Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Пациент Производные культуре клеток и выделение CD133 Published: March 13, 2013 doi: 10.3791/50200
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1,3,4
1Institute of Pathology, Laboratory of Molecular Tumor Pathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2Institute for Chemistry and Biochemistry, Free University Berlin, 3Laboratory for Functional Genomics Charité (LFGC), Charité - Universitätsmedizin Berlin, 4Comprehensive Cancer Center Charité, Charité - Universitätsmedizin Berlin

Summary

В данной статье описывается подготовка свежеполученных меланомы ткани в первичных культур клеток, и как удалять загрязнения эритроцитов и фибробластов из опухолевых клеток. Наконец, мы опишем, как CD133

Abstract

Несмотря на улучшение варианты лечения меланомы, доступных сегодня, пациентов с поздними стадиями меланомы все еще имеют плохой прогноз без прогрессирования и общей выживаемости. Таким образом, трансляционные исследования необходимо представить дополнительные доказательства молекулярного для улучшения таргетной терапии злокачественных меланом. В прошлом онкогенных механизмов, связанных с меланомой были широко изучены в установленном клеточных линий. На пути к более персонализированные схемы лечения с учетом индивидуальных генетических профилей, мы предлагаем использовать пациентом полученных клеточных линий, а общий клеточных линий. Наряду с высоким качеством клинических данных, особенно на пациента наблюдения, эти клетки будут играть важную роль, чтобы лучше понять молекулярные механизмы, лежащие в прогрессии меланомы.

Здесь мы сообщаем о создании первичных культур меланомы от расчлененного свежей ткани опухоли. Эта процедура включает в себя измельчение и диссоциации ткани на отдельные клетки, повторноСнятие загрязнений с эритроцитами и фибробластов, а также первичной культуре и надежной проверки происхождения меланомы клеток.

Последние отчеты показали, что меланома, как и большинство опухолей, гавани небольшой субпопуляции раковых стволовых клеток (ЦОК), который, кажется, исключительно топливо опухоли инициации и прогрессировании к метастатическим государства. Одним из ключевых маркеров для CSC идентификации и выделения в меланомы CD133. Для выделения CD133 + CSCs из первичных культур меланомы, мы изменили и оптимизировать магнитные клеток, активированных Сортировка (MACS) процедуру Miltenyi в результате высокой чистотой сортировки и жизнеспособность CD133 + и CD133 CSCs - объем, который можно выращивать и функционально проанализированы после этого.

Introduction

Кожные злокачественной меланомы является наименее распространенным, но самая опасная форма рака кожи. В связи с ростом заболеваемости, высокой степени злокачественности и быстрое распространение меланомы в настоящее время приходится 75% злокачественных опухолей кожи смертей, связанных с 1,2. Кроме хирургического иссечения первичной опухоли, химиотерапию, лучевую терапию, иммунотерапию и комбинированной химио-и иммунотерапия метастазы меланомы являются государством в самых современных стратегий для лечения меланомы 3,4. Тем не менее, злокачественная меланома характеризуется плохой ответ на химиотерапевтические средства (5-12%) 5,6, и только те 50-70% больных меланомой, несущий ген BRAF V600E мутации выгоду от новых перспективных целевой терапии, как лечение с 7 Для вемурафениб улучшение общей выживаемости, гораздо более глубокое понимание механизмов развития меланомы опухолей необходима.

Для изучения этих механизмов в прошлом, устоявшейся коммерческойбенно доступные клеточные линии были использованы. Более поздние подходы к изучению молекулярных событий начала и прогрессии рака использования первичных культур получены непосредственно из опухолевой ткани - стратегия преимущества подшипников многообразии: исследователь имеет полный контроль над пациентом и тканей выбор. Отобранные клетки получили из искусно выбранных опухолевой ткани, напоминающие опухоли со всеми ее неоднородность и последующие данные пациента и подробные патологии могут позволить характеристики культуры в сравнении с теми из первоначальной опухоли 8.

В противоположность этому, использование установленных клеточных линий в соответствующих модельных систем в исследовании рака обсуждаются спорно. Уже в 1987 году Осборн и коллеги описали значительные биологические различия между MCF-7 линий человека рак молочной железы клетки от различных лабораториях 9. Этот обширный геномной нестабильности и изменения в экспрессии РНК во время субкультуры был одним изnfirmed по Hiorns и соавт., и при условии, поддерживающих данные для доказательства того, что клеточные линии у развиваются в культуре, тем самым ослабив прямое отношение таких культур, как установлено модели человеческого рака 10.

Еще одним важным фактором, который в значительной степени игнорировались на протяжении многих лет, является риск загрязнения или чрезмерного роста культур с несвязанными «ложные» клеток, который был выдвинут более двадцати лет назад, демонстрируя, что большое число клеточных линий были заражены HeLa клетки 8,11. Неверное толкование данных из «ложные» клеточных линий в последнее время вышли на свет в литературе снова. Используя комбинацию ДНК и молекулярной цитогенетики, Маклеод и соавт. Показали, что из 252 новых опухолей полученных клеточных линий человека на хранение в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ), почти 18% были признаны внутривидовой или межвидовой крест -загрязнители 12,13.

Чтобы избежать этих проблем, а также использовать преимущества упоминалось выше, мы решили создать низкой прохождения линии клеток меланомы с метастазами только что вырезали.

Надежная клетка разделения и анализа технологии требуют одноклеточных препаратов, которые будут созданы в то время как одновременно ограничивая клеточной смерти и разрушения характерных поверхностных белков. Настольный инструмент для автоматизированного диссоциации тканей в одной клеточной суспензии является диссоциатор gentleMACS производства Miltenyi. При использовании в сочетании с gentleMACS C Трубы и оптимизированный диссоциации решений, эффективное и нежное диссоциации опухолевой ткани в замкнутой системе достигается при сохранении эпитопов антигена и снижения потери клеток. Прибор предлагает оптимизировать, предустановленных программ для различных конкретных приложений и стандартизированных гарантий подготовки одноклеточных суспензий от меланомы ткани 14.

<р = класса "jove_content"> Последние отчеты показали, что большинство опухолей питать небольшой субпопуляции так называемые раковые стволовые клетки (ЦОК), которые обладают исключительно опухоли инициирование и самообновлению мощности. Идентификация меланоцитов производству стволовых клеток в дерму кожи привело к гипотезе, что эти клетки могут быть происхождении раковых стволовых клеток (ЦОК) в меланомы, поскольку воздействие радиации UVA можете прокачать эти клетки для злокачественной трансформации 15. В результате таких генетических поражений было бы клеток, которые питают сочетание опухоли и характеристики стволовых клеток.

Одним из ключевых маркеров предложили представлять субпопуляции CSCs в меланомы CD133 16-20. CD133 (также известный как Prominin 1), членом pentaspan трансмембранного гликопротеина, выражается в гемопоэтических стволовых клетках, эндотелиальных клеток-предшественников, нейронов и глиальных клеток стволовые 21-23. Экспрессия CD133 коррелирует сасимметричное деление клетки 24, и гликозилированного эпитоп CD133 было показано, что подавляется на клеточную дифференцировку 25. Недавно CD133 + клеток меланомы было показано, что самообновлению и опухоль начала мощностью 19,20.

Для изучения функций CD133 + предполагаемый меланомы CSCs, мы изменили и оптимизировать магнитные клеток, активированных Сортировка (MACS) системы от Miltenyi Biotech для получения обогащенного и жизнеспособных популяций CD133 и CD133 + - клетки.

Магнитный шарик на основе разделения клеток позволяет либо отрицательное выделение, как показано на Мэтью и др. 26. Или положительный выбор, как мы показываем здесь. Во время положительного отбора определенного типа клеток-мишеней, например, CD133 экспрессирующие клетки, магнитно меченных микросфер, 50-нм суперпарамагнитных частиц, которые сопряжены с весьма специфических антител противспецифический антиген клеточной поверхности. Во время разделения, магнитно-меченых клеток сохраняется в столбце в магнитном поле сепаратора, в то время как немеченого клетки течь через. После промывки, столбец удаляется от магнитного поля сепаратора, и клетки-мишени вымываются из колонки. LS или MS столбцы, используемые при положительном результате отбора в доли меченых и немеченых клеток с высокой степенью чистоты. С другой стороны, LD столбцы, используемые для негативного отбора, в результате несколько ниже, чистота меченые фракции. В связи с плотной упаковкой их матрицы скорость потока в этих колонках ниже, что приводит к высокому риску немеченого клетки в ловушке в столбце. LD столбцов поэтому его следует использовать только для строгих истощения нежелательных субпопуляции клеток. Положительный отбор может осуществляться прямые (антитела связаны с микрошарики) или косвенным магнитной маркировки (инкубация с микрошарики после incubatioп с первичными антителами). Конкретные микрошарики MACS доступны для позитивной селекции многочисленных типов клеток из первичной опухоли клетки простаты или, как меланома 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Общая схема эксперимента, включая подготовку первичной одной клетки от опухолевых тканей, характеристика первичных культур клеток, фибробластов истощения и магнитных сортировки клетки CD133 и CD133 + - клетки меланомы показано на рисунке 1.

1. Примеры приобретения

  1. Проверьте этические утверждения, прежде чем рассматривать следующие шаги.
  2. Подготовка 50 мл трубки с стерильной PBS с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина конечной концентрации и передать операцию или команду.
  3. Организовать быстрый транспорт опухолевой ткани после операции на мобильный лаборатории культуры при 4 ° C.

2. Подготовка первичной меланомы одной клетки от опухолевой ткани

  1. Выполните все шаги в стерильных условиях.
  2. Перед резекции опухоли, необходимо подготовить смесь диссоциации. 10 мл диссоциации смеси на 2-4 г ткани не требуется. Смесь может быть использована Immediately или хранятся в 10 мл аликвоты при -20 ° C для дальнейшего использования.
    1. Готовят раствор, содержащий 150 мМ хлорида натрия. Смешать помощью вихря, пока раствор не станет прозрачным. Если необходимо стерильным фильтрата раствора хлорида натрия использовании 0,22 мкм.
    2. Взвесить ДНКазы I и приготовить раствор, содержащий 10 мг / мл ДНКазы I в 150 мМ хлорида натрия. Смешать путем обращения пока раствор не станет прозрачным.
    3. Подготовка раствора, содержащего 100 мг коллагеназы IV в PBS. Смешать путем обращения пока раствор не станет прозрачным. Аликвоты коллагеназы раствор можно хранить при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев.
    4. Подготовьте смесь диссоциации с конечной концентрации 1% пенициллина-стрептомицина, 1 мг / мл коллагеназы IV и 0,1 мг / мл ДНКазы I в среде Квантовая 263. Смешать помощью вихря. Дополнительно: при использовании меланомы ткани, полученные из кожи добавляют раствор амфотерицина в смесь диссоциации до конечной концентрации 1,5 мкг / мл амфотерицина B.
  3. Предварительно теплой REQuired количества диссоциации смеси, PBS и квантовых 263 средних и 37 ° C.
  4. Место опухолевой ткани на стерильные чашки Петри. Аспирируйте чрезмерное раствор из ткани и добавить 500 мкл смеси диссоциации. Фарш опухоли на мелкие кусочки размером 2-4 мм, приготовленные из свежих стерильных скальпелей.
  5. Передача 2-4 г измельченного опухолевой ткани в трубку gentleMACS C, содержащий 5 мл диссоциации смеси. Промойте чашки Петри с дополнительным 4,5 мл диссоциации перемешать и добавить оставшиеся фрагменты ткани к трубе gentleMACS C.
  6. Закрыть gentleMACS C трубы и прикрепить ее вниз головой на рукаве диссоциатор gentleMACS. Запустите программу gentleMACS "h_tumor_01".
  7. Снимите трубку gentleMACS C от диссоциатора и инкубировать образца в течение 30 мин при 37 ° С при непрерывном вращении помощью Rotator MACSmix трубы на самом высоком скорость бега (12 мин) или путем поворота трубы вручную каждые 5 мин до ресуспендируют поселился фрагментов ткани .
  8. Прикрепить gentleMACS C трубы вниз головой на рукаве тОн gentleMACS диссоциатор и запустить программу gentleMACS "h_tumor_02".
  9. Снимите трубку gentleMACS C от диссоциатора и инкубировать образца в течение 30 мин при 37 ° С при непрерывном вращении помощью Rotator MACSmix трубы на самом высоком скорость бега (12 мин) или путем поворота трубы вручную каждые 5 мин до ресуспендируют поселился фрагментов ткани .
  10. Прикрепить gentleMACS C трубы вниз головой на рукаве диссоциатор gentleMACS и запустить программу gentleMACS "h_tumor_03".
  11. Снимите трубку gentleMACS C от диссоциатора, ресуспендируют образца и применять клеточной суспензии в 70 мкм ячейки фильтра размещены на 50 мл трубки. Если засорение фильтра происходит, перемешать клеточной суспензии с стерильный фильтр наконечника до полной подвеской пробежал.
  12. Промойте ячейки фильтра с 5 мл среды Квантовая 263.
  13. Дополнительно: если вы до сих пор фрагментов ткани остается в фильтре, ресуспендируют фрагментов в квантовых 263 средних и семя их в соответствующую ячейку культуры расчас Инкубируйте фрагментов при 37 ° C и 5% CO 2.
  14. Откажитесь ячейки фильтра и закрыть 50 мл трубки с перевариваются клеточной суспензии. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 300 мкг и отбросить супернатант.
  15. Дополнительно: если осадок клеток появляется красный цвет за счет большого количества эритроцитов подготовить 1x красных клеток крови Лизис решение путем разбавления 10x 1:10 решения в дважды дистиллированной воде, ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл PBS и добавьте 5 мл 1x Красная лизис клеток крови Решение. Vortex 5 сек и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифуга в течение 5 мин при 300 мкг и отбросить супернатант.
  16. Ресуспендируют опухолевых клеток с квантовыми 263 и семян клеток в соответствующие колбы для культивирования клеток. Культуры опухолевых клеток при 37 ° C и 5% CO 2 и регулярно прохождения клетками, когда они достигают 80% слияния.

3. Характеристика первичной культуре клеток и фибробластов истощения

  1. Анализ первичной культуре клеток фенотипически использованием microscoфизическое воспитание
  2. Соберите небольшое количество (0,5 x 10 6 клеток) первичной культуре клеток и выполняют RT-PCR с праймерами для опухолевых-, меланомы, стволовых клеток и генов клетки стромы маркером. Наиболее важные гены для анализа являются CD90 (фибробластов маркер), TYR (меланомы / меланоцитов маркер), CD133 (рак стволовых клеток маркера), CD83 (маркер для зрелых дендритных клеток) и гена домашнего хозяйства (например, HPRT или GAPDH).
  3. Если микроскопический анализ и высокой экспрессией CD90 в течение RT-PCR показал высокое загрязнение первичной культуре фибробластов с меланомой, необходимо, чтобы исчерпать фибробластов помощью Anti-Фибробласты микрошариков и D Колонны из Miltenyi.

4. Магнитные сортировки клеток CD133 + и CD133 - клетки меланомы Использование LS Столбцы

  1. Подготовка MACS буфера, содержащего 2 мМ ЭДТА и 5% FCS в PBS. Mix путем обращения и стерильный фильтрат-буфера, используя 0,22 мкм Steritop-GP фильтра. Холод буфере до 4-8 ° Cи дегазации перед использованием.
  2. Предварительно теплой Accutase, PBS и квантовых 263 средних и 37 ° C.
  3. Вымойте 80% вырожденная клетки с PBS. Добавить соответствующее количество Accutase и инкубировать до клетки отделяются от поверхности культуры. Сбор клеток в 50 мл трубки с помощью квантово 263 среды.
  4. Определить номер ячейки и центрифугируют необходимое количество клеток (в соответствии с протоколом Miltenyi на максимальное количество 2x 10 9 клеток может быть загружен в LS колонки. Клеточной линии конкретного оптимального числа должны быть определены и могут быть значительно ниже.) В течение 5 мин при 300 мкг и 4-8 ° C. Супернатант полностью.
  5. Ресуспендируют максимум 1x 10 8 клеток с 350 мкл буфера для MACS (для большего числа ячейки масштабы всех следующих буфера MACS, FcR Блокировка реагентов, CD133/1-Biotin и анти-биотин микрошарики объемах соответственно).
  6. Добавить 100 мкл FcR Блокировка реагентов.
  7. Добавить 50 мкл CD133/1-Biotin. Хорошо перемешайте помощью вихря и инкубировать при температуре 4-8 ° C Fили 10 мин.
  8. Вымойте клеток путем добавления 10 мл MACS буфера и центрифуги в течение 5 мин при 300 х г и 4-8 ° C. Супернатант полностью.
  9. Повторите стадии промывки (4,8)
  10. Ресуспендируют осадок клеток в 400 мкл буфера для MACS.
  11. Добавить 100 мкл анти-биотин микрошарики. Хорошо перемешайте помощью вихря и инкубировать при температуре 4-8 ° С в течение 15 мин.
  12. Между тем, подготовка MACS сепаратор для магнитной сепарации. Прикрепить QuadroMACS к MACS Separator нескольких Stand. Вставьте необходимое количество LS колонны с колонной крылья на фронт в магнитном поле QuadroMACS. Поместите предварительного разделения фильтра (с 30 нейлоновая сетка мкм) в каждой колонке LS и соответствующие трубки коллекция (15 мл или 50 мл) в каждом столбце. Подготовка фильтра и столбцов путем промывки с 3 мл буфера MACS. Откажитесь проточные.
  13. Вымойте клеток путем добавления 10 мл MACS буфера и центрифуги в течение 5 мин при 300 х г и 4-8 ° C. Супернатант полностью.
  14. Ресуспендируют клеток с 500 мклMACS буфер и применять клеточную суспензию на LS столбец с предварительного разделения фильтра.
  15. Вымойте три раза с 3 мл MACS буфера на колонке. Только добавить новый буфер, когда колонна резервуар пуст.
  16. Собранные общего стоков содержит непомеченных CD133 - клеточной фракции.
  17. Откажитесь от предварительного разделения фильтра, удалить столбец из сепаратора и разместить его на подходящую трубку коллекции.
  18. Нанесите 5 мл MACS буфера. Немедленно промыть меченых CD133 + клеток, крепко нажимая на поршень в колонну.
  19. Для повышения чистоты отрицательные фракции, применять клеточную суспензию на новую уравновешенную колонку LS вставляется в QuadroMACS. Стоков содержит CD133 - фракции.
  20. Удалите столбцы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Подготовка одной клетки от опухолевых тканей

Рисунок 2 иллюстрирует узла удаленной метастазов в лимфатических поздней стадии меланомы пациента до (А) и после (б) механическая диссоциация на 2-4 штуки мм. После ферментативного распада тканей и фильтрацией через 70 нейлоновая сетка мкм, клетки осаждали и супернатант отбрасывали. На данном этапе мы наблюдали сильное загрязнение с эритроцитами как указано в красноватый цвет осадок клеток на рисунке 2C. Впоследствии, мы исчерпали красных кровяных клеток, в результате чего клеточный осадок светло-коричневого цвета (рис. 2D). Эти клетки ресуспендировали и культивировали с квантовыми 263 среде при 37 ° C и 5% CO 2.

Характеристика первичных культур клеток

Чтобы проверить, является ли клетки возникают из опухоли, а не от окружающей стромы, мы провели RT-PCRиз melanocyte/melanoma-, фибробластов, дендритных и стволовые клетки генов маркеров. Взрослые меланоцитов служил нормальных клеток управления TYR и эмбриональные клеточной линии карциномы NCCIT в качестве положительного контроля для маркера стволовых клеток CD133. ПЦР результат, показанный на рисунке 3, показал, что некоторые первичные клетки действительно имеют меланоцитарных происхождения (положительный для TYR) и являются негативными для маркера зрелых дендритных клетках (CD83). Кроме того, линии клеток меланомы были обнаружены экспресс-CD133, ген решающее значение для асимметричного деления клеток и известные раковые стволовые клетки маркером. HPRT был использован в качестве контроля загрузки.

Изначально, основной культуре клеток содержится также высокое загрязнение с фибробластами, как указано высокой экспрессией CD90 (рис. 3 слева, верхняя панель).

После фибробластов истощение, эта культура клеток, содержащихся только TYR + клеток меланомыс и не более фибробластов (CD90 -) (рис. 3 левая, нижняя панель). Отсутствие фибробластов может быть подтверждена с помощью микроскопии светлого, как показано на рисунке 4.

Магнитные сортировки клеток CD133 + и CD133 - клетки меланомы

Первичные клетки меланомы, которые показывают, CD133 выражение, как показано RT-PCR можно разделить на CD133 и CD133 + - клетки. С модифицированный протокол из косвенных CD133 Microbead Kit, высокой чистоты (> 99,75%) и выход CD133 и CD133 +-фракции, а также высокую жизнеспособность обеих фракций после сортировки, достигнута. Сортировка эффективности и чистоты всегда должно быть проверено путем окрашивания иммунофлюоресцентным или Вестерн-блоттинга, как показано на рисунке 5A и B.

Рисунок 1 Рисунок 1. Общая схема эксперимента. Первичной культуре клеток меланомы и изоляции CD133 + предполагаемые стволовые клетки рака включает в себя резекцию опухоли с последующей механической и ферментативной диссоциации клеток опухоли с использованием сочетания диссоциации с ДНКазой I и коллагеназы IV и диссоциатор gentleMACS. Если опухолевые клетки сильно загрязнены красных кровяных клеток, эритроцитов шаг истощении рекомендуется. Искусственный первичные клетки должны быть характерны микроскопические и ОТ-ПЦР анализ, чтобы подтвердить, если они клеток меланомы. Высокое загрязнение фибробластов указано выражение CD90 могут быть удалены фибробластов истощения использованием Miltenyi анти-фибробласты микрошарики. Наконец, CD133 и CD133 +-клеток меланомы может быть фракционированного с использованием косвенного CD133 Micro-Bead Kit человека от Miltenyi. После сортировки, чистота подтверждается и CD133 +D CD133-меланомы фракции могут быть проанализированы бок о бок.

Рисунок 2
Рисунок 2. Подготовка одной клетки от опухолевой ткани. A:. Пример метастазы меланомы резецированной до распада на отдельные клетки B: меланома метастазы после механической диссоциации ткани опухоли в 2-4 мм с использованием двух частей стерильных скальпелей C:. Пеллет из одной клетки сильно загрязнены красных кровяных клеток D. : гранулы из одной клетки после разрушения эритроцитов.

Рисунок 3
Рисунок 3. Выражение анализ первичных культур клеток. RT-PCR анализ генов, связанных с производством меланина (TYR), фибробластов маркеров (CD90), дендритные клетки маркером ( CD83) и гены важны для асимметричного деления клеток (CD133) показал, что на начальном этапе первичной культуры клеток, содержащихся CD133 + клеток меланомы (TYR +) и не дендритных клеток (CD83-), но была сильно загрязнена фибробластов (CD90 +) (левая, верхняя панель) . После истощения фибробластов эту культуру клеток содержала только TYR + и CD90-клеток меланомы (слева, внизу). HPRT был использован в качестве контроля загрузки. NCCIT и взрослых меланоцитов служил в качестве положительного контроля для CD133 и TYR, соответственно.

Рисунок 4
Рисунок 4. Микрофотографии первичных культур клеток до и после фибробластов истощения. : Светлое микрофотография первичной культуры клеток сильно загрязнены фибробластов B:. Светлое микрофотография того же первичной культуре клеток меланомы после фибробластов истощения.

e_content "FO: Keep-together.within-страница =" Всегда "> Рисунок 5
Рисунок 5. Проверка MACS с помощью иммунофлюоресценции окрашивания и вестерн-блоттинга. : Иммунофлуоресценции микрофотографии клеток меланомы через 24 часа после сортировки с косвенным CD133 Microbead Kit от Miltenyi. Клетки высевали на покровные стекла и окрашивали CD133 / 1 (W6B3C1) антител с последующей инкубацией с Alexa Fluor 488 козьего анти-кролик вторичным антителом. Только в CD133 + доля конкретного сигнала на клеточные мембраны наблюдается, как указано белыми стрелками (слева). CD133-клетки не пятно на наличие белка (правая панель) B:. Подтверждение сортировки чистоты количественного флуоресцентного вестерн-блоттинга. Сильный CD133 сигнал был обнаружен в CD133 + фракции, в то время как очень слабая экспрессия CD133 наблюдается в гоэлектронной CD133 населения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для того, чтобы удалить загрязнения из эритроцитов опухолевых клеток гранулы мы настоятельно рекомендуем использовать красные клетки крови лизисом решение от Miltenyi. Преимущества лизиса эритроцитов по сравнению с традиционными центрифугирования в градиенте плотности Ficoll в том, что это быстрее и проще. Кроме того, загрязнений с Ficoll или красных клеток крови и потеря опухолевых клеток избежать. Когда вы наблюдаете рост фибробластов в первичной культуре клеток они должны быть немедленно удалены, так как они обычно зарастают опухолевых клеток при ждать слишком долго.

При сортировке клеток с MACS технику Miltenyi, мы рекомендуем уборки клетки ферментативно. Использование сотового скребок может быть мягким к клеткам и их эпитопов поверхности, но и производить фрагменты клеток, которые связываются неспецифически к MACS колонн и забивают столбцов. Преимущества Accutase по сравнению с традиционными трипсин / ЭДТА лечения включают снижение клеточный стресс, ЛеаДин к повышению жизнеспособности и свести к минимуму риск появления посторонних агентов в клеточных культурах. Accutase препарат не содержит никаких млекопитающих или рекомбинантных бактериальных белков 28.

Для предотвращения укупорки антител на поверхности клеток и неспецифические мечения клеток надо работать быстро, держать клетки холодно и использовать предварительно охлажденные решений. Все инкубации шаги должны быть выполнены при температуре 2-8 ° C, но не на льду, так как низкие температуры могут увеличить время инкубации. Идеальное число клеток на колонке должны быть определены для каждой новой культуре клеток. В нашей лаборатории мы работали с меланомой клеточных линий, где максимальное число ячейки 4x 10 7 клеток могут быть применены в колонке LS. MS столбцов не работает вообще для этого типа клеток. Для очень больших клетках Miltenyi также предоставляет большие колонны Cell, который должен быть использован вместо.

MACS буфере, рекомендованном Miltenyi содержит 2 мМ ЭДТА и 0,5% BSA в PBS. Если снизился с помощьюность клеток после магнитной сортировки наблюдается, это может быть связано с BSA и / или EDTA в буфере. Для улучшения BSA жизнеспособность клеток может быть заменен на 5% FCS, который обычно лучше переносится, чем BSA. ЭДТА в буфер MACS может быть опущен увеличить жизнеспособность клетки, но будет снижаться сортировки чистоты на 2-3%.

MACS буфера, используемого для уравновешивания столбцы должны быть отброшены. Не рекомендуется для сбора отсортированных клеток в этой равновесия решение, так как это может повредить клетки. Вместо этого, отсортированных клеток должны быть собраны в трубе поставляется с культуральной средой для стабилизации клеток непосредственно после сортировки.

Чтобы избежать засорения колонны важно для получения одного-клеточной суспензии перед магнитной сортировки по прохождении клетки через 30 нейлоновая сетка мкм (= предварительного разделения фильтров). Для повышения чистоты отрицательные фракции, второй заезд через свежий, уравновешенную колонку LS или даже LD колонки(= Истощения клеток) предлагается.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарят профессора М. Dietel и Дирк Шумахер за поддержку этой работы и критически чтении рукописи.

Научных исследований, ведущих к этим результатам, получила поддержку со стороны Инновационные инициативы лекарственных средств совместного проекта по гранту соглашения N ° 115234, ресурсы, которые состоят из финансового вклада Седьмой рамочной Европейского Союза, Программы (FP7/2007-2013) и EFPIA компаний в вид вклада. Эта работа также была поддержана Berliner Krebsgesellschaft (BKG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
  2. Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
  3. Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
  4. Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
  5. Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. Der Onkologe. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).
  6. Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
  7. Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
  8. Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
  9. Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
  10. Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
  11. Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
  12. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
  13. Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
  14. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
  15. Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
  16. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  17. Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
  18. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
  19. Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
  20. Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
  21. Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
  22. Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
  25. Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
  26. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
  27. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).
  28. Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).

Tags

Рак биологии выпуск 73 медицине биологии стволовых клеток клеточной биологии молекулярной биологии биомедицинской инженерии генетики онкологии первичный культуры клеток меланома MACS раковые стволовые клетки CD133 рака клетки рака простаты меланомы стволовые клетки культура клеток индивидуальный подход
Пациент Производные культуре клеток и выделение CD133<sup&gt; +</sup&gt; Предполагаемые раковых стволовых клеток от меланомы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, … More

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter