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Medicine

Paciente celulares derivadas Cultura y aislamiento de CD133 Published: March 13, 2013 doi: 10.3791/50200
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1,3,4
1Institute of Pathology, Laboratory of Molecular Tumor Pathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2Institute for Chemistry and Biochemistry, Free University Berlin, 3Laboratory for Functional Genomics Charité (LFGC), Charité - Universitätsmedizin Berlin, 4Comprehensive Cancer Center Charité, Charité - Universitätsmedizin Berlin

Summary

En este artículo se describe la preparación de tejido de melanoma recién obtenido en cultivos de células primarias, y cómo eliminar contaminaciones de los eritrocitos y los fibroblastos de las células tumorales. Por último, se describe cómo CD133

Abstract

A pesar de las opciones de mejora de los tratamientos para el melanoma disponibles en la actualidad, los pacientes con melanoma maligno avanzado todavía tienen un mal pronóstico para la supervivencia libre de progresión y global. Por lo tanto, la investigación traslacional tiene que proporcionar más pruebas moleculares para mejorar las terapias dirigidas para los melanomas malignos. En los últimos mecanismos oncogénicos, relacionados con el melanoma se estudiaron extensamente en líneas celulares establecidas. En el camino a los regímenes de tratamiento más personalizadas basadas en perfiles genéticos individuales, nos proponemos utilizar paciente derivados de las líneas celulares en lugar de líneas celulares genéricos. Junto con los datos clínicos de alta calidad, especialmente en el seguimiento del paciente, estas células serán fundamentales para comprender mejor los mecanismos moleculares de la progresión del melanoma.

Aquí reportamos el establecimiento de cultivos de melanoma primario de tejido tumoral fresco disecado. Este procedimiento incluye la disociación de picar carne y el tejido en células individuales, reremoción de contaminación con eritrocitos y fibroblastos, así como cultivo primario y verificación fiable del origen de las células de melanoma.

Informes recientes revelan que los melanomas, como la mayoría de los tumores, puerto una pequeña subpoblación de células madre de cáncer (CSC), que parecen alimentar exclusivamente la iniciación del tumor y la progresión hacia el estado metastático. Uno de los marcadores principales de la identificación y el aislamiento CSC en el melanoma es CD133. Para aislar CD133 + células madre cancerosas a partir de cultivos primarios de melanoma, se ha modificado y optimizado la clasificación de células activada por Magnetic (MACS) procedimiento de Miltenyi resultante en clasificación de alta pureza y viabilidad de las células madre cancerosas CD133 + y CD133 - a granel, que pueden ser cultivadas y analizadas funcionalmente a partir de entonces.

Introduction

Melanomas malignos cutáneos son el tipo menos común, pero más mortal de cáncer de piel. Debido a una incidencia cada vez mayor, de alto grado de malignidad y una rápida difusión, los melanomas representan actualmente el 75% de los tumores malignos de la piel relacionados con 1,2 muertes. Además de la extirpación quirúrgica del tumor primario, quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia y combinada de quimioterapia e inmunoterapia del melanoma metastatizado son las estrategias de estado-de-la-arte para el tratamiento de melanoma 3,4. Sin embargo, el melanoma maligno se caracteriza por una mala respuesta a la quimioterapia (5-12%) 5,6, y sólo los que 50-70% de los pacientes con melanoma llevan el gen BRAF V600E beneficio mutación de nuevas y prometedoras terapias específicas como el tratamiento con vemurafenib 7 Para mejorar la supervivencia global, una mejor comprensión de los mecanismos de tumorigénesis melanoma es necesaria.

Para el estudio de estos mecanismos en el pasado, bien establecida comercialmentelíneas celulares cialmente disponibles fueron utilizados. Los enfoques más recientes para el estudio de los eventos moleculares de la iniciación y progresión del cáncer utilizan cultivos primarios derivados directamente del tejido tumoral - a los beneficios de soporte estrategia múltiple: El investigador tiene el control completo del paciente y la selección de los tejidos. Las células de la muestra obtenida a partir de tejido tumoral experta seleccionado, se asemejan al tumor con toda su heterogeneidad y los datos de seguimiento del paciente y de una patología detallado está disponible para permitir las características de la cultura de ser comparados con los del tumor original 8.

En contraste, el uso de líneas celulares establecidas, como sistemas modelo en la investigación del cáncer se han despertado controversia. Ya en 1987 Osborne et al describieron importantes diferencias biológicas entre MCF-7 líneas celulares de cáncer de mama humanos de diferentes laboratorios 9. Esta inestabilidad genómica y extensa variación en la expresión del ARN durante subcultivo fue confirmed por Hiorns et al. y proporcionaron datos de apoyo para las pruebas de que las líneas celulares evolucionan en la cultura, lo que debilita la importancia directa de dichas culturas establecidas como modelos de cáncer humano 10.

Otra consideración importante, que ha sido en gran parte ignorado en los últimos años, es el riesgo de contaminación o crecimiento excesivo de las culturas no relacionadas con "falsas" las células, que se destacó primero hace más de veinte años atrás, demostrando que un gran número de líneas de células HeLa fueron contaminados por células 8,11. La mala interpretación de los datos de las líneas celulares 'false' ha salido a la luz recientemente en la literatura de nuevo. Usando una combinación de análisis de ADN y citogenética molecular, MacLeod et al. Reveló que 252 de los nuevos derivados del tumor líneas celulares humanas depositados en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ), casi el 18% se encontró que dentro de una especie o entre especies cruz -contaminantes 12,13.

Para evitar estos problemas y para hacer uso de las ventajas mencionadas anteriormente, se decidió establecer bajo pasaje líneas celulares de melanoma de metástasis recién extirpadas.

Robustos celulares tecnologías de separación y análisis requieren una sola célula de preparaciones que se genere limitando al mismo tiempo la muerte celular y la destrucción de las proteínas de superficie característicos. Un instrumento de mesa para la disociación automatizado de tejidos en una sola célula de suspensiones es el disociador gentleMACS fabricado por Miltenyi. Cuando se utiliza en combinación con gentleMACS C Tubos y soluciones optimizado disociación, una disociación eficaz y suave de tejido tumoral en un sistema cerrado se logra conservando epítopos antigénicos y la reducción de la pérdida de células. El instrumento ofrece optimizados, programas preestablecidos para una variedad de aplicaciones específicas y las garantías de preparación estandarizada de solo suspensiones de células de tejido de melanoma 14.

<p class = "jove_content"> Informes recientes revelaron que la mayoría de los tumores albergar una pequeña subpoblación de las llamadas células madre cancerosas (CSC), que presentan exclusivamente iniciadoras del tumor y la capacidad de auto-renovación. La identificación de las células madre de melanocitos que producen en la dermis de la piel llevado a la hipótesis de que estas células podría ser el origen de las células madre cancerosas (CSC) en melanoma ya que la exposición a la radiación UVA puede cebar estas células para la transformación maligna 15. El resultado de tal lesión genética sería células que albergan una combinación de tumor y las características de células madre.

Uno de los indicadores clave propuestos para representar a la subpoblación de células madre cancerosas en el melanoma es CD133 16-20. CD133 (también conocido como Prominin 1), un miembro de glicoproteínas transmembrana pentaspan, se expresa en las células madre hematopoyéticas, células progenitoras endoteliales, células madre neuronales y gliales 21-23. La expresión de CD133 se correlaciona conla división celular asimétrica 24, y el epítopo glicosilado de CD133 mostró ser downregulated a la diferenciación celular 25. Recientemente, CD133 + células de melanoma se han mostrado a la auto-renovación y la iniciación del tumor capacidad 19,20.

Para estudiar la función de CD133 + putativo melanoma CSC, se ha modificado y optimizado la clasificación celular activado magnético (MACS) Sistema de Miltenyi Biotech para obtener poblaciones altamente enriquecido y viables de CD133 + y CD133 - células.

Magnética basado en perlas separación celular permite a una selección negativa, como se muestra por Matheu et al. 26 o selección positiva como se muestra aquí. Durante la selección positiva del tipo de célula diana particular, por ejemplo, las células que expresan CD133, está magnéticamente etiquetados con microperlas, partículas superparamagnéticas 50-nm que están conjugados con anticuerpos altamente específicos contra unantígeno de superficie celular particular. Durante la separación, las células marcadas magnéticamente quedan retenidas dentro de la columna en el campo magnético del separador, mientras que las células no marcadas fluya a través. Después de etapas de lavado, la columna se retira del campo magnético del separador, y las células diana se eluyó de la columna. El LS o columnas MS utilizado durante resultado de la selección positiva en fracciones de células marcadas y no marcadas con alta pureza. Por otra parte, las columnas de LD, que se utilizan para la selección negativa, dan como resultado una pureza ligeramente inferior de la fracción de marcado. Debido a la más denso de su matriz de la velocidad de flujo en estas columnas es menor que resulta en un riesgo más alto de células no marcadas para ser atrapadas en la columna. Columnas LD por lo tanto debe ser utilizado sólo por el agotamiento estricto de una subpoblación de células no deseadas. La selección positiva se puede realizar por medio del etiquetado magnético directo (anticuerpo acoplado a MicroBeads) o indirecta (incubación con MicroBeads tras la incubation con el anticuerpo primario). MicroBeads MACS específicos están disponibles para la selección positiva de numerosos tipos de células de las células tumorales primarias como la próstata o melanoma 27.

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Protocol

El esquema general del experimento, con la preparación de células primarias de un solo tejido de tumor, la caracterización del cultivo celular primario, agotamiento de fibroblastos y de células de clasificación magnética de CD133 + y CD133 - células de melanoma se muestra en la figura 1.

1. Ejemplo de Adquisición

  1. Compruebe si la aprobación ética antes de considerar los próximos pasos.
  2. Preparar un tubo de 50 ml con PBS estéril suplementado con penicilina-estreptomicina al 1% concentración final y entregar a la cirugía o equipo.
  3. Organizar el transporte rápido de tejido tumoral de la cirugía para laboratorio de cultivo celular a 4 ° C.

2. Preparación de melanoma primarios individuales de células de tejido tumoral

  1. Realizar todos los pasos en condiciones estériles.
  2. Antes de la resección del tumor, se necesita para preparar la mezcla de disociación. 10 ml por mezcla de disociación 2-4 g de tejido se requiere. La mezcla se puede usar immediatamente o almacenado en alícuotas de 10 ml a -20 ° C para su uso posterior.
    1. Preparar una solución que contiene 150 mM de cloruro sódico. Mezclar utilizando un vortex hasta que la solución es clara. Si es necesario estéril filtrado solución de cloruro sódico utilizando un filtro de 0,22 micras.
    2. Pesar DNasa I y preparar una solución que contiene 10 mg / ml de DNasa I en cloruro sódico 150 mM. Mezclar por inversión hasta que la solución es clara.
    3. Preparar una solución que contiene 100mg/ml de colagenasa IV en PBS. Mezclar por inversión hasta que la solución es clara. Las alícuotas de solución de colagenasa se pueden almacenar a -20 ° C durante varios meses.
    4. Preparar la mezcla de disociación con una concentración final de 1% de penicilina-estreptomicina, 1 mg / ml de colagenasa IV y 0,1 mg / ml de DNasa I en Quantum medio 263. Mezclar utilizando un vórtice. Opcional: cuando se utiliza tejido de melanoma derivada de la piel Agregar solución de anfotericina B a la mezcla de disociación a una concentración final de 1,5 mg / ml de anfotericina B.
  3. Pre-caliente el reqcantidades uired mezcla de disociación, PBS y medianas Quantum 263 a 37 ° C.
  4. Place tejido tumoral en una placa Petri estéril. Aspirar solución excesivo del tejido y añadir 500 l mezcla de disociación. Picar en trozos pequeños tumor de 2-4 mm utilizando escalpelos frescos y estériles.
  5. Transferencia de 2-4 g picado tejido tumoral en un tubo gentleMACS C que contiene 5 ml de mezcla de disociación. Enjuague adicional con placa de Petri 4,5 ml Mezclar y añadir la disociación restantes fragmentos de tejido al tubo gentleMACS C.
  6. Cerrar gentleMACS tubo C y adjuntarlo al revés sobre la manga de la disociador gentleMACS. Ejecute el programa gentleMACS "h_tumor_01".
  7. Separar el tubo gentleMACS C del disociador e incubar la muestra durante 30 min a 37 º C bajo rotación continua usando el Rotor de Tubo MACSmix en la velocidad de ejecución más alta (12 rpm) o bien girando el tubo manualmente cada 5 minutos para resuspender asentadas fragmentos de tejido .
  8. Conecte gentleMACS tubo C al revés sobre la manga de la camisetaél gentleMACS disociador y ejecutar el programa gentleMACS "h_tumor_02".
  9. Separar el tubo gentleMACS C del disociador e incubar la muestra durante 30 min a 37 º C bajo rotación continua usando el Rotor de Tubo MACSmix en la velocidad de ejecución más alta (12 rpm) o bien girando el tubo manualmente cada 5 minutos para resuspender asentadas fragmentos de tejido .
  10. Adjuntar gentleMACS tubo C al revés sobre el manguito de la disociador gentleMACS y ejecutar el programa gentleMACS "h_tumor_03".
  11. Separar el tubo gentleMACS C del disociador, muestra resuspender y aplicar la suspensión de células a un colador de 70 micras celda colocada en un tubo de 50 ml. Si la obstrucción del filtro se produce, se agita la suspensión celular con una punta de filtro estéril hasta que la suspensión completa corrió a través.
  12. Enjuague filtro de células con 5 ml de medio de Quantum 263.
  13. Opcional: si usted todavía tiene fragmentos de tejido que quedan en los fragmentos de filtro, se resuspenden en medio Quantum 263 y sembrarlos en un cultivo celular apropiado dish. Incubar fragmentos a 37 ° C y 5% de CO 2.
  14. Descartar filtro de células y cerrar el tubo de 50 ml con la suspensión celular digerido. Se centrifuga la suspensión celular durante 5 min a 300 xg y desechar el sobrenadante.
  15. Opcional: si sedimento celular aparece de color rojo debido a la alta cantidad de eritrocitos preparar 1x glóbulos rojos Solución de Lisis por dilución de 1:10 10x solución en agua doblemente destilada, se resuspende el sedimento de células en 500 l de PBS y añadir 5 ml 1x lisis de glóbulos rojos Solución. Vortex 5 segundos e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Centrifugar durante 5 min a 300 xg y desechar el sobrenadante.
  16. Resuspender las células tumorales con Quantum 263 y sembrar las células en matraz de cultivo celular apropiado. Las células tumorales Cultura a 37 º C y 5% de CO 2 y rutinariamente células de paso cuando llegan a 80% de confluencia.

3. Caracterización de cultivos celulares de fibroblastos primarios y agotamiento

  1. Analizar cultivo de células primarias fenotípicamente mediante un microscope.
  2. Cosechar una cantidad pequeña (0,5 x 10 6 células) del cultivo celular primario y realizar RT-PCR con cebadores para neoplásica, melanoma, células madre y los genes marcadores de células del estroma. Los genes más importantes en el análisis son CD90 (marcador de fibroblastos), Tyr (melanoma / marcador de melanocitos), CD133 (marcador de células madre de cáncer), CD83 (marcador de células dendríticas maduras) y un gen de mantenimiento (por ejemplo, HPRT o GAPDH).
  3. Si el análisis microscópico y alta expresión de CD90 durante la RT-PCR reveló una alta contaminación de la cultura de melanoma primario de fibroblastos, es necesario agotar los fibroblastos utilizando los Fibroblastos MicroBeads Anti-D y columnas de Miltenyi.

4. Clasificación celular magnética de CD133 + y CD133 - Células de Melanoma el uso de columnas LS

  1. Preparar tampón MACS que contiene 2 mM EDTA y 5% de FCS en PBS. Mezcla de tampón de inversión y estéril filtrado que utilizan un 0,22 micras Steritop-GP unidad de filtro. Chill buffer 4-8 ° Cy desgasificar antes de usar.
  2. Pre-caliente Accutase, PBS y medianas Quantum 263 a 37 ° C.
  3. Lávese 80% de células confluentes con PBS. Añadir la cantidad apropiada de Accutase y se incuba hasta que las células se desprenden de la superficie de cultivo. Recoger las células en un tubo de 50 ml usando medio Quantum 263.
  4. Determinar el número de células y centrifugar el número necesario de células (Según protocolo Miltenyi de un número máximo de 2 x 10 9 células se pueden cargar por columna LS. Línea celular óptimos números específicos debe determinarse y puede ser considerablemente menor.) Durante 5 min a 300 xg y 4-8 ° C. Aspirar el sobrenadante por completo.
  5. Resuspender un máximo de 1 x 10 8 células con tampón MACS 350 l (para un mayor número de células ampliar el tampón de MACS siguiente, reactivo FcR bloqueo, CD133/1-Biotin y MicroBeads anti-biotina volúmenes en consecuencia).
  6. Añadir 100 l de reactivo FcR bloqueo.
  7. Añadir 50 l CD133/1-Biotin. Mezclar bien usando un vórtice y se incuba a 4-8 ° C fo 10 min.
  8. Lavar las células mediante la adición de 10 ml de tampón MACS y se centrifuga durante 5 min a 300 xg y 4-8 ° C. Aspirar el sobrenadante por completo.
  9. Repita el paso de lavado (4,8)
  10. Resuspender el sedimento celular con 400 l tampón de MACS.
  11. Añadir 100 ml anti-biotina MicroBeads. Mezclar bien usando un vórtice y se incuba a 4-8 ° C durante 15 min.
  12. Mientras tanto, preparar el separador MACS para la separación magnética. Conecte QuadroMACS Soporte para separador MACS Multi. Insertar el número requerido de columnas LS con las alas de columna a la parte delantera en el campo magnético de la QuadroMACS. Colocar un filtro de pre-separación (con 30 micras de malla de nylon) en cada columna LS y un tubo de recogida apropiado (15 ml o 50 ml) bajo cada columna. Preparar filtro y la columna de lavado con 3 ml de tampón MACS. Deseche el filtrado.
  13. Lavar las células mediante la adición de 10 ml de tampón MACS y se centrifuga durante 5 min a 300 xg y 4-8 ° C. Aspirar el sobrenadante por completo.
  14. Resuspender las células con 500 lMACS amortiguar y aplicar suspensión de células en la columna LS con el filtro pre-separación.
  15. Lavar tres veces con 3 ml de tampón MACS por columna. Sólo añadir nuevo buffer cuando el depósito está vacío columna.
  16. El efluente recogido total contiene el no marcado CD133 - fracción celular.
  17. Deseche el filtro pre-separación, quitar la columna del separador y colocarlo en un tubo de recogida adecuado.
  18. Aplicar 5 ml de tampón MACS. Inmediatamente enjuagar las células CD133 + etiquetados con firmeza empujando el émbolo en la columna.
  19. Para aumentar la pureza de la fracción negativa, aplicar suspensión de células en una columna LS nuevo equilibrio, insertado en el QuadroMACS. El efluente contiene el CD133 - fracción.
  20. Eliminar columnas.

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Representative Results

Preparación de un solo células de tejido tumoral

La Figura 2 es un ejemplo de una metástasis de ganglio linfático resecado de un paciente melanoma en etapa tardía antes (A) y después (B) la disociación mecánica en piezas 2-4 mm. Después de la disociación enzimática del tejido y filtración a través de una malla de 70 micras de nylon, las células se sedimentaron y se descartó el sobrenadante. En este paso se observó una elevada contaminación con eritrocitos como se indica por el color rojizo de la pella celular en la Figura 2C. Posteriormente, se ha agotado las células rojas de la sangre, lo que resultó en un sedimento celular de la luz de color marrón (Figura 2D). Estas células se resuspendieron y se cultivaron con 263 Quantum medio a 37 º C y 5% CO 2.

Caracterización de cultivos de células primarias

Para validar si las células se originan a partir de tumor y no a partir de estroma circundante, se realizó RT-PCRde melanocyte/melanoma-, fibroblasto, dendríticas y los genes marcadores de células madre. Melanocitos adultos sirvió como control de las células normales para Tyr y la célula de carcinoma embrionario NCCIT línea como control positivo para el marcador de células madre CD133. Resultados de la PCR, que se muestran en la Figura 3, reveló que algunas células primarias son de hecho de origen melanocítico (positivo para TYR) y son negativas para el marcador de células dendríticas maduras (CD83). Además, las líneas celulares de melanoma se encontraron para expresar CD133, un gen esencial para la división celular asimétrica y un marcador de cáncer vástago conocido célula. HPRT se utilizó como control de carga.

Inicialmente, el cultivo de células primarias también contenía una alta contaminación con fibroblastos como se indica por la alta expresión de CD90 (Figura 3 izquierdo, panel superior).

Tras el agotamiento de fibroblastos, este cultivo celular contenía sólo TYR + de células de melanomas, y no más (fibroblastos CD90 -) (Figura 3 izquierdo, panel inferior). La ausencia de fibroblastos podría ser confirmada por microscopía de campo claro, como se muestra en la Figura 4.

Clasificación celular magnética de CD133 + y CD133 - células de melanoma

Las células primarias de melanoma, que muestran expresión de CD133 como se indica por RT-PCR se pueden clasificar en CD133 + y CD133 - células. Con el protocolo modificado de la indirecta Kit CD133 microperla, una alta pureza (> 99,75%) y el rendimiento de CD133 + y CD133-fracciones, así como una alta viabilidad de ambas fracciones después de la clasificación, se consigue. Clasificación eficacia y pureza siempre debe ser verificada mediante tinción de inmunofluorescencia o análisis de Western blot, como se muestra en la Figura 5A y B.

Figura 1 Figura 1. Esquema general del experimento. Cultivo primario de células de melanoma y el aislamiento de CD133 + putativo células madre de cáncer incluye la resección de un tumor seguido por disociación mecánica y enzimática de las células tumorales utilizando una mezcla de disociación con DNasa I y colagenasa IV y el disociador gentleMACS. Si las células tumorales están altamente contaminadas con células rojas de la sangre, una etapa de agotamiento de eritrocitos se recomienda. Cultivos de células primarias a continuación, se debe caracterizar por microscopía y análisis RT-PCR para confirmar si son células de melanoma. Una alta contaminación con fibroblastos indicado por la expresión de CD90 se puede quitar por el agotamiento de fibroblastos utilizando anti-fibroblastos Miltenyi de microperlas. Por último, CD133 + y CD133-células de melanoma puede fraccionarse mediante la indirecta CD133 Micro-Bead Kit de Miltenyi humano. Después de la clasificación, la pureza se confirma y el CD133 + unad CD133-melanoma fracciones pueden ser analizadas de lado a lado.

Figura 2
Figura 2. Preparación de un solo células de tejido tumoral. A: B Muestra de una metástasis de melanoma resecado antes de la disociación en células individuales:. Metástasis de melanoma después de la disociación mecánica del tejido tumoral en 2-4 piezas mm utilizando dos escalpelos estériles C:. Pellet de células individuales altamente contaminadas con glóbulos rojos D. : pellets de células individuales tras el agotamiento de los eritrocitos.

Figura 3
Figura 3. Análisis de la expresión de cultivos celulares primarios. Análisis RT-PCR de genes relacionados con la producción de melanina (TYR), marcador de fibroblastos (CD90), marcador de células dendríticas ( CD83) y genes cruciales para la división celular asimétrica (CD133) mostró que, inicialmente, el cultivo celular primario contenido CD133 + células de melanoma (TYR +) y no células dendríticas (CD83-) pero estaba altamente contaminado con fibroblastos (CD90 +) (panel de la izquierda, superior) . Agotamiento de fibroblastos siguiente este cultivo celular contenía sólo TYR + y CD90-células de melanoma (panel de la izquierda, inferior). HPRT se utilizó como control de carga. NCCIT y melanocitos adultos sirvió como control positivo para CD133 y Tyr, respectivamente.

Figura 4
Figura 4. Las micrografías de cultivos primarios de células antes y después de la depleción de fibroblastos. A: micrografía de campo claro de un cultivo celular primario altamente contaminado con fibroblastos B:. Campo claro micrografía del mismo cultivo primario de células de melanoma después de la depleción de fibroblastos.

e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 5
Figura 5. Verificación de MACS a través de la tinción de inmunofluorescencia y Western Blot. A: micrografías de inmunofluorescencia de las células del melanoma 24 h después de la clasificación con la indirecta CD133 Kit microesferas de Miltenyi. Las células se sembraron sobre cubreobjetos y se tiñeron con CD133 / 1 (W6B3C1) anticuerpo seguido de incubación con Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo anticuerpo secundario. Sólo en la fracción CD133 + una señal específica en la membrana celular se observó como se indica por las flechas blancas (panel izquierdo). CD133-células no se tiñeron por la presencia de la proteína (panel derecho) B:. Confirmación de la pureza de clasificación por cuantitativos Western Blot fluorescente. Un fuerte CD133 señal se detectó en la fracción CD133 +, mientras que una muy débil expresión de CD133 se observó en the-CD133 población.

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Discussion

Con el fin de eliminar contaminaciones de eritrocitos de la célula tumoral pellet es muy recomendable el uso de la célula de sangre roja solución de lisis de Miltenyi. Las ventajas de la lisis de los eritrocitos durante la centrifugación en gradiente de Ficoll densidad tradicional son que es más rápido y sencillo. Además, contaminaciones con Ficoll o células rojas de la sangre y la pérdida de las células tumorales se evitan. Cuando se observa el crecimiento de los fibroblastos en el cultivo de células primarias deben ser retirados inmediatamente, ya que normalmente crecen en exceso las células tumorales cuando se espera demasiado tiempo.

Al ordenar las células con la técnica de Miltenyi MACS se recomienda recoger las células enzimáticamente. Utilizando un rascador de células puede ser más suave a las células y sus epítopos de superficie, pero también produciría fragmentos de células, que se unen no específicamente a las columnas MACS y obstruir las columnas. Las ventajas de Accutase sobre el tradicional tripsina / EDTA tratamiento incluyen la reducción del estrés celular, leading a la viabilidad mejorado y minimiza el riesgo de introducir agentes adventicios en los cultivos celulares. La preparación Accutase no contiene proteínas bacterianas o de mamífero recombinante 28.

Para evitar la nivelación de los anticuerpos en la superficie de la célula y no específica etiquetado de células se debe trabajar con rapidez, mantener las células frío y utilizar soluciones de pre-enfriados. Todos los pasos de incubación se debe realizar a 2-8 ° C, pero no en el hielo desde temperaturas más bajas puede aumentar los tiempos de incubación. El número de células por columna ideales deben ser determinados para cada cultivo celular nuevo. En nuestro laboratorio hemos trabajado con las líneas celulares de melanoma en que una celda número máximo de 4x 10 7 células aplicadas por columna LS. Columnas MS no funcionaba en absoluto para este tipo de células. Para las células muy grandes Miltenyi también ofrece columnas de células grandes, que deben ser utilizados en su lugar.

El tampón MACS recomendado por Miltenyi contiene 2 mM EDTA y 0,5% de BSA en PBS. Si una disminución de la víadad de las células después de la clasificación magnética se observa, esto podría ser debido a la BSA y / o EDTA en el tampón. Para mejorar BSA viabilidad celular puede ser sustituido por FCS 5%, que es comúnmente mejor tolerada que la BSA. EDTA en el tampón de MACS se puede omitir para aumentar la viabilidad de la célula pero disminuirá la pureza de clasificación en un 2-3%.

Tampón MACS utiliza para equilibrar las columnas deben ser desechados. No se recomienda para recoger las células clasificadas en esta solución de equilibrio, ya que puede dañar las células. En cambio, las células según se recoge en un tubo suministrado con medio de cultivo para estabilizar las células directamente después de la clasificación.

Para evitar la obstrucción de las columnas es importante para obtener una única suspensión de células antes de la clasificación magnética haciendo pasar las células a través de una malla de nylon micras 30 (= pre-separación de Filtros). Para aumentar la pureza de la fracción negativa, una segunda pasada por una columna fresca, LS equilibrada o incluso columna LD(= Por agotamiento de las células) se sugiere.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Acknowledgments

Los autores agradecen al Prof. M. Dietel y Dirk Schumacher por apoyar este trabajo y la lectura crítica del manuscrito.

La investigación que lleva a estos resultados ha recibido el apoyo de la Empresa Común de la Iniciativa sobre medicamentos innovadores bajo acuerdo de subvención n ° 115234, recursos de los cuales están compuestos por la contribución financiera del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) y las empresas EFPIA »en clase contribución. Este trabajo fue apoyado también por el Krebsgesellschaft Berliner (BKG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

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