Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Patient Afledt Cellekultur og isolering af CD133 Published: March 13, 2013 doi: 10.3791/50200
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1,3,4
1Institute of Pathology, Laboratory of Molecular Tumor Pathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2Institute for Chemistry and Biochemistry, Free University Berlin, 3Laboratory for Functional Genomics Charité (LFGC), Charité - Universitätsmedizin Berlin, 4Comprehensive Cancer Center Charité, Charité - Universitätsmedizin Berlin

Summary

I denne artikel beskriver fremstillingen af ​​frisk opnåede melanomavæv i primære cellekulturer, og hvordan du fjerner forureninger af erythrocytter og fibroblaster fra tumorcellerne. Endelig beskriver vi, hvordan CD133

Abstract

Trods forbedrede behandlinger muligheder for melanom rådighed i dag, stadig patienter med fremskreden malignt melanom har en dårlig prognose for progressionsfri og samlet overlevelse. Derfor translationel forskning skal give yderligere molekylære beviser til at forbedre målrettede behandlinger for maligne melanomer. I fortiden, onkogene mekanismer relateret til melanom blev grundigt undersøgt i etablerede cellelinjer. På vej til mere individualiserede behandlingsplaner baseret på individuelle genetiske profiler, foreslår vi at bruge patient-afledte cellelinjer i stedet for generiske cellelinjer. Sammen med høj kvalitet kliniske data, især på patient opfølgning, vil disse celler være medvirkende til bedre at forstå de molekylære mekanismer bag melanom progression.

Her rapporterer vi etablering af primære melanom kulturer fra dissekeret friske vævsprøver. Denne procedure omfatter hakning og dissociation af vævet i enkelte celler, removal af forureninger med erytrocytter og fibroblaster samt primær kultur og pålidelig kontrol af cellernes melanom oprindelse.

Nylige rapporter viste, at melanomer, ligesom størstedelen af ​​tumorer. Havnen en lille subpopulation af kræft stamceller (specificitetsattestering), der synes at udelukkende brændstof tumor initiering og progression mod metastatisk stadie En af de vigtigste markører for CSC identifikation og isolation i melanom er CD133. For at isolere CD133 + specificitetsattestering fra primære melanom kulturer, har vi ændret og optimeret Magnetic cellesortering (MACS) procedure fra Miltenyi resulterer i høj sortering renhed og levedygtighed CD133 + specificitetsattestering og CD133 - bulk, som kan dyrkes og funktionelt analyseret derefter.

Introduction

Kutane maligne melanomer er den mindst udbredte, men mest dødbringende form for hudkræft. På grund af en stigende forekomst, en høj grad af malignitet og en hurtig formidling, melanomer nu tegner sig for 75% af maligne hudtumorer dødsfald 1,2. Udover kirurgisk excision af den primære tumor, kemoterapi, strålebehandling, immunterapi og kombineret kemo-og immunterapi af metastaseret melanom er state-of-the-art strategier for melanom behandling 3,4. Imidlertid er malignt melanom karakteriseret ved en dårlig respons på kemoterapi (5-12%) 5,6, og kun de 50-70% af melanompatienter bærer BRAF V600E genmutation gavn af lovende nye målrettede behandlinger som behandling med vemurafenib 7 Til forbedre den samlede overlevelse, er en langt bedre forståelse af mekanismerne bag melanom tumorigenese nødvendig.

For at studere disse mekanismer tidligere, veletablerede kommerciellecielt tilgængelige cellelinier blev anvendt. Nyere metoder til at studere de molekylære begivenheder i kræft initiering og progression udnytte primære kulturer afledt direkte fra tumorvæv - en strategi bærer mangfoldige fordele: Forskeren har fuld kontrol over patient og væv udvælgelse. I stikprøven celler opnået fra sagkyndigt valgt tumorvæv, ligner tumoren med alle dets heterogenitet og opfølgningsdata af patientens behov og en detaljeret patologi er tilgængelig til at tillade karakteristika af kulturen, der skal sammenlignes med den oprindelige tumor 8.

I modsætning hertil er anvendelsen af ​​etablerede cellelinjer som relevante modelsystemer i kræftforskning diskuteret kontroversielt. Allerede i 1987 Osborne og kolleger beskrevne signifikante biologiske forskelle mellem MCF-7 humane brystcancercellelinjer fra forskellige laboratorier 9. Denne omfattende genomisk ustabilitet og variation i RNA-ekspression i løbet af subkultur var confirmed ved Hiorns et al. og forudsat understøttende data for dokumentation for, at cellelinier ikke udvikler sig i kulturen og dermed svække den direkte relevans af sådanne etablerede kulturer som modeller for humane cancer 10.

En anden vigtig overvejelse, som er stort set blevet ignoreret i årenes løb, er risikoen for forurening eller tilgroning af kulturer med uafhængige "falske" celler, som først fremhævede over tyve år siden ved at demonstrere, at en lang række cellelinier blev inficeret med HeLa celler 8,11. Fejlfortolkning af data fra "falske" cellelinjer er for nylig kommet frem i litteraturen igen. Under anvendelse af en kombination af DNA-profilering og molekylær cytogenetik, afslørede MacLeod et al. Den for 252 nye tumorafledte humane cellelinjer deponeret hos den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ), næsten 18% blev fundet at være intraspecies eller interspecies cross -kontaminanter 12,13.

For at undgå disse problemer og at gøre brug af de fordele, der er nævnt ovenfor, besluttede vi at etablere lav-passage melanomcellelinjer fra frisk udtaget metastaser.

Robuste celleadskillende og analyse teknologier kræver encellede forberedelser, der skal genereres samtidig begrænser celledød og ødelæggelse af karakteristiske overfladeproteiner. En benchtop instrument til automatiseret dissociation af væv i single-cellesuspensioner er gentleMACS Dissociator fremstillet af Miltenyi. Ved anvendelse i kombination med gentleMACS C Tubes og optimeret dissociation opløsninger, en effektiv og skånsom dissociering af tumorvæv i et lukket system opnås samtidig bevare antigen-epitoper og reducere celletab. Instrumentet tilbyder optimerede, forudindstillede programmer til en række specifikke applikationer og garantier standardiseret udarbejdelse af enkelt-cellesuspensioner fra melanomavæv 14.

<p class = "jove_content"> Nylige rapporter viste, at størstedelen af ​​tumorer huser en lille subpopulation af såkaldte cancer stamceller (specificitetsattestering), som udelukkende udviser tumorfremkaldende og selvfornyende kapacitet. Identifikationen af melanocyt-producerende stamceller i dermis af huden førte til den hypotese, at disse celler kan være oprindelsen af cancer stamceller (specificitetsattestering) i melanom, da eksponering for UVA-stråling kan prime disse celler for malign transformation 15. Resultatet af en sådan genetisk læsion vil være celler, der huser en kombination af tumor og stamceller egenskaber.

En af de vigtigste markører foreslået at repræsentere subpopulation af specificitetsattestering i melanom er CD133 16-20. CD133 (også kendt som Prominin 1), et medlem af pentaspan transmembrane glycoproteiner, der er udtrykt i hæmatopoietiske stamceller, endoteliale stamceller, neuronale og gliale stamceller 21-23. Ekspression af CD133 er korreleret medasymmetrisk celledeling 24, og den glycosylerede epitop af CD133 blev vist at være nedreguleret ved celledifferentiering 25. For nylig blev CD133 + melanomceller vist at have selvfornyelse og tumor-initiering kapacitet 19,20.

At studere funktionen af CD133 + putative melanom specificitetsattestering har vi modificeret og optimeret Magnetic cellesortering (MACS) system fra Miltenyi Biotech at opnå meget beriget og levedygtige populationer af CD133 + og CD133 - celler.

Magnetisk perle-baseret celleseparation tillader enten negativ selektion som vist ved MATHEU et al. 26 eller positiv selektion som vi viser her. Under positiv selektion den særlige målcelletype, f.eks CD133 udtrykkende celler, er magnetisk mærket med mikroperler, 50 nm superparamagnetiske partikler, der er konjugeret til meget specifikke antistoffer mod etsærligt celleoverfladeantigen. Under adskillelsen er de magnetisk mærkede celler tilbageholdes i kolonnen i det magnetiske felt af separatoren, mens umærkede celler strømme igennem. Efter vasketrin, søjlen fjernes fra det magnetiske felt af separatoren, og målcellerne elueres fra søjlen. LS eller MS kolonner anvendes under positiv selektion resulterer i fraktioner af mærkede og umærkede celler med høj renhed. På den anden side,. LD søjler, der anvendes til negativ selektion, resulterer i en lidt lavere renhed af det mærkede fraktion På grund af den tættere pakning af deres matrix strømningshastigheden i disse kolonner er lavere resulterende i en øget risiko for umærkede celler, der skal fanges i kolonnen. LD kolonner bør derfor kun anvendes til stringent udtømning af en uønsket cellesubpopulation. Positiv selektion kan udføres ved direkte (antistof koblet til mikrokugler) eller indirekte magnetiske mærkning (inkubation med mikrokugler efter incubation med det primære antistof). Specifikke MACS-mikroperler er tilgængelige til positiv selektion af talrige celletyper af primære tumorceller såsom prostatahypertrofi eller melanoma 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den generelle opbygning af forsøget, herunder fremstillingen af primære single-celler fra tumorvæv, karakterisering af den primære cellekultur, fibroblast udtømning og magnetisk cellesortering af CD133 + og CD133 - melanomceller er vist i figur 1..

1. Prøveindsamling

  1. Check for etisk godkendelse, før man overvejer de næste skridt.
  2. Forbered en 50 ml rør med steril PBS suppleret med 1% penicillin-streptomycin endelig koncentration og hånd over til operation eller team.
  3. Organisere hurtig transport af tumorvæv fra operation til cellekultur lab ved 4 ° C.

2. Fremstilling Primære Melanom Single-celler fra tumorvæv

  1. Udfør alle trin under sterile forhold.
  2. Før resektion af tumor, skal en til at forberede dissociation mix. 10 ml dissociation mix pr 2-4 g væv kræves. Blandingen kan anvendes immediately eller lagres i 10 ml portioner ved -20 ° C til senere brug.
    1. Der fremstilles en opløsning indeholdende 150 mM natriumchlorid. Blandes under anvendelse af en vortex, indtil opløsningen er klar. Om nødvendigt sterilt filtrat natriumchloridopløsning anvendelse af et 0,22 um filter.
    2. Afvejes DNase I og fremstilling af en opløsning indeholdende 10 mg / ml DNase I i 150 mM natriumchlorid. Blandes ved at vende indtil opløsningen er klar.
    3. Der fremstilles en opløsning indeholdende 100mg/ml Collagenase IV i PBS. Blandes ved at vende indtil opløsningen er klar. Alikvoter af collagenase opløsning kan opbevares ved -20 ° C i flere måneder.
    4. Forbered dissociationen blanding med en slutkoncentration på 1% penicillin-streptomycin, 1 mg / ml collagenase IV og 0,1 mg / ml DNase I i Quantum 263 medium. Blandes under anvendelse af en vortex. Valgfrit: ved brug af melanom væv afledt fra huden add Amphotericin B løsning på dissociation blandingen til en slutkoncentration på 1,5 ug / ml Amphotericin B.
  3. Pre-varm required mængder af dissociation mix, PBS og Quantum 263 medium til 37 ° C.
  4. Sted tumorvæv på en steril petriskål. Aspirere overdreven opløsning fra vævet, og der tilsættes 500 pi dissociation mix. Hakkekød tumor i små stykker på 2-4 mm med friske, sterile skalpeller.
  5. Overførsel 2-4 g hakket tumorvæv i en gentleMACS C Rør, der indeholder 5 ml dissociation mix. Skyl petriskål med yderligere 4,5 ml dissociation mix og tilføje de resterende vævsfragmenter til gentleMACS C Tube.
  6. Luk gentleMACS C rør og montere den på hovedet på muffen af ​​gentleMACS Dissociator. Kør gentleMACS programmet "h_tumor_01".
  7. Frigør gentleMACS C røret fra dissociator og inkuber prøven i 30 minutter ved 37 ° C under kontinuerlig rotation ved hjælp af MACSmix Tube Rotator på den højeste run hastighed (12 rpm) eller ved at dreje røret manuelt hver 5 min for at resuspendere afregnes vævsfragmenter .
  8. Vedhæfte gentleMACS C røret op og ned på muffen af ​​than gentleMACS Dissociator og kør gentleMACS programmet "h_tumor_02".
  9. Frigør gentleMACS C røret fra dissociator og inkuber prøven i 30 minutter ved 37 ° C under kontinuerlig rotation ved hjælp af MACSmix Tube Rotator på den højeste run hastighed (12 rpm) eller ved at dreje røret manuelt hver 5 min for at resuspendere afregnes vævsfragmenter .
  10. Vedhæfte gentleMACS C røret op og ned på muffen af ​​gentleMACS Dissociator og kør gentleMACS programmet "h_tumor_03".
  11. Frigør gentleMACS C røret fra dissociator, resuspender prøve og anvendelse af cellesuspensionen til en 70 um si celle anbragt på en 50 ml rør. Hvis tilstopning af filteret sker, omrøres cellesuspension med et sterilt filter tip, indtil en fuldstændig suspension løb igennem.
  12. Skyl celle si med 5 ml Quantum 263 medium.
  13. Valgfrit: Hvis du stadig har vævsfragmenter tilbage i filteret, resuspender fragmenter i Quantum 263 medium og frø dem på passende cellekultur distime. Inkuber fragmenter ved 37 ° C og 5% CO2.
  14. Kassér cell strainer og lukke 50 ml rør med det fordøjede cellesuspension. Centrifugeres cellesuspensionen i 5 minutter ved 300 x g og kassér supernatanten.
  15. Valgfrit: Hvis cellepellet synes rødt skyldes en stor mængde af erythrocytter fremstilling 1x Red Blood Cell Lysis Solution ved fortynding 10x opløsning 1:10 i dobbeltdestilleret vand, resuspender cellepellet i 500 pi PBS, og der tilsættes 5 ml 1x Red Blood Cell Lysis Solution. Vortex 5 sek og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min. Centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g og kassér supernatanten.
  16. Resuspendér tumorceller med Quantum 263 og frø cellerne i passende cellekultur kolbe. Kultur tumorceller ved 37 ° C og 5% CO2 og rutinemæssigt passage-celler, når de når 80% konfluens.

3. Karakterisering af primær cellekultur og Fibroblast Udtømmelse

  1. Analysere primær cellekultur fænotypisk med et microscope.
  2. Høste en lille mængde (0,5 x 10 6 celler) af den primære cellekultur og udføre RT-PCR med primere for neoplastiske-, melanom-, stamcelle-og stroma celle markørgener. De vigtigste gener til analyse, er CD90 (fibroblast markør), TYR (melanoma / melanocyte markør), CD133 (cancer stamceller markør), CD83 (markør for modne dendritiske celler) og en housekeeping-gen (fx HPRT eller GAPDH).
  3. Hvis mikroskopisk analyse og høj ekspression af CD90 i løbet af RT-PCR viste en høj kontaminering af primær melanom kultur med fibroblaster, skal du nedbryder fibroblaster anvendelse af anti-fibroblaster mikroperler og D kolonner fra Miltenyi.

4. Magnetisk cellesortering af CD133 + og CD133 - melanomceller Brug LS kolonner

  1. Forbered MACS buffer indeholdende 2 mM EDTA og 5% FCS i PBS. Bland ved at vende og steril-filtrat buffer anvendelse af et 0,22 um Steritop-GP Filter Unit. Chill puffer til 4-8 ° Cog afgasses før anvendelse.
  2. Pre-varm Accutase, PBS og Quantum 263 medium til 37 ° C.
  3. Vask 80% konfluente celler med PBS. Tilsættes passende mængde Accutase og inkuberes indtil cellerne løsnes fra kulturen overflade. Indsamle celler i et 50 ml rør ved hjælp af Quantum 263 medium.
  4. Bestemme celleantallet og centrifuger det nødvendige antal celler (Ifølge Miltenyi s protokol et maksimalt antal 2 x 10 9 celler kan indlæses pr LS kolonne. Cellelinie specifikke optimale antal skal bestemmes, og kan være betragteligt.) I 5 minutter ved 300 xg og 4-8 ° C. Aspireres supernatanten fuldstændig.
  5. Resuspender højst 1x 10 8 celler med 350 pi MACS buffer (for højere celletal skalere op alle følgende MACS buffer, FcR blokeringsreagens, CD133/1-Biotin og anti-biotin mikroperler mængder i overensstemmelse hermed).
  6. Tilsæt 100 pi FcR blokerende reagens.
  7. Tilføj 50 pi CD133/1-Biotin. Bland godt under anvendelse af en vortex og inkuberes ved 4-8 ° C feller 10 min.
  8. Vask cellerne ved tilsætning af 10 ml MACS buffer og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g og 4-8 ° C. Aspireres supernatanten fuldstændig.
  9. Gentag vasketrin (4.8)
  10. Resuspender cellepellet med 400 pi MACS buffer.
  11. Tilsættes 100 gl anti-biotin mikrokugler. Bland godt under anvendelse af en vortex og inkuberes ved 4-8 ° C i 15 minutter.
  12. I mellemtiden forberede MACS separator for den magnetiske separation. Vedhæft QuadroMACS til MACS Separator Multi Stand. Sæt det nødvendige antal LS kolonner med søjlen vinger til fronten i det magnetiske felt af QuadroMACS. Placer en forseparering Filter (med 30 um nylon mesh) i hver LS-søjle og en passende opsamlingsrør (15 ml eller 50 ml) under hver søjle. Forberede filter og kolonnen ved at vaske med 3 ml MACS buffer. Skille gennemstrømning.
  13. Vask cellerne ved tilsætning af 10 ml MACS buffer og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g og 4-8 ° C. Aspireres supernatanten fuldstændig.
  14. Resuspender cellerne med 500 ulMACS buffer og anvende cellesuspensionen på LS søjlen med Pre-Separation Filter.
  15. Der vaskes tre gange med 3 ml MACS buffer per søjle. Kun tilføje ny buffer, når søjlen reservoir er tom.
  16. Det opsamlede samlede spildevand indeholder det umærkede CD133 - cellefraktion.
  17. Kassér den Pre-Separation filtrering fjernes kolonne fra separatoren og placer den på en egnet samling rør.
  18. Anvendes 5 ml MACS buffer. Umiddelbart skylle de mærkede CD133 +-celler ved kraftigt at skubbe stemplet ind i søjlen.
  19. At forøge renheden af ​​den negative fraktion, anvendes cellesuspensionen på et nyt ækvilibreret LS kolonne indsat i QuadroMACS. Effluenten indeholder CD133 - fraktionen.
  20. Kassér kolonner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fremstilling af enkelt-celler fra tumorvæv

Figur 2 eksemplificerer en resekteret lymfeknude metastase af en sen fase melanom patient før (A) og efter (B) mekanisk dissociering i 2-4 mm stykker. Efter enzymatisk dissociering af væv og filtrering gennem en 70 um nylon mesh, blev cellerne pelleteret og supernatanten kasseres. I dette trin vi observeret en stærk forurening med erythrocytter som angivet ved den rødlige farve af cellepelleten i figur 2C. Efterfølgende har vi udtømt de røde blodlegemer, hvilket resulterede i en cellepellet af lys brun farve (figur 2D). Disse celler blev resuspenderet og dyrket med Quantum 263 medium ved 37 ° C og 5% CO2.

Karakterisering af primære cellekulturer

For at validere, om cellerne stammer fra tumor og ikke fra omgivende stroma, udførte vi RT-PCRaf melanocyte/melanoma-, fibroblast-, dendritiske-og stamceller markørgener. Voksen melanocytter tjente som normale kontrolceller for TYR og den embryoniske carcinomacellelinie NCCIT som positiv kontrol for stamceller markør CD133. PCR-resultater, vist i figur 3, viste, at visse primære celler er således af melanocytisk oprindelse (positive for TYR) og er negative for markøren af modne dendritiske celler (CD83). Endvidere blev melanomcellelinjer sig at udtrykke CD133, et gen afgørende for asymmetrisk celledeling og et kendt cancer stamcelle markør. HPRT blev anvendt som indlæsning kontrol.

Indledningsvis den primære cellekultur indeholdt også en høj forurening med fibroblaster som indikeret ved høj ekspression af CD90 (fig. 3 til venstre, øvre panel).

Efter fibroblast udtømning, indeholdt denne cellekultur kun TYR + melanomcellelinjes og ikke mere fibroblaster (CD90 -) (Figur 3 venstre, nedre panel). Fraværet af fibroblaster kunne bekræftes af brightfield mikroskopi, som vist i fig. 4.

Magnetisk cellesortering af CD133 + og CD133 - melanomceller

Primære melanomceller, som viser CD133 ekspression som vist ved RT-PCR kan sorteres i CD133 + og CD133 - celler. Med modificeret protokol fra Indirekte CD133 mikroperle Kit, høj renhed (> 99,75%) og udbytte af CD133 + og CD133-fraktioner såvel som en høj levedygtighed begge fraktioner efter sortering opnås. Sortering effektivitet og renhed bør altid verificeres ved immunfluorescensfarvning eller Western blot-analyse som vist i figur 5A og B.

Figur 1 Figur 1. Generelle opbygning af eksperimentet. Primær melanom cellekultur og isolering af CD133 + putative cancer stamceller omfatter resektion af en tumor efterfulgt af mekanisk og enzymatisk dissociation af tumorcellerne under anvendelse af en dissociation blandes med DNase I og collagenase IV og gentleMACS Dissociator. Hvis tumorcellerne er stærkt forurenet med røde blodlegemer, er en erythrocyt depletion trin anbefales. Dyrkede primære celler skal derefter karakteriseret ved mikroskopisk og RT-PCR-analyse for at bekræfte, om de er melanomceller. En høj forurening med fibroblaster indikeret ved ekspression af CD90 kan fjernes ved fibroblast depletering med Miltenyi anti-fibroblaster mikroperler. Endelig kan CD133 + og CD133-melanomceller fraktioneres efter den indirekte CD133 Micro-Bead Kit menneske fra Miltenyi. Efter sortering er renheden bekræftes og CD133 + end CD133-melanom fraktioner kan analyseres ved siden af ​​hinanden.

Figur 2
Figur 2. Fremstilling af enkelt-celler fra tumorvæv. A:. Prøve af en resekteret melanom metastase før dissociering i enkeltceller B: Melanoma metastase efter mekanisk dissociering af tumorvævet i 2-4 mm stykker under anvendelse af to sterile skalpeller C:. Pellet af enkeltceller stærkt forurenet med røde blodlegemer D. : Pellet af enkelte celler efter erytrocyt udtynding.

Figur 3
Figur 3. Ekspressionsanalyse af primære cellekulturer. RT-PCR analyse af gener relateret til melaninproduktionen (TYR), fibroblast markør (CD90), dendritisk celle-markør ( CD83) og gener er afgørende for asymmetrisk celledeling (CD133) viste, at i første omgang, den primære cellekultur indeholdt CD133 + melanomceller (TYR +) og ingen dendritiske celler (CD83-), men blev stærkt forurenet med fibroblaster (CD90 +) (til venstre, øverste panel) . Følgende fibroblast udtømning denne cellekultur kun indeholdt TYR + og CD90-melanomceller (venstre, nedre panel). HPRT blev anvendt som indlæsning kontrol. NCCIT og voksne melanocytter tjente som positiv kontrol for CD133 og TYR hhv.

Figur 4
Figur 4. Mikrografer af primære cellekulturer før og efter fibroblast udtømning. A: Lysfelt mikrograf af en primær cellekultur stærkt forurenet med fibroblaster B:. Lysfelt mikrofotografi af det samme primære melanoma cellekultur efter fibroblast udtømning.

e_content "fo: keep-together.within-page =" altid "> Figur 5
Figur 5. Kontrol af MACS via immunfluorescensfarvning og western blotting. A: Immunofluorescens mikrografier af melanomceller 24 timer efter sortering med den Indirekte CD133 mikroperle Kit fra Miltenyi. Celler blev podet på dækglas og farvet med CD133 / 1 (W6B3C1) antistof efterfulgt af inkubering med Alexa Fluor 488 gede anti-kanin sekundært antistof. Kun i CD133 + fraktionen et specifikt signal på cellemembranen blev observeret som angivet med hvide pile (venstre panel). CD133-celler farvede ikke for tilstedeværelsen af proteinet (højre panel) B:. Bekræftelse af sortering renhed ved kvantitativ fluorescerende western blotting. Et stærkt CD133 signal blev detekteret i CD133 + fraktionen, mens en meget svag CD133 ekspression blev observeret i the CD133-populationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at fjerne erythrocyt forureninger fra tumor cellepellet vi stærkt anbefale at bruge den røde blodlegemer lyseopløsning fra Miltenyi. Fordelene ved lysering af erythrocytterne via det traditionelle Ficoll densitetsgradientcentrifugering er, at den er hurtigere og enklere. Endvidere er kontaminering med Ficoll eller røde blodlegemer og tab af tumorceller undgås. Når du observere væksten af ​​fibroblaster i den primære cellekultur de bør fjernes straks, da de normalt overgrow tumorcellerne når man venter for længe.

Når du sorterer celler med Miltenyi s MACS teknik anbefaler vi at høste cellerne enzymatisk. Under anvendelse af en celleskraber kan være blidere til cellerne og deres overflade-epitoper, men ville også producere cellefragmenter, som binder ikke-specifikt til MACS kolonner og tilstoppe kolonner. Fordelene ved Accutase end den traditionelle Trypsin / EDTA-behandling indbefatter reduceret celle stress, leading til forbedret rentabilitet og minimeret risikoen for at indføre fremmede agenser ind i cellekulturer. The Accutase præparat indeholder ingen mammale eller rekombinante bakterieproteiner 28.

At forhindre capping af antistoffer på celleoverfladen og uspecifik cellemærkning man bør arbejde hurtigt, holde cellerne koldt og anvender præ-afkølede opløsninger. Alle inkubationsbetingelser trin bør udføres ved 2-8 ° C, men ikke på is, eftersom lavere temperaturer kan øge inkubationstider. Den ideelle celleantal pr kolonne skal bestemmes for hver ny cellekultur. I vores laboratorium har vi arbejdet med melanomcellelinjer hvor en maksimal celle antal 4x 10 7 celler kan anvendes pr LS kolonne. MS kolonner virkede ikke på alle for denne celletype. For meget store celler Miltenyi giver også stor celle kolonner, som skal bruges i stedet.

Den MACS buffer anbefales af Miltenyi indeholder 2 mM EDTA og 0,5% BSA i PBS. Hvis et fald viaheden af ​​cellerne efter magnetisk sortering observeres, kan det være på grund af BSA og / eller EDTA i bufferen. For at forbedre cellelevedygtighed BSA kan erstattes med 5% FCS, som er almindeligt bedre tolereret end BSA. EDTA i MACS buffer kan udelades for at øge cellens levedygtighed, men vil formindske sortering renhed på 2-3%.

MACS buffer anvendes til ækvilibrering kolonnerne skal kasseres. Det anbefales ikke at indsamle de sorterede celler i denne ækvilibrering løsning, eftersom det kan skade cellerne. I stedet bør sorterede celler indsamles i et rør forsynet med dyrkningsmedium for at stabilisere cellerne direkte efter sortering.

For at undgå tilstopning af søjlerne er det vigtigt at opnå en enkelt-cellesuspension før magnetisk sortering ved at passere cellerne gennem en 30 um nylon mesh (= forseparering Filters). At forøge renheden af ​​den negative fraktion, en anden kørsel gennem en frisk, ækvilibreret LS kolonne eller endog LD kolonne(= For depletering af celler) foreslås.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Prof. M. Dietel og Dirk Schumacher for at støtte dette arbejde og kritisk læsning af manuskriptet.

Den forskning, der fører til disse resultater har modtaget støtte fra initiativet om innovative lægemidler fællesforetagende under tilskudsaftale nr. 115.234, ressourcer, som er sammensat af tilskud fra Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA virksomheder "i naturaliebidrag. Dette arbejde blev også støttet af Berliner Krebsgesellschaft (BKG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
  2. Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
  3. Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
  4. Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
  5. Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. Der Onkologe. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).
  6. Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
  7. Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
  8. Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
  9. Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
  10. Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
  11. Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
  12. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
  13. Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
  14. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
  15. Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
  16. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  17. Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
  18. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
  19. Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
  20. Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
  21. Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
  22. Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
  25. Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
  26. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
  27. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).
  28. Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).

Tags

Cancer Biology Medicin Stem Cell Biology Cellular Biology Molecular Biology Biomedical Engineering Genetics onkologi Primary cellekultur melanom MACS kræft stamceller CD133 kræft prostatakræft celler melanom stamceller cellekultur personaliseret
Patient Afledt Cellekultur og isolering af CD133<sup&gt; +</sup&gt; Formodede kræftstamceller fra melanom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, … More

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter