, DNA, og saltvann kan resultere i hurtig fordampning, krystallisering, og blokade av glass pipetter. Derfor generere en stamløsning og alikvoter 1-2 pl bort Parafilm umiddelbart før injeksjoner.
- Aspirer hele alikvoteres volumet med trakk glass pipette.
- Hold hodet på valpen mellom tommelen og pekefingeren på mindre dominerende hånd.
- Slå på lampen end holde hodet av valpen like utenfor lysstråle. Hvis nødvendig, sette saltoppløsning på hodet for å redusere mengden av lys som reflekteres av pup. Ventriklene skal nå bli belyst.
- Med din dominerende hånd, stikk nålen inn i laterale ventrikkel nærmest deg (Figur 1A og 1B). Injeksjonsstedet skal være omtrent like langt fra bakhode sutur og øyne og 2 mm lateralt for sagittal sutur. Sett trakk pipette til 2 mm mark for en P0 valp, som skal sikre inntrengning i den laterale ventrikkel. Tilfeldigvis, kan du se tilbake fylling av CSF inn i pipetten fra utgivelsen av intrakranielt trykk. For å redusere intrakranielt trykk, som bistår i injeksjon av plasmid, løsne grepet på hodet av pup.Step 2.8. Injiser lag 0,5 pl plasmid inn lateral ventrikkel ved hjelp av en luft-presset injektor (Picospritzer, Parker).
3. § 3. Electroporation and Recovery
- Set spenningen av electroporation generator for 5 kvadrat pulser, 50 msek / puls på 100 volt, med 950 msek intervaller. Den romlige spesifisitet av plasmid elektroporering er diktert av direktivitet omkostninger overføring. Lukk oppmerksomhet bør gis til plassering gitt heterogenitet av stamcelleforskningen populasjoner langs SVZ 8. Forskjeller i forekomst av spredning og celle skjebne er identifisert for ventral-dorsal og rostral-caudal steder 9,10.
- Når plasmidet blir injisert, dip pinsetten elektroder inn PBS. Dette trinnet er å maksimere kostnad overføring og for å unngå forbrenning forårsaket av resistivitet.
- Plasser den positive elektroden på dorsal laterale veggen av pup nær øret ipsilaterale til området av plasmid injeksjon (figur 1C og 1D). Plasser den negative elektroden på motsatt halvkule ventral lateral til valpen snute.
- Initiere strømovergang ved å trykke pulsen footsheks pedal og feie elektrodene fra dorsal til lateral bruke ~ 25 ° vinkel intervaller.
- Sted electroporated valper på en varmepute i 5 min. Rotèr valper hvert 30 sek med mild stimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neonatal subventricular sone electroporation resultater i merking av nesten alle radial gliaceller sammenhengende med dorsal, dorsal lateral, og lateral subventricular sone etter "feiing" bevegelse av pinsetten elektroden (Figur 1E). Imidlertid kan elektroporering tilpasses kravet av den respektive eksperimentet, men ikke feiende elektroden og med bestemte plassering og orientering som beskrevet i videoen. For eksempel, siden dorsally lokalisert radial gliaceller forskjellige fra de fôr den laterale delen av ventrikkelen, kan man velge å bare electroporate en enkelt region 9,10. Ytterligere spesifisitet kan også gis ved hjelp av mindre elektroder.
Plasmid DNA raskt fortynnes innen de tre første ukene 11. Derfor er identifisering genomically modifiserte cellene ved hjelp av plasmid DNA anbefales ikke. For å omgå denne begrensningen, er CRE rekombinase uttrykker plasmider introduced sammen med GFP i mus som har en stopp-sekvens flankert av lox P områder oppstrøms av en genomically uttrykt fluorescerende protein (tdTomato) 12. Ved rekombinasjon, blir stopp sekvensen fjernet og fluorescerende protein uttrykkes (Figur 1F). Av fire uker etter electroporation få GFP plasmid uttrykke celler blir sett i subventricular sonen mens mange flere tdTomato positive celler blir sett. Ved seksjonering luktelappen det er også klart at i forhold til tdTomato uttrykke celler, langt færre GFP uttrykke celler er til stede, men begge har fått funksjoner i modne granule celler (figur 1G).
Figur 1. Neonatal subventricular Zone Electroporation. (A) Skjematisk diagram av enP0-P1 valp med ventrikulære systemet og ryggmargen som inneholder cerebrospinalvæsken (teal) fremhevet injisert med forbedret GFP (eGFP) koding plasmid (grønn). (B) Koronal delen viser orientering av padleårer forhold til injeksjonsstedet og lateral ventrikkel. (C) Orientering av negative (-).. og positiv (+) elektroder med hensyn til XYZ aksen på injisert pup (D) Horisontal visning av en valp etter electroporation (E) Bilde av den laterale ventrikkel 24 timer etter electroporation av en eGFP-koding vektor (grønn). (F) Bilde av den laterale ventrikkel 28 dager etter electroporation av CRE recombinase-og eGFP-koding plasmider i mus som bærer en stoppkodonet oppstrøms tdTomato. Rekombinasjon induserer uttrykk for tdTomato (Red). Suksessive fortynninger av plasmid resultat i få gjenværende eGFP positive SVZ celler mens genomically uttrykt tdTomato er permanent uttrykk. (G)Fortynning av plasmid DNA (grønn) er tydelig gitt at flere celler i granulen cellelaget av luktelappen uttrykker genomisk markør, tdTomato (rød). LV: lateral ventrikkel; OB: luktelappen. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi detalj teknikken neonatal SVZ electroporation, en teknikk for å raskt og robust merke og manipulere SVZ stamceller og deres avkom. Det er flere fordeler som elektroporering har i forhold til andre teknikker. Først, gitt fokal merking av celler, er man i stand til å skjelne celle selvstyrte og ikke-celle autonome effekter. Sekund, genetisk manipulasjon hjelp induserbare systemer tillater en å sammenligne effekter før eller etter synaptiske integrasjon. Videre kan man omgå bruken av flere plasmider ved electroporating CRE uttrykkende mus med plasmider inneholdende loxP nettsteder. Fjerde, kan genet reporter plasmider brukes til å studere transcriptional transactivation. I dette tilfellet, kan transkripsjonelle aktivitet måles bare i celler som er manipulert; tilsatt spesifisitet kan bli innført når underregioner blir microdissected. Femte, forbigående merking av transitt forsterke celler som følge av fortsatt spredning og fortynning of plasmidet kan bli brukt som "birthdating" metoden lik merking med tymidin analogene 11. Sjette, selv om forbigående merking av celler kan bli sett på som en ulempe, bør teknikken være mottakelig for transposase-transposon parene å indusere genomisk integrering 13. Alternativt kan pågående neurogenesis endres med CRE recombinase å indusere genomisk modifisering av mus inneholder alleler flankert av loxP områder 7,11. Ved hjelp av denne protokollen, ble nyfødte nerveceller identifisert opptil fire måneder etter electroporation i Rosa26R-Stop-tdTomato mus der stopper kassetten er flankert av loxP områder 12. Til sammen er neonatal SVZ electroporation en kostnadseffektiv og tidseffektiv minimal invasiv verktøy for forbigående eller permanent genetisk manipulasjon og merking av forebrain nevrale stamceller og nyfødte nerveceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer å gjøre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Department of Defense (Idéutvikling award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT Stamcelleforskningen stipend (AB), og en National Institute of Health NRSA 10668225 (DMF). Det foreliggende materiale er basert på arbeid delvis støttet av staten Connecticut under Connecticut Stem Cell Research Grants Program. Innholdet er utelukkende ansvaret av forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle syn i staten Connecticut, Department of Public Health i delstaten Connecticut eller CT Innovations, hadde Inc. organer ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
