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Medicine

रोगी व्युत्पन्न सेल संस्कृति और CD133 का अलगाव Published: March 13, 2013 doi: 10.3791/50200
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1,3,4
1Institute of Pathology, Laboratory of Molecular Tumor Pathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2Institute for Chemistry and Biochemistry, Free University Berlin, 3Laboratory for Functional Genomics Charité (LFGC), Charité - Universitätsmedizin Berlin, 4Comprehensive Cancer Center Charité, Charité - Universitätsmedizin Berlin

Summary

इस अनुच्छेद के हौसले से प्राप्त प्राथमिक सेल संस्कृतियों, और ट्यूमर कोशिकाओं से एरिथ्रोसाइट्स और fibroblasts की contaminations को दूर करने में मेलेनोमा के ऊतकों की तैयारी का वर्णन करता है. अंत में, हम वर्णन CD133 कैसे

Abstract

उपलब्ध मेलेनोमा आज के लिए बेहतर उपचार विकल्प के बावजूद, उन्नत घातक मेलेनोमा के साथ रोगियों को अब भी प्रगति से मुक्त और समग्र अस्तित्व के लिए एक गरीब पूर्वानुमान है. इसलिए, translational अनुसंधान के लिए घातक मेलेनोमा के लिए लक्षित चिकित्सा में सुधार के लिए आगे आणविक सबूत उपलब्ध कराने की जरूरत है. अतीत में, oncogenic मेलेनोमा के लिए संबंधित तंत्र में बड़े पैमाने पर स्थापित सेल लाइनों में अध्ययन किया गया. अधिक व्यक्तिगत उपचार regimens व्यक्तिगत आनुवंशिक प्रोफाइल के आधार पर करने के लिए रास्ते पर, हम रोगी व्युत्पन्न सेल लाइनों के बजाय सामान्य सेल लाइनों का उपयोग करने का प्रस्ताव है. रोगी का पालन पर विशेष रूप से उच्च गुणवत्ता नैदानिक ​​डेटा, के साथ साथ, इन कोशिकाओं को बेहतर मेलेनोमा प्रगति के पीछे आणविक तंत्र को समझने में सहायक होगा.

यहाँ, हम dissected ताजा ट्यूमर ऊतक से प्राथमिक मेलेनोमा संस्कृतियों की स्थापना की रिपोर्ट. इस क़ीमा और एकल कक्षों में ऊतक के पृथक्करण प्रक्रिया फिर शामिलएरिथ्रोसाइट्स और fibroblasts के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्राथमिक संस्कृति और 'कोशिकाओं मेलेनोमा मूल के विश्वसनीय सत्यापन के साथ contaminations के moval.

हाल की रिपोर्टों से पता चला है कि मेलानोमा, ट्यूमर के बहुमत की तरह, बंदरगाह कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) है, जो करने के लिए विशेष रूप से ट्यूमर और metastatic राज्य की ओर दीक्षा प्रगति ईंधन लगता है की एक छोटा सा subpopulation. सीएससी पहचान और मेलेनोमा में अलगाव के लिए महत्वपूर्ण मार्करों के CD133 है. प्राथमिक मेलेनोमा संस्कृतियों से CD133 + सीएससी को अलग करने के लिए, हम संशोधित और चुंबकीय सक्रिय सेल (एमएसीएस) Miltenyi से प्रक्रिया छँटाई उच्च छँटाई पवित्रता में जिसके परिणामस्वरूप और CD133 + सीएससी और CD133 की व्यवहार्यता अनुकूलित थोक, जो खेती की जा सकती है और कार्यात्मक विश्लेषण उसके बाद.

Introduction

Cutaneous घातक मेलानोमा त्वचा कैंसर के कम से कम आम है, अभी तक सबसे घातक हैं. एक बढ़ती हुई घटना, दुष्टता और एक तेजी से प्रसार का एक उच्च ग्रेड, घातक त्वचा से संबंधित होने वाली मौतों 1,2 ट्यूमर के 75% के लिए अब मेलानोमा खाते के कारण. प्राथमिक ट्यूमर, कीमोथेरेपी, रेडियोथेरेपी, immunotherapy और संयुक्त chemo और metastasized मेलेनोमा के immunotherapy के सर्जिकल छांटना के अलावा राज्य के कला उपचार मेलेनोमा 3,4 के लिए रणनीतियों रहे हैं. हालांकि, घातक मेलेनोमा chemotherapeutics के लिए एक गरीब प्रतिक्रिया (5-12%) 5,6, और मेलेनोमा BRAF V600E जीन उत्परिवर्तन लाभ उपचार के रूप में नए लक्षित चिकित्सा का वादा से ले जाने के लिए 7 vemurafenib के साथ रोगियों के केवल उन 50-70% के द्वारा होती है समग्र अस्तित्व में सुधार, मेलेनोमा tumorigenesis के तंत्र की एक बेहतर समझ की जरूरत है.

अतीत में, अच्छी तरह से स्थापित वाणिज्यिक में उन तंत्र का अध्ययनखासकर उपलब्ध सेल लाइनों का इस्तेमाल किया गया. कैंसर दीक्षा और प्रगति की आणविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए और अधिक करने के लिए हाल ही में दृष्टिकोण प्राथमिक ट्यूमर ऊतक से सीधे प्राप्त संस्कृतियों का उपयोग एक रणनीति असर कई गुना लाभ: शोधकर्ता रोगी और ऊतक चयन का पूरा नियंत्रण है. नमूना कोशिकाओं expertly चयनित ट्यूमर ऊतक से प्राप्त की है, अपने सभी विषमताओं से ट्यूमर के समान है और रोगी का पालन कर डेटा और एक विस्तृत विकृति संस्कृति की विशेषताओं मूल 8 ट्यूमर के उन लोगों के साथ तुलना करने के लिए अनुमति देते हैं के लिए उपलब्ध है.

इसके विपरीत, कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में प्रासंगिक मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित सेल लाइनों का उपयोग विवादास्पद ढंग से चर्चा की है. पहले से ही 1987 में ओसबोर्न और उनके सहयोगियों ने अलग 9 प्रयोगशालाओं से महत्वपूर्ण जैविक MCF-7 मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के बीच मतभेद का वर्णन किया. इस व्यापक जीनोमिक अस्थिरता और परिवर्तन आरएनए अभिव्यक्ति में subculture दौरान सह थाद्वारा Hiorns एट अल nfirmed और सबूत है कि सेल लाइनों संस्कृति में विकसित करते हैं, जिससे मानव 10 कैंसर के मॉडल के रूप में स्थापित संस्कृतियों के प्रत्यक्ष प्रासंगिकता को कमजोर करने के लिए सहायक डेटा प्रदान की.

एक अन्य महत्वपूर्ण विचार है, जो मोटे तौर पर कई वर्षों तक नजरअंदाज कर दिया गया है या असंबंधित 'गलत' कोशिकाओं है, जो पहली बार प्रदर्शन के द्वारा किया गया था पर बीस साल पहले प्रकाश डाला साथ संस्कृतियों के संदूषण अतिवृद्धि का जोखिम यह है कि सेल लाइनों की एक बड़ी संख्या HeLa द्वारा दूषित थे 8,11 कोशिकाओं. 'गलत' सेल लाइनों से डेटा के अशुद्ध अर्थ के लिए हाल ही में साहित्य में फिर से प्रकाश में आया है. डीएनए प्रोफाइलिंग और आणविक कोशिकाजननप्रकरण के संयोजन का उपयोग, MacLeod एट अल. से पता चला है कि कि 252 नए ट्यूमर व्युत्पन्न मानव कोशिका लाइनों के जर्मन सूक्ष्मजीवों और सेल संस्कृतियों (DSMZ) के संग्रह में जमा लगभग 18% intraspecies होना पाया गया या पार interspecies 12,13 contaminants.

इन समस्याओं से बचने के लिए और उपर्युक्त फायदे का उपयोग करना, हम हौसले excised metastases से कम पारित होने मेलेनोमा सेल लाइनों की स्थापना करने का निर्णय लिया.

मजबूत सेल जुदाई और विश्लेषण तकनीकों एकल कोशिका तैयारी जबकि एक साथ सेल और विशेषता सतह प्रोटीन की मौत, विनाश सीमित उत्पन्न करने के लिए आवश्यकता होती है. एकल कोशिका निलंबन में ऊतकों के स्वचालित हदबंदी के लिए एक benchtop साधन gentleMACS Dissociator Miltenyi द्वारा निर्मित है. जब gentleMACS सी ट्यूब्स और अनुकूलित पृथक्करण समाधान, एक बंद व्यवस्था में ट्यूमर ऊतक के एक प्रभावी और कोमल हदबंदी के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया, जबकि प्रतिजन epitopes के संरक्षण और सेल नुकसान को कम करने के हासिल की है. साधन अनुकूलित, विशिष्ट अनुप्रयोगों और मानकीकृत तैयारी guaranties मेलेनोमा ऊतक 14 से एकल कोशिका निलंबन की एक किस्म के लिए पूर्व निर्धारित कार्यक्रम प्रदान करता है.

<पी वर्ग = "jove_content"> हाल ही में पता चला है कि ट्यूमर के बहुमत तथाकथित कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) है, जो विशेष रूप से ट्यूमर की शुरुआत और क्षमता स्वयं renewing एक्ज़िबिट का एक छोटा सा subpopulation बंदरगाह रिपोर्ट. melanocyte उत्पादन त्वचा की dermis में स्टेम कोशिकाओं की पहचान परिकल्पना के लिए नेतृत्व किया है कि इन कोशिकाओं मेलेनोमा में कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) की उत्पत्ति हो UVA विकिरण के लिए जोखिम के बाद से घातक 15 परिवर्तन के लिए इन कोशिकाओं को प्रधानमंत्री कर सकते हैं हो सकता है. इस तरह के एक आनुवंशिक घाव के परिणाम कोशिकाओं है कि ट्यूमर और स्टेम सेल विशेषताओं का एक संयोजन बंदरगाह होगा.

प्रमुख मेलेनोमा में सीएससी की subpopulation का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रस्तावित मार्करों के 16-20 CD133 है. (भी 1 Prominin के रूप में जाना जाता है) CD133, pentaspan transmembrane glycoproteins के एक सदस्य, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं, endothelial पूर्वज कोशिकाओं, neuronal और glial स्टेम कोशिकाओं 21-23 में व्यक्त की है. CD133 की अभिव्यक्ति के साथ जोड़ा जाता हैअसममित सेल 24, विभाजन और CD133 के ग्लाइकोसिलेटेड का मिलान करने के लिए सेल 25 भेदभाव पर downregulated होना दिखाया गया था. हाल ही में, CD133 + मेलेनोमा कोशिकाओं आत्म नवीकरण और ट्यूमर दीक्षा 19,20 क्षमता के लिए दिखाया गया है.

CD133 + ख्यात मेलेनोमा सीएससी के समारोह का अध्ययन करने के लिए, हम संशोधित और चुंबकीय सक्रिय सेल प्रणाली (एमएसीएस) Miltenyi बायोटेक से छंटाई करने के लिए CD133 अत्यधिक समृद्ध और व्यवहार्य आबादी + CD133 और प्राप्त करने के लिए अनुकूलित - कोशिकाओं.

चुंबकीय सेल मनका आधारित जुदाई या तो नकारात्मक चयन के लिए अनुमति देता है Matheu एट अल द्वारा दिखाया के रूप में 26 या सकारात्मक चयन के रूप में हम यहाँ दिखाने. सकारात्मक चयन के दौरान विशेष लक्ष्य कोशिका प्रकार, जैसे CD133 व्यक्त कोशिकाओं, चुंबकीय microbeads, 50 एनएम superparamagnetic कणों कि एक के खिलाफ अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी संयुग्मित हैं लेबल के साथविशेष सेल सतह प्रतिजन. जुदाई के दौरान, चुंबकीय लेबल की कोशिकाओं के भीतर स्तंभ विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में बनाए रखा जाता है, जबकि unlabeled कोशिकाओं के माध्यम से प्रवाह. धोने कदम के बाद, स्तंभ विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र से हटा दिया जाता है, और लक्ष्य कोशिकाओं स्तंभ से eluted हैं. लोकसभा या एमएस स्तंभों उच्च शुद्धता के साथ लेबल और unlabeled कोशिकाओं के भागों में सकारात्मक चयन के परिणाम के दौरान प्रयोग किया जाता है. दूसरी ओर, LD कॉलम, नकारात्मक चयन के लिए प्रयोग किया जाता है, लेबल अंश की पवित्रता में थोड़ा कम हो सकता है. उनके मैट्रिक्स की पैकिंग के denser के कारण इन स्तंभों में प्रवाह की दर कम स्तंभ में फंस जा unlabeled कोशिकाओं के एक उच्च जोखिम में जिसके परिणामस्वरूप है. LD कॉलम इसलिए एक अवांछित सेल subpopulation के कड़े कमी के लिए ही किया जाना चाहिए. सकारात्मक चयन microbeads साथ (microbeads के लिए युग्मित एंटीबॉडी) प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष चुंबकीय (लेबलिंग ऊष्मायन द्वारा किया जा सकता है incubatio के बाद प्रदर्शनप्राथमिक एंटीबॉडी के साथ n). विशिष्ट एमएसीएस microbeads प्रोस्टेट या 27 मेलेनोमा की तरह प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं के कई सेल प्रकार के सकारात्मक चयन के लिए उपलब्ध हैं.

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Protocol

प्राथमिक ट्यूमर, प्राथमिक सेल संस्कृति, fibroblast रिक्तीकरण और CD133 के चुंबकीय सेल छँटाई के ऊतक लक्षण वर्णन से एकल कोशिकाओं की तैयारी सहित प्रयोग के समग्र योजना और CD133 - मेलेनोमा कोशिकाओं चित्र 1 में दिखाया गया है.

1. नमूना अधिग्रहण

  1. नैतिक अनुमोदन के लिए अगले चरणों का विचार करने से पहले की जाँच करें.
  2. बाँझ पीबीएस 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन अंतिम एकाग्रता और सर्जरी या टीम पर हाथ के साथ पूरक के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब तैयार.
  3. सर्जरी से सेल संस्कृति प्रयोगशाला में 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूमर ऊतक के तेजी से परिवहन व्यवस्थित

2. ट्यूमर ऊतक से प्राथमिक मेलेनोमा एकल कोशिकाओं की तैयारी

  1. बाँझ शर्तों के तहत सभी चरणों को पूरा करें.
  2. ट्यूमर resecting से पहले, एक पृथक्करण मिश्रण तैयार करने की जरूरत है. 2-4 छ ऊतक प्रति 10 मिलीलीटर हदबंदी मिश्रण की आवश्यकता है. मिश्रण Immedia इस्तेमाल किया जा सकता हैtely या बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर aliquots में संग्रहित है.
    1. एक 150 मिमी सोडियम क्लोराइड युक्त समाधान तैयार. मिश्रण एक भंवर का उपयोग कर जब तक समाधान स्पष्ट है. यदि आवश्यक हो बाँझ छानना सोडियम क्लोराइड समाधान एक 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग.
    2. DNase मैं वजन और 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर DNase मैं 150mm सोडियम क्लोराइड में युक्त समाधान तैयार. Inverting द्वारा मिक्स जब तक समाधान स्पष्ट है.
    3. एक पीबीएस में 100mg/ml Collagenase चतुर्थ युक्त समाधान तैयार. Inverting द्वारा मिक्स जब तक समाधान स्पष्ट है. कोलैजिनेज समाधान की aliquots -20 डिग्री सेल्सियस में कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
    4. 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 मिलीग्राम / एमएल Collagenase चतुर्थ और 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर DNase मैं क्वांटम 263 मध्यम में एक अंतिम एकाग्रता के साथ हदबंदी मिश्रण तैयार. मिश्रण का उपयोग कर एक भंवर. वैकल्पिक: जब मेलेनोमा त्वचा जोड़ amphotericin बी समाधान से हदबंदी मिश्रण करने के लिए 1.5 ग्राम / एमएल amphotericin बी के एक अंतिम एकाग्रता व्युत्पन्न ऊतक का उपयोग
  3. पूर्व गर्म अनुरोध37 हदबंदी मिश्रण, पीबीएस और क्वांटम 263 मध्यम uired मात्रा ° सी.
  4. एक बाँझ पेट्री डिश पर जगह ट्यूमर ऊतक. ऊतक से अत्यधिक समाधान Aspirate और 500 μl हदबंदी मिश्रण जोड़ें. 2-4 मिमी के छोटे टुकड़े ताजा, बाँझ नलियां का उपयोग में ट्यूमर क़ीमा.
  5. स्थानांतरण 2-4 छ एक gentleMACS सी 5 मिलीग्राम हदबंदी मिश्रण युक्त ट्यूब में ट्यूमर ऊतक कीमा बनाया हुआ. अतिरिक्त 4.5 मिलीलीटर हदबंदी मिश्रण के साथ पेट्री डिश कुल्ला और gentleMACS सी ट्यूब शेष ऊतक टुकड़े जोड़ने.
  6. बंद gentleMACS सी ट्यूब और उल्टा यह आस्तीन का gentleMACS Dissociator पर देते हैं. भागो gentleMACS कार्यक्रम "h_tumor_01".
  7. Dissociator से gentleMACS सी ट्यूब अलग और 37 पर 30 मिनट के लिए नमूना सेते हैं ° C निरंतर सर्वाधिक रन गति (12 rpm) पर या ट्यूब मैन्युअल मोड़ द्वारा हर 5 मिनट बसे ऊतक टुकड़े resuspend MACSmix ट्यूब अंग को घुमानेवाली पेशी का उपयोग कर रोटेशन के तहत .
  8. GentleMACS सी टी के आस्तीन ट्यूब पर उल्टा संलग्नवह gentleMACS Dissociator और चलाने के gentleMACS कार्यक्रम "h_tumor_02".
  9. Dissociator से gentleMACS सी ट्यूब अलग और 37 पर 30 मिनट के लिए नमूना सेते हैं ° C निरंतर सर्वाधिक रन गति (12 rpm) पर या ट्यूब मैन्युअल मोड़ द्वारा हर 5 मिनट बसे ऊतक टुकड़े resuspend MACSmix ट्यूब अंग को घुमानेवाली पेशी का उपयोग कर रोटेशन के तहत .
  10. आस्तीन का gentleMACS Dissociator पर gentleMACS सी ट्यूब उल्टा संलग्न gentleMACS कार्यक्रम "h_tumor_03" चलाते हैं.
  11. से dissociator, resuspend नमूना gentleMACS सी ट्यूब अलग और एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी एक 50 मिलीलीटर ट्यूब पर रखा सेल निलंबन लागू. यदि फिल्टर के clogging होता है, एक बाँझ फिल्टर टिप के साथ सेल निलंबन हलचल तक पूरा निलंबन के माध्यम से भाग गया.
  12. 5 मिलीलीटर क्वांटम 263 मध्यम के साथ सेल झरनी कुल्ला.
  13. वैकल्पिक: अगर आप अभी भी ऊतक क्वांटम 263 मध्यम और उन्हें एक उपयुक्त सेल संस्कृति जिले में बीज में फिल्टर, resuspend टुकड़े में छोड़ दिया टुकड़ेज. 37 में टुकड़े सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  14. सेल झरनी त्यागें और पचा सेल निलंबन के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब बंद. 5 मिनट के लिए 300 XG सेल निलंबन और अपकेंद्रित्र तैरनेवाला त्यागें.
  15. वैकल्पिक: अगर सेल गोली कारण के एक उच्च राशि एरिथ्रोसाइट्स डबल आसुत जल, resuspend सेल गोली में 500 μl पीबीएस में 10x समाधान 1:10 गिराए द्वारा 1x लाल रक्त सेल समाधान तैयार करने के लिए और 5 मिलीग्राम 1x लाल रक्त सेल जोड़ने लाल दिखाई देता है समाधान. भंवर 5 सेकंड और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. 5 मिनट के लिए 300 XG अपकेंद्रित्र और तैरनेवाला त्यागें.
  16. क्वांटम 263 और बीज उचित सेल संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं के साथ ट्यूमर कोशिकाओं Resuspend. संस्कृति 37 में ट्यूमर कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 और नियमित बीतने के कोशिकाओं जब वे 80% संगम तक पहुँचते हैं.

3. प्राथमिक सेल संस्कृति और तंतुकोशिका रिक्तीकरण की विशेषता

  1. प्राथमिक सेल संस्कृति phenotypically एक microsco का उपयोग कर का विश्लेषणपे.
  2. प्राथमिक सेल संस्कृति की एक छोटी राशि (0.5x 10 6 कोशिकाओं) फसल और neoplastic, मेलेनोमा, स्टेम सेल और stroma सेल मार्कर जीनों के लिए प्राइमरों के साथ RT-पीसीआर प्रदर्शन. सबसे महत्वपूर्ण जीन का विश्लेषण करने के लिए CD90 (fibroblast मार्कर), (मेलेनोमा / melanocyte मार्कर) TYR, CD133 (कैंसर स्टेम सेल मार्कर), CD83 (परिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं के लिए मार्कर) और एक गृह व्यवस्था जीन (जैसे HPRT या GAPDH) हैं.
  3. यदि सूक्ष्म विश्लेषण और RT-पीसीआर के दौरान CD90 की उच्च अभिव्यक्ति fibroblasts के साथ प्राथमिक मेलेनोमा संस्कृति की एक उच्च संदूषण का पता चला, आप Miltenyi से विरोधी Fibroblasts microbeads और डी स्तंभ का उपयोग fibroblasts व्यय की जरूरत है.

4. CD133 के चुंबकीय सेल छँटाई + और ​​CD133 - मेलेनोमा रास स्तंभ कोशिकाओं का उपयोग कर

  1. एमएसीएस 2 मिमी EDTA और पीबीएस में 5% FCS युक्त बफर तैयार. Inverting और बाँझ छानना 0.22 सुक्ष्ममापी Steritop जीपी फिल्टर यूनिट का उपयोग बफर द्वारा मिक्स. सर्द 4-8 डिग्री सेल्सियस के लिए बफरऔर उपयोग से पहले degas.
  2. पूर्व गर्म Accutase Pbs, और 37 के लिए क्वांटम 263 मध्यम डिग्री सेल्सियस
  3. पीबीएस के साथ 80% सहधारा कोशिकाओं धो लें. Accutase की उचित मात्रा में जोड़ें और जब तक कोशिकाओं संस्कृति सतह से अलग सेते हैं. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में क्वांटम 263 मध्यम का उपयोग कोशिकाओं को इकट्ठा.
  4. सेल नंबर निर्धारित और 5 मिनट के लिए कोशिकाओं के लिए आवश्यक संख्या (Miltenyi प्रोटोकॉल के अनुसार 2x 10 9 कोशिकाओं की एक अधिकतम संख्या लोकसभा कॉलम सेल लाइन विशिष्ट इष्टतम संख्या प्रति लोड किया जा सकता है और निर्धारित किया जाना चाहिए काफी कम किया जा सकता है.) अपकेंद्रित्र XG 300 और 4-8 डिग्री सेल्सियस पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
  5. Resuspend 1x 350 μl एमएसीएस बफर के साथ 10 8 कोशिकाओं की एक अधिकतम (के लिए उच्च सेल नंबर सभी निम्नलिखित एमएसीएस बफर पैमाने, FCR अवरुद्ध अभिकर्मक, CD133/1-Biotin और विरोधी बायोटिन microbeads संस्करणों के अनुसार).
  6. 100 μl FCR अवरुद्ध अभिकर्मक जोड़ें.
  7. 50 μl CD133/1-Biotin जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और 4-8 पर भंवर सेते का उपयोग ° C चया 10 मिनट.
  8. 5 मिनट के लिए 300 XG और 4-8 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर एमएसीएस बफर और अपकेंद्रित्र जोड़ने द्वारा कोशिकाओं को धो पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
  9. दोहराएँ धोने कदम (4.8)
  10. Resuspend सेल गोली 400 μl एमएसीएस बफर के साथ.
  11. 100 μl विरोधी बायोटिन microbeads जोड़ें. मिश्रण अच्छी तरह से 15 मिनट के लिए एक और 4-8 डिग्री सेल्सियस पर भंवर सेते का उपयोग कर.
  12. इस बीच, चुंबकीय जुदाई के लिए एमएसीएस विभाजक तैयार. एमएसीएस विभाजक मल्टी खड़े हो जाओ QuadroMACS संलग्न. QuadroMACS के चुंबकीय क्षेत्र में सामने स्तंभ पंखों के साथ रास स्तंभों की अपेक्षित संख्या डालें. प्रत्येक लोकसभा स्तंभ और एक उपयुक्त संग्रह ट्यूब (15 मिलीग्राम या 50 मिलीलीटर) में हर स्तंभ के अंतर्गत एक फ़िल्टर पूर्व पृथक्करण (30 सुक्ष्ममापी नायलॉन जाल के साथ) रखें. 3 मिलीलीटर एमएसीएस बफर के साथ rinsing द्वारा फिल्टर और स्तंभ तैयार. प्रवाह के माध्यम से त्यागें.
  13. 5 मिनट के लिए 300 XG और 4-8 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर एमएसीएस बफर और अपकेंद्रित्र जोड़ने द्वारा कोशिकाओं को धो पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
  14. 500 μl के साथ कोशिकाओं Resuspendएमएसीएस बफर और पूर्व फ़िल्टर पृथक्करण के साथ सेल निलंबन LS स्तंभ पर लागू होते हैं.
  15. स्तंभ 3 मिलीलीटर प्रति एमएसीएस बफर के साथ तीन बार धोएं. केवल नए बफर जोड़ने जब स्तंभ जलाशय खाली है.
  16. सेल अंश एकत्र कुल प्रवाह unlabelled CD133 शामिल हैं.
  17. पूर्व पृथक्करण फ़िल्टर छोड़ें, विभाजक से स्तंभ को हटाने और यह एक उपयुक्त संग्रह ट्यूब पर जगह है.
  18. 5 मिलीलीटर एमएसीएस बफर लागू. तुरंत बाहर मजबूती से स्तंभ में सवार धक्का द्वारा लेबल CD133 + कोशिकाओं को फ्लश.
  19. नकारात्मक अंश की शुद्धता को बढ़ाने के लिए, एक नया equilibrated लोकसभा QuadroMACS में डाला स्तंभ पर सेल निलंबन लागू होते हैं. अंश - प्रवाह CD133 शामिल हैं.
  20. स्तंभों त्यागें.

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Representative Results

ट्यूमर ऊतक कोशिकाओं से एकल की तैयारी

चित्रा 2 (ए) और (बी) यांत्रिक हदबंदी के बाद 2-4 मिमी टुकड़ों में पहले एक देर चरण मेलेनोमा रोगी के एक resected लसीका नोड मेटास्टेसिस मिसाल है. और एक 70 सुक्ष्ममापी नायलॉन जाल के माध्यम से ऊतक निस्पंदन enzymatic हदबंदी के बाद, कोशिकाओं pelleted थे और तैरनेवाला त्याग. इस चरण में हम एरिथ्रोसाइट्स चित्र 2C में सेल गोली के लाल रंग से संकेत के रूप में के साथ एक उच्च संदूषण मनाया. बाद में, हम लाल रक्त कोशिकाओं, जिसके परिणामस्वरूप हल्के भूरे रंग (चित्रा 2 डी) के एक सेल गोली में कम करते हैं. इन कोशिकाओं को resuspended किया गया और 37 में क्वांटम 263 मध्यम के साथ सभ्य डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.

प्राथमिक सेल संस्कृतियों की विशेषता

करने के लिए मान्य है कि ट्यूमर कोशिकाओं से उत्पन्न और नहीं stroma आसपास से, हम RT-पीसीआर प्रदर्शनmelanocyte/melanoma-, fibroblast, वृक्ष के समान और स्टेम सेल मार्कर जीन. वयस्क melanocytes TYR और भ्रूण स्टेम सेल मार्कर CD133 के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्सिनोमा सेल लाइन NCCIT के लिए सामान्य नियंत्रण कक्ष के रूप में सेवा की. पीसीआर परिणाम, 3 चित्र में दिखाया गया है, पता चला है कि कुछ कोशिकाओं को प्राथमिक melanocytic मूल के वास्तव में कर रहे हैं (TYR लिए सकारात्मक) और परिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं (CD83) के मार्कर के लिए नकारात्मक हैं. इसके अलावा, सेल लाइनों मेलेनोमा व्यक्त CD133, एक असममित कोशिका विभाजन और एक ज्ञात कैंसर स्टेम सेल मार्कर के लिए महत्वपूर्ण जीन पाए गए HPRT नियंत्रण लोड के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

प्रारंभ में, प्राथमिक सेल संस्कृति भी fibroblasts के साथ एक उच्च संदूषण निहित CD90 की उच्च अभिव्यक्ति (3 चित्रा बाएँ, ऊपरी पैनल) संकेत के रूप में.

Fibroblast रिक्तीकरण के बाद, इस सेल संस्कृति केवल TYR निहित + मेलेनोमा सेलऔर कोई और अधिक (CD90) fibroblasts (3 चित्रा छोड़ दिया, कम पैनल). fibroblasts के अभाव brightfield माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की जा सकती है, के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है.

चुंबकीय सेल CD133 की छंटाई + और ​​CD133 - मेलेनोमा कोशिकाओं

कोशिकाओं प्राथमिक मेलेनोमा कोशिकाओं, जो CD133 अभिव्यक्ति दिखाने के लिए RT-पीसीआर द्वारा संकेत के रूप में CD133 + और ​​CD133 में हल किया जा सकता है. अप्रत्यक्ष CD133 Microbead किट, एक उच्च शुद्धता (99.75%) से संशोधित प्रोटोकॉल और CD133 की उपज और CD133 - भिन्न है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से छंटाई के बाद हासिल की है, दोनों भिन्नों के एक उच्च व्यवहार्यता. छंटनी प्रभावकारिता और पवित्रता हमेशा immunofluoresence धुंधला हो जाना या पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए के रूप में चित्रा 5A और बी में दिखाया.

चित्रा 1 चित्रा 1. प्रयोग की समग्र योजना प्राथमिक मेलेनोमा सेल संस्कृति और CD133 + ख्यात कैंसर स्टेम कोशिकाओं के अलगाव एक ट्यूमर DNase मैं और Collagenase चतुर्थ और gentleMACS Dissociator साथ एक हदबंदी मिश्रण का उपयोग कोशिकाओं के यांत्रिक और enzymatic पृथक्करण द्वारा बाद ट्यूमर की लकीर भी शामिल है. यदि ट्यूमर कोशिकाओं को अत्यधिक लाल रक्त कोशिकाओं के साथ दूषित कर रहे हैं, एक एरिथ्रोसाइट रिक्तीकरण कदम की सिफारिश की है. संवर्धित प्राथमिक कोशिकाओं तो अतिसूक्ष्म और RT-पीसीआर विश्लेषण द्वारा विशेषता किया जाना चाहिए पुष्टि करने के लिए यदि वे मेलेनोमा कोशिकाओं हैं. CD90 की अभिव्यक्ति के संकेत fibroblasts के साथ एक उच्च संदूषण fibroblast है Miltenyi विरोधी fibroblasts microbeads का उपयोग रिक्तीकरण द्वारा हटाया जा सकता है. अंत में, CD133 + और CD133 मेलेनोमा कोशिकाओं fractionated अप्रत्यक्ष CD133 माइक्रो मनका Miltenyi से मानव किट का उपयोग कर सकते हैं. छंटाई के बाद, शुद्धता की पुष्टि की है और एक + CD133घ CD133 मेलेनोमा fractions कंधे से कंधा मिलाकर विश्लेषण किया जा सकता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. ट्यूमर ऊतक कोशिकाओं से एकल की तैयारी. एक: एकल कक्षों में एक resected हदबंदी से पहले मेलेनोमा मेटास्टेसिस का नमूना बी: 2-4 मिमी दो बाँझ नलियां का उपयोग करते हुए टुकड़ों में ट्यूमर ऊतक के यांत्रिक हदबंदी के बाद मेलेनोमा मेटास्टेसिस सी: एकल अत्यधिक लाल रक्त कोशिकाओं डी के साथ दूषित कोशिकाओं की गोली एरिथ्रोसाइट रिक्तीकरण के बाद एकल कक्षों की गोली.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्राथमिक सेल संस्कृतियों की अभिव्यक्ति विश्लेषण मेलेनिन (TYR) उत्पादन fibroblast मार्कर (CD90), वृक्ष के समान सेल मार्कर से संबंधित जीन का विश्लेषण RT-पीसीआर ( CD83) और असममित कोशिका विभाजन (CD133) के लिए महत्वपूर्ण जीन से पता चला है कि शुरू में, प्राथमिक सेल संस्कृति CD133 निहित + मेलेनोमा (TYR +) कोशिकाओं और कोई वृक्ष के समान कोशिकाओं (- CD83) लेकिन किया गया था अत्यधिक (CD90 +) fibroblasts (छोड़ दिया, ऊपरी पैनल के साथ दूषित) . निम्न fibroblast रिक्तीकरण इस सेल संस्कृति केवल TYR + और CD90 मेलेनोमा कोशिकाओं (बाएं, कम पैनल) निहित. HPRT नियंत्रण लोड के रूप में इस्तेमाल किया गया था. NCCIT और वयस्क melanocytes CD133 और TYR के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा की है, क्रमशः.

चित्रा 4
चित्रा 4. Fibroblast रिक्तीकरण के पहले और बाद में प्राथमिक सेल संस्कृतियों की micrographs. : एक प्राथमिक सेल संस्कृति के Brightfield माइक्रोग्राफ fibroblasts के साथ अत्यधिक दूषित बी: fibroblast रिक्तीकरण के बाद एक ही प्राथमिक मेलेनोमा सेल संस्कृति के Brightfield माइक्रोग्राफ.

को e_content "के लिए: रखने together.within पृष्ठ ="> हमेशा " चित्रा 5
चित्रा 5. Immunofluorescence धुंधला हो जाना और पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से एमएसीएस का सत्यापन. एक: मेलेनोमा कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरेसेंस micrographs अप्रत्यक्ष CD133 Miltenyi से Microbead किट के साथ छंटाई के बाद 24 घंटे. कोशिकाओं को कवर फिसल वरीयता प्राप्त किया गया था और CD133 / 1 (W6B3C1) एंटीबॉडी Alexa Fluor 488 विरोधी खरगोश बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद एक साथ दाग. केवल CD133 + अंश में कोशिका झिल्ली में एक विशिष्ट संकेत के रूप में संकेत दिया सफेद तीरों पर (बाएं पैनल) द्वारा मनाया गया. प्रोटीन (सही पैनल) की उपस्थिति के लिए CD133 कोशिकाओं दाग नहीं था बी: छँटाई शुद्धता की मात्रात्मक फ्लोरोसेंट पश्चिमी सोख्ता द्वारा पुष्टि. एक मजबूत संकेत CD133 CD133 + अंश में पाया गया है, जबकि एक बहुत कमजोर CD133 अभिव्यक्ति वें में मनाया गयाई CD133 जनसंख्या.

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Discussion

आदेश में ट्यूमर सेल गोली से एरिथ्रोसाइट contaminations को दूर करने के लिए हम अत्यधिक Miltenyi से लाल रक्त सेल समाधान का उपयोग करने की सलाह देते हैं. पारंपरिक Ficoll घनत्व ढाल centrifugation पर एरिथ्रोसाइट्स lysing के लाभ कर रहे हैं कि यह तेज और सरल है. इसके अलावा, Ficoll या लाल रक्त कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओं की हानि के साथ contaminations से परहेज कर रहे हैं. जब आप प्राथमिक सेल संस्कृति में fibroblasts के विकास का निरीक्षण वे तत्काल हटाया जाना चाहिए क्योंकि वे आम तौर पर ट्यूमर कोशिकाओं बढ़ना जब भी लंबे समय से प्रतीक्षा है.

जब Miltenyi एमएसीएस तकनीक के साथ कोशिकाओं छँटाई हम कोशिकाओं को enzymatically कटाई करने की सलाह देते हैं. एक सेल खुरचनी का उपयोग कोशिकाओं और उनकी सतह epitopes gentler हो सकता है, लेकिन यह भी सेल टुकड़े, है जो एमएसीएस स्तंभों को nonspecifically बाँध और स्तंभों रोकना उत्पादन होगा. पारंपरिक इलाज / trypsin EDTA पर Accutase के फायदे कम सेल तनाव, घास का मैदानसुधार व्यवहार्यता और सेल संस्कृतियों में आकस्मिक एजेंट शुरू करने की कम से कम जोखिम डिंग. Accutase तैयारी किसी भी स्तनधारी या पुनः संयोजक जीवाणु 28 प्रोटीन शामिल नहीं है.

कोशिका की सतह और गैर विशिष्ट सेल एक लेबलिंग पर एंटीबॉडी के कैपिंग रोकने के लिए तेजी से काम, कोशिकाओं ठंड रखने चाहिए और पूर्व ठंडा समाधान का उपयोग करें. सभी ऊष्मायन कदम डिग्री सेल्सियस, लेकिन नहीं बर्फ पर 2-8 पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए क्योंकि कम तापमान ऊष्मायन बार वृद्धि हो सकती है. स्तंभ प्रति आदर्श सेल नंबर प्रत्येक नया सेल संस्कृति के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. हमारी प्रयोगशाला में हम मेलेनोमा सेल लाइनों जहां 4x 10 7 कोशिकाओं की एक अधिकतम सेल संख्या लोकसभा स्तंभ के अनुसार लागू किया जा सकता है के साथ काम किया. एमएस कॉलम सब पर इस सेल प्रकार के लिए काम नहीं किया. बहुत बड़ी कोशिकाओं के लिए Miltenyi भी बड़े सेल कॉलम प्रदान करता है, जो बदले में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

एमएसीएस बफर Miltenyi द्वारा सिफारिश की 2 मिमी EDTA और पीबीएस में 0.5% BSA शामिल हैं. अगर एक के माध्यम से कमी हुईचुंबकीय छँटाई के बाद मनाया जाता है कोशिकाओं की साख, BSA और बफर में EDTA / के कारण हो सकता है. सेल व्यवहार्यता BSA में सुधार FCS 5% है, जो आमतौर पर बेहतर BSA से सहन किया है द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. EDTA एमएसीएस बफर में सेल व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए, लेकिन 2-3% से छंटाई शुद्धता में कमी होगी करने के लिए छोड़ा जा सकता है.

एमएसीएस बफर स्तंभों समभार बनाना खारिज किया जाना चाहिए. यह इस संतुलन समाधान में क्रमबद्ध कोशिकाओं को इकट्ठा करने के बाद से यह कोशिकाओं को नुकसान कर सकते हैं सिफारिश नहीं है. इसके बजाय, हल कोशिकाओं एक संस्कृति के माध्यम से आपूर्ति की छंटाई के बाद सीधे कोशिकाओं को स्थिर करने के ट्यूब में एकत्र किया जाना चाहिए.

स्तंभों की clogging से बचने के लिए यह महत्वपूर्ण है कि चुंबकीय छँटाई पहले एक 30 सुक्ष्ममापी नायलॉन जाल (= फिल्टर पूर्व पृथक्करण) के माध्यम से कोशिकाओं से गुजर रहा एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त. एक ताजा, equilibrated रास स्तंभ या भी LD स्तंभ के माध्यम से नकारात्मक अंश, एक दूसरे रन की शुद्धता को बढ़ाने के(= कोशिकाओं की कमी के लिए) का सुझाव दिया है.

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Disclosures

लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgments

लेखकों को इस काम का समर्थन और समीक्षकों पांडुलिपि पढ़ने के लिए प्रो. एम. Dietel और डिर्क शूमाकर धन्यवाद.

इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान अभिनव दवाएँ पहल अनुदान समझौते के एन के तहत संयुक्त उपक्रम ° 115234, जो वित्तीय योगदान के यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) और EFPIA कंपनियों में से बना रहे हैं संसाधनों से समर्थन प्राप्त हुआ है तरह योगदान. यह काम भी बर्लिनर Krebsgesellschaft (BKG) के द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

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Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

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