Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133 Published: March 13, 2013 doi: 10.3791/50200
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1,3,4
1Institute of Pathology, Laboratory of Molecular Tumor Pathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2Institute for Chemistry and Biochemistry, Free University Berlin, 3Laboratory for Functional Genomics Charité (LFGC), Charité - Universitätsmedizin Berlin, 4Comprehensive Cancer Center Charité, Charité - Universitätsmedizin Berlin

Summary

Dit artikel beschrijft de bereiding van vers verkregen melanoomweefsel in primaire celculturen en hoe verontreinigingen van erytrocyten en fibroblasten uit de tumorcellen. Tot slot beschrijven we hoe CD133

Abstract

Ondanks verbeterde behandelingen opties voor melanoom die vandaag beschikbaar zijn, patiënten met gevorderd maligne melanoom hebben nog steeds een slechte prognose voor progressievrije en algehele overleving. Daarom translationeel onderzoek moet nadere moleculaire bewijs om gerichte therapieën voor maligne melanomen te verbeteren. In het verleden oncogene mechanismen gerelateerd aan melanoom uitgebreid bestudeerd in gevestigde cellijnen. Op weg naar meer persoonlijke behandelingen op basis van individuele genetische profielen, stellen we voor om patiënten afkomstige cellijnen in plaats van generieke cellijnen gebruiken. Samen met een hoge kwaliteit klinische gegevens, met name op de patiënt follow-up, zal deze cellen een grote rol spelen om beter inzicht in de moleculaire mechanismen achter melanoomprogressie.

Hier beschrijven we de totstandkoming van primaire melanoom culturen uit ontleed vers tumorweefsel. Deze procedure omvat hakken en dissociatie van het weefsel in enkele cellen, reUitbouwen van verontreinigingen met erytrocyten en fibroblasten, evenals primaire cultuur en betrouwbare verificatie van de cellen 'melanoom oorsprong.

Recente rapporten is gebleken dat melanomen, net als de meerderheid van de tumoren, haven een kleine subpopulatie van kanker stamcellen (CSC), die lijken om uitsluitend brandstof tumor initiatie en progressie in de richting van de metastatische staat. Een van de belangrijkste markers voor CSC identificatie en isolatie in melanoom is CD133. Om CD133 + CSCs isoleren van primaire culturen melanoom, hebben we aangepast en geoptimaliseerd magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) procedure van Miltenyi resulteert in een hoge zuiverheid en sortering levensvatbaarheid van CD133 + CSC en CD133 - bulk, die kunnen worden gekweekt en functioneel geanalyseerd daarna.

Introduction

Cutane maligne melanomen zijn het minst vaak voor, maar de meeste dodelijke vorm van huidkanker. Als gevolg van een toenemende incidentie, een hoge graad van maligniteit en een snelle verspreiding, melanomen nu goed voor 75% van de kwaadaardige huidtumoren sterfgevallen 1,2. Naast chirurgische excisie van de primaire tumor, chemotherapie, radiotherapie, immunotherapie en gecombineerde chemo-en immunotherapie van uitgezaaid melanoom zijn de state-of-the-art strategieën voor melanoom behandeling 3,4. Echter, maligne melanoom gekenmerkt door een slechte reactie op chemotherapeutica (5-12%) 5,6, en alleen die 50-70% van melanoompatiënten het dragen van de BRAF V600E genmutatie profiteren van veelbelovende nieuwe gerichte therapieën als behandeling met vemurafenib 7 Om verbetering van de totale overleving, is een veel beter begrip van de mechanismen van melanomen ontstaan ​​van tumoren nodig.

Om deze mechanismen te bestuderen in het verleden, gevestigde commerciëleverkrijgbare cellijnen werden gebruikt. Meer recente benaderingen van de moleculaire gebeurtenissen van het ontstaan ​​van kanker en progressie te bestuderen gebruiken primaire culturen direct afgeleid van tumorweefsel - een strategie lager vele voordelen: De onderzoeker heeft volledige controle van de patiënt en weefsel selectie. De bemonsterde cellen verkregen van goed gekozen tumorweefsel, lijken de tumor met de heterogeniteit en de follow-up data van de patiënt en een gedetailleerde pathologie is om de karakteristieken van de cultuur worden vergeleken met die van de oorspronkelijke tumor 8.

Daarentegen is het gebruik van gevestigde cellijnen relevante modelsystemen in kankeronderzoek controversieel. Reeds in 1987 Osborne en collega's beschreven significante biologische verschillen tussen MCF-7 menselijke borstkanker cellijnen van verschillende laboratoria 9. Deze uitgebreide genomische instabiliteit en variatie in RNA expressie in subcultuur werd gezamenlijknfirmed door Hiorns et al.. en voorzien van ondersteunende gegevens voor het bewijs dat cellijnen doen evolueren in de cultuur, hetgeen de directe relevantie van deze gevestigde culturen als modellen van kanker bij de mens 10.

Een andere belangrijke overweging, die grotendeels genegeerd loop der jaren is het risico van besmetting of overmatige groei van culturen verbonden "vals" cellen, die eerst dan twintig jaar geleden benadrukt door aan te tonen dat een groot aantal cellijnen besmet waren met HeLa cellen 8,11. Verkeerde interpretatie van gegevens van "false" cellijnen is onlangs opnieuw licht in de literatuur. Een combinatie van DNA en moleculaire profilering cytogenetica, MacLeod et al.. Gebleken dat van 252 tumor afgeleide menselijke cellijnen gedeponeerd bij de Duitse verzameling van Micro-organismen en celkweken (DSMZ), bijna 18% bleken intraspecies of interspecies kruis 12,13-verontreinigingen.

Om deze problemen te vermijden en om het gebruik van de bovengenoemde voordelen maken we besloten lage passage melanoomcellijnen stellen van gekloneerde metastasen.

Robuuste cel scheiding en analyse technologieën vereisen single-cell voorbereidingen te genereren en tegelijkertijd het beperken van celdood en vernietiging van karakteristieke oppervlakte-eiwitten. Een benchtop instrument voor de geautomatiseerde dissociatie van weefsels in single-cell suspensies is de gentleMACS Dissociator vervaardigd door Miltenyi. In combinatie met gentleMACS C Tubes en geoptimaliseerde dissociatie oplossingen een effectieve en zachte dissociatie van tumorweefsel in een gesloten systeem wordt bereikt met behoud antigen epitopen en vermindering celverlies. Het instrument biedt geoptimaliseerde, vooraf ingestelde programma's voor een verscheidenheid aan specifieke toepassingen en garandeert gestandaardiseerde voorbereiding van single-cell suspensies van melanoom weefsel 14.

<p class = "jove_content"> Recente rapporten blijkt dat de meeste tumoren een kleine subpopulatie van zogenaamde kankerstamcellen (CSC), die uitsluitend vertonen tumor-initiërende en zelfvernieuwende capaciteit herbergen. De identificatie van melanocyt-producerende stamcellen in de dermis van de huid geleid tot de hypothese dat deze cellen kan het ontstaan ​​van kanker stamcellen (CSC) in melanoom omdat blootstelling aan UVA-straling kunnen deze cellen primen voor maligne transformatie 15. Het resultaat van dergelijke genetische laesie zou cellen die een combinatie van tumor en stamcel kenmerken herbergen.

Een van de belangrijkste markers voorgesteld de subpopulatie van CSCs vertegenwoordigen melanoom CD133 16-20. CD133 (ook bekend als Prominin 1), een lid van Pentaspan transmembraan glycoproteïnen, uitgedrukt in hematopoietische stamcellen, endotheliale progenitor cellen, neuronale en gliale stamcellen 21-23. Expressie van CD133 samenhangt metasymmetrische celdeling 24, en geglycosyleerde epitoop van CD133 werd aangetoond dat downgereguleerd op celdifferentiatie 25. Recent werden CD133 + melanomacellen getoond zelfvernieuwing en tumor-initiatie vermogen 19,20 hebben.

Om de functie van CD133 + vermeende melanoom CSC te bestuderen, hebben we aangepast en geoptimaliseerd de Magnetic-geactiveerde celsortering (MACS) systeem van Miltenyi Biotech tot zeer verrijkt en levensvatbare populaties van CD133 + en CD133 te verkrijgen - cellen.

Magnetische bead-based celscheiding stelt ieder negatieve selectie zoals getoond door Matheu et al. 26. Of positieve selectie als we hier weergegeven. In positieve selectie het specifieke doelcel, bijv. CD133 tot expressie brengende cellen, magnetisch gelabeld met microbolletjes, 50 nm superparamagnetische deeltjes die zijn geconjugeerd tot zeer specifieke antilichamen tegen eenspecifieke cel oppervlakte antigen. Tijdens scheiding worden de magnetisch gemerkte cellen vastgehouden in de kolom in het magnetische veld van de separator, terwijl ongelabelde cellen doorstromen. Na wasstappen werd de kolom uit het magnetische veld van de separator en de doelcellen van de kolom geëlueerd. De LS of MS kolommen tijdens positieve selectie resulteert in fracties van gelabelde en ongelabelde cellen met hoge zuiverheid. Anderzijds, LD kolommen gebruikt voor negatieve selectie, leiden tot een iets lagere zuiverheid van de gelabelde fractie. Door de dichtere pakking van de matrix het debiet in deze kolommen lager resulterende in een hoger risico gelabelde cellen te zitten in de kolom. LD kolommen moet daarom alleen worden gebruikt voor strenge uitputting van een ongewenste cel subpopulatie. Positieve selectie kan worden uitgevoerd door direct (antilichaam gekoppeld aan microbolletjes) of indirect magnetische labeling (incubatie met microbolletjes na incubation met het primaire antilichaam). Specifieke MACS microkorrels zijn beschikbaar voor de positieve selectie van verschillende celtypen van primaire tumorcellen zoals prostaat of melanoom 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De opzet van het experiment met inbegrip van de vervaardiging van primaire single-cellen van tumorweefsel, karakterisering van het primaire celkweek, fibroblast uitputting en magnetische celsortering van CD133 + en CD133 - melanoomcellen wordt getoond in Figuur 1.

1. Afnemen van het monster

  1. Controleer op ethische goedkeuring alvorens te overwegen de volgende stappen.
  2. Bereid een 50 ml buis met steriele PBS aangevuld met 1% penicilline-streptomycine eindconcentratie en overdragen aan chirurgie of team.
  3. Organiseer snel transport van tumorweefsel van een operatie aan celcultuur lab bij 4 ° C.

2. Voorbereiden primaire melanoom Single-cellen van tumorweefsel

  1. Voer alle stappen onder steriele omstandigheden.
  2. Voor de snij tumor moet men bereiden dissociatie mix. 10 ml dissociatie mix per 2-4 g weefsel vereist. De mix kan gebruikt worden onmidDirecte of opgeslagen in 10 ml porties bij -20 ° C voor later gebruik.
    1. Bereid een oplossing van 150 mM natriumchloride. Meng met behulp van een vortex tot de oplossing helder is. Eventueel steriel filtraat natriumchlorideoplossing met een 0,22 urn filter.
    2. Afgewogen DNase I en met een oplossing die 10 mg / ml DNase I in 150 mM natriumchloride. Meng door totdat de oplossing helder is.
    3. Bereid een oplossing van 100mg/ml Collagenase IV in PBS. Meng door totdat de oplossing helder is. Aliquots van collagenase oplossing kan worden bewaard bij -20 ° C enkele maanden.
    4. Bereid de dissociatie mix met een eindconcentratie van 1% penicilline-streptomycine, 1 mg / ml collagenase IV en 0,1 mg / ml DNase I in Quantum 263 medium. Meng met behulp van een vortex. Optioneel: bij gebruik melanoomweefsel uit achtergrond add amfotericine B oplossing voor de dissociatie mix tot een eindconcentratie van 1,5 ug / ml amfotericine B.
  3. Pre-warm de required hoeveelheden van dissociatie mix, PBS en Quantum 263 middelgrote tot 37 ° C.
  4. Plaats tumorweefsel op een steriele petrischaal. Zuig overmatige oplossing van het weefsel en voeg 500 ul dissociatie mix. Mince tumor in kleine stukjes van 2-4 mm met verse, steriele scalpels.
  5. Transfer 2-4 g gehakt tumorweefsel in een gentleMACS C Tube met 5 ml dissociatie mix. Spoel petrischaal met extra 4,5 ml dissociatie mix en voeg de resterende weefsel fragmenten aan het gentleMACS C Tube.
  6. Sluit gentleMACS C buis en bevestig deze ondersteboven op de mouw van de gentleMACS Dissociator. Voer het gentleMACS programma "h_tumor_01".
  7. Maak de gentleMACS C los van de dissociator en incubeer het monster gedurende 30 min bij 37 ° C onder continue rotatie met de MACSmix Tube Rotator op de hoogste snelheid run (12 rpm) of door de buis handmatig elke 5 min vaste weefselfragmenten resuspenderen .
  8. Bevestig gentleMACS C buis ondersteboven op de mouw van tHij gentleMACS Dissociator en voer het gentleMACS programma "h_tumor_02".
  9. Maak de gentleMACS C los van de dissociator en incubeer het monster gedurende 30 min bij 37 ° C onder continue rotatie met de MACSmix Tube Rotator op de hoogste snelheid run (12 rpm) of door de buis handmatig elke 5 min vaste weefselfragmenten resuspenderen .
  10. Bevestig gentleMACS C buis ondersteboven op de mouw van de gentleMACS Dissociator en voer het gentleMACS programma "h_tumor_03".
  11. Maak de gentleMACS C buis uit het dissociator, resuspendeer monster en toepassen celsuspensie een 70 urn celzeef op een 50 ml buis. Als verstopping van het filter optreedt, roer celsuspensie met een steriele filter tip tot de volledige schorsing liep door.
  12. Spoel cel zeef met 5 ml Quantum 263 medium.
  13. Optioneel: als u nog weefselfragmenten nog in de filter, resuspendeer fragmenten in Quantum 263 middelgrote en zaai ze in een geschikte celcultuur displayh. Incubeer fragmenten bij 37 ° C en 5% CO2.
  14. Gooi cel zeef en sluit de 50 ml buis met de verteerde celsuspensie. Centrifugeer celsuspensie gedurende 5 min bij 300 xg en verwijder het supernatant.
  15. Optioneel: indien celpellet lijkt rood te wijten aan een hoge mate van erytrocyten 1x Red Blood Cell Lysis Solution voor te bereiden door verdunning van 10x oplossing 1:10 in dubbel gedestilleerd water, resuspendeer celpellet in 500 pi PBS en voeg 5 ml 1x Red Blood Cell Lysis Oplossing. Vortex 5 sec en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 xg en verwijder het supernatant.
  16. Resuspendeer tumorcellen met Quantum 263 en zaad van de cellen in de juiste celkweek kolf. Cultuur tumorcellen bij 37 ° C en 5% CO2 en routinematig passage cellen wanneer ze 80% confluentie bereiken.

3. Karakterisatie van primaire cel Cultuur en Fibroblast Uitputting

  1. Analyseer primaire celkweek fenotypisch met behulp van een microscope.
  2. Oogst een kleine hoeveelheid (0,5 x 10 6 cellen) van het primaire celkweek en voer RT-PCR met primers voor neoplastische-, melanoom-, stamcellen en stroma cellen markergenen. De belangrijkste genen te analyseren zijn CD90 (fibroblast marker), TYR (melanoom / melanocyt markeerdraad), CD133 (kankerstamcel markeerdraad), CD83 (marker voor rijpe dendritische cellen) en een huishouding gen (bv. HPRT of GAPDH).
  3. Als microscopische analyse en hoge expressie van CD90 tijdens RT-PCR toonde een hoge besmetting van het primaire melanoom cultuur met fibroblasten, moet u fibroblasten met behulp van de Anti-Fibroblasten microbolletjes en D Kolommen van Miltenyi afbreken.

4. Magnetische celsortering van CD133 + en CD133 - Melanoom cellen met behulp van LS Columns

  1. Bereid MACS buffer die 2 mM EDTA en 5% FCS in PBS. Meng de inhoud door en steriel filtraat buffer met behulp van een 0,22 urn Steritop-GP Filter Unit. Chill buffer tot 4-8 ° Cen ontgassen vóór gebruik.
  2. Pre-warm Accutase, PBS en Quantum 263 middelgrote tot 37 ° C.
  3. Wassen 80% confluente cellen met PBS. Voeg juiste hoeveelheid Accutase en incubeer tot cellen los te maken van de cultuur oppervlak. Verzamel cellen in een 50 ml buis met Quantum 263 medium.
  4. Bepaal het aantal cellen en centrifugeer het vereiste aantal cellen (volgens protocol Miltenyi's een maximum aantal 2x 10 9 cellen kan worden geladen per LS kolom. Cellijn specifieke optimale getallen worden bepaald en kunnen aanzienlijk lager.) Gedurende 5 min bij 300 xg en 4-8 ° C. Volledig aspireren supernatant.
  5. Resuspendeer maximaal 1x 10 8 cellen met 350 pi MACS buffer (voor het hoger aantal cellen opschalen alle volgende MACS buffer dienovereenkomstig, FcR Blocking Reagent, CD133/1-Biotin en anti-biotine microbolletjes volumes).
  6. Voeg 100 ul FcR Blocking Reagent.
  7. Voeg 50 ul CD133/1-Biotin. Goed mengen met een vortex en incubeer bij 4-8 ° C fof 10 min.
  8. Was de cellen door toevoeging van 10 ml MACS-buffer en centrifugeer 5 min bij 300 xg en 4-8 ° C. Volledig aspireren supernatant.
  9. Herhaal wasstap (4.8)
  10. Hersuspendeer celpellet met 400 ul MACS buffer.
  11. Voeg 100 ul anti-biotine microbolletjes. Goed mengen met een vortex en incubeer bij 4-8 ° C gedurende 15 minuten.
  12. Ondertussen bereiden MACS separator voor magnetische scheiding. Bevestig QuadroMACS aan MACS Separator Multi Stand. Plaats het gewenste aantal LS kolommen met de kolom vleugels naar voren in het magnetische veld van de QuadroMACS. Hem vooraf scheidingsfilter (met 30 pm nylon mesh) in elk LS kolom en een geschikte verzamelbuis (15 ml of 50 ml) onder elke kolom. Bereid filter en kolom te spoelen met 3 ml MACS buffer. Gooi flow-through.
  13. Was de cellen door toevoeging van 10 ml MACS-buffer en centrifugeer 5 min bij 300 xg en 4-8 ° C. Volledig aspireren supernatant.
  14. Resuspendeer cellen met 500 piMACS buffer en celsuspensie toe te passen op de LS kolom met de Pre-scheidingsfilter.
  15. Was driemaal uit met 3 ml MACS buffer per kolom. Voeg alleen nieuwe buffer wanneer de kolom reservoir leeg is.
  16. De verzamelde totale uitstroom bevat de ongelabelde CD133 - celfractie.
  17. Gooi de Pre-scheidingsfilter, verwijder kolom van de afscheider en plaats deze op een geschikte verzamelbuis.
  18. Breng 5 ml MACS buffer. Onmiddellijk spoelen van de gelabelde CD133 + cellen door stevig indrukken van de zuiger in de kolom.
  19. De zuiverheid van de negatieve fractie verhogen toepassing celsuspensie op een nieuw evenwicht LS kolom ingevoegd in de QuadroMACS. Het effluent bevat de CD133 - fractie.
  20. Gooi kolommen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bereiding van enkele cellen van tumorweefsel

Figuur 2 illustreert een weggesneden lymfeklier van een laat stadium melanoom patiënt vóór (A) en na (B) mechanische dissociatie in 2-4 mm gesneden. Na enzymatische dissociatie van het weefsel en filtratie door een 70 urn nylongaas, cellen werden gepelletiseerd en de supernatant verwijderd. Bij deze stap neemt een sterke verontreiniging met erytrocyten zoals aangegeven door de rode kleur van de celpellet in figuur 2C. Vervolgens hebben we uitgeput de rode bloedcellen, hetgeen resulteerde in een celpellet van lichtbruine kleur (Figuur 2D). Deze cellen werden geresuspendeerd en gekweekt met Quantum 263 medium bij 37 ° C en 5% CO2.

Karakterisering van primaire celculturen

Te valideren of de cellen afkomstig zijn van tumor en niet van omliggende stroma, voerden we RT-PCRvan melanocyte/melanoma-, fibroblast-, dendritische-en stamcel marker-genen. Volwassen melanocyten diende als controle normale cellen voor TYR en embryonale carcinoma cellijn NCCIT als positieve controle voor de stamcellen marker CD133. PCR resultaten, getoond in figuur 3, is gebleken dat enkele primaire cellen inderdaad van melanocytische oorsprong (positief voor TYR) en negatief zijn voor het marker van gerijpte dendritische cellen (CD83). Verder werden melanoomcellijnen gevonden express CD133, een gen dat cruciaal is voor asymmetrische celdeling en een bekende kankerstamcel marker. HPRT werd gebruikt als laad-controle.

Aanvankelijk de primaire celkweek bevatte ook een hoge contaminatie met fibroblasten zoals aangegeven door de hoge expressie van CD90 (Figuur 3 links, bovenste paneel).

Na fibroblast uitputting, deze cel cultuur bevatte slechts TYR + melanoom cellens en niet meer fibroblasten (CD90 -) (figuur 3 links, onderste paneel). Aangezien fibroblasten kon worden bevestigd door helderveld microscopie zoals getoond in figuur 4.

Magnetische cel sorteren van CD133 + en CD133 - melanoomcellen

Primair melanoom cellen, die CD133 expressie tonen zoals aangegeven door RT-PCR kunnen worden gesorteerd in CD133 + en CD133 - cellen. Met het gemodificeerde protocol van de indirecte CD133 microbeads Kit, een hoge zuiverheid (> 99,75%) en opbrengst van CD133 + en CD133-fracties, en een hoge levensvatbaarheid van beide fracties na sortering wordt bereikt. Sorteren werkzaamheid en zuiverheid altijd te worden gecontroleerd door immunofluorescentie kleuring of western blot analyse zoals getoond in figuur 5A en B.

Figuur 1 Figuur 1. Opzet van het experiment. Primair melanoom celkweek en isolatie van CD133 + putatieve kanker stamcellen omvat de resectie van de tumor, gevolgd door mechanische en enzymatische dissociatie van tumorcellen met een dissociatie mix met DNase I en IV Collagenase en gentleMACS Dissociator. Als de tumorcellen sterk verontreinigd met rode bloedcellen, wordt een erythrocyt uitputting stap aanbevolen. Gekweekte primaire cellen wordt vervolgens gekenmerkt door microscopische en RT-PCR analyse te bevestigen wanneer zij melanomacellen. Een hoge contaminatie met fibroblasten aangegeven door expressie van CD90 kunnen worden verwijderd door fibroblast depletie met anti-Miltenyi fibroblasten microbolletjes. Ten slotte kan CD133 + en CD133-melanoomcellen worden gefractioneerd met behulp van de indirecte CD133 Micro-Bead Kit mens van Miltenyi. Na het sorteren wordt zuiverheid bevestigd en de CD133 + eend CD133-melanoom fracties worden geanalyseerd naast elkaar.

Figuur 2
Figuur 2. Bereiding van enkele cellen van tumorweefsel. A:. Voorbeeld van een verwijderde melanoom voor dissociatie in enkele cellen B: melanoom na mechanische dissociatie van het tumorweefsel in 2-4 mm gesneden met twee steriele scalpels C:. Pellet van enkele cellen sterk verontreinigd met rode bloedcellen D. : Pellet van enkele cellen na erytrocyten uitputting.

Figuur 3
Figuur 3. Expressieanalyse van primaire celculturen. RT-PCR analyse van genen betrokken bij melanine (TYR), fibroblast marker (CD90), dendritische cel marker ( CD83) en genen essentieel voor asymmetrische celdelingen (CD133) bleek dat aanvankelijk de primaire celkweek CD133 bevatte + melanomacellen (TYR +) en geen dendritische cellen (CD83-), maar was sterk verontreinigd met fibroblasten (CD90 +) (links, bovenste paneel) . Na fibroblast uitputting dit celcultuur bevatte slechts TYR + en CD90-melanoomcellen (links, onderste paneel). HPRT werd gebruikt als ladingcontrole. NCCIT en volwassen melanocyten diende als positieve controle voor CD133 en TYR respectievelijk.

Figuur 4
Figuur 4. Microfoto van primaire celculturen voor en na uitputting fibroblast. A: Brightfield microfoto van een primaire celkweek sterk verontreinigd met fibroblasten B:. Brightfield microfoto van dezelfde primaire melanoom celkweek na fibroblast uitputting.

e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figuur 5
Figuur 5. Verificatie van de MACS via immunofluorescentiekleuring en western blotting. A: Immunofluorescentie microfoto van melanoom cellen 24 uur na het sorteren met de indirecte CD133 microbeads Kit van Miltenyi. Cellen werden gezaaid op dekglaasjes en gekleurd met CD133 / 1 (W6B3C1) antilichaam, gevolgd door incubatie met Alexa Fluor 488 geit anti-konijn secundair antilichaam. Alleen in de CD133 + fractie een specifiek signaal op het celmembraan waargenomen zoals aangegeven door witte pijlen (linker paneel). CD133-cellen niet kleuren voor de aanwezigheid van het eiwit (rechter paneel) B:. Bevestiging van sorteren zuiverheid kwantitatieve fluorescentie western blotting. Een sterk signaal werd gedetecteerd CD133 in de CD133 + fractie, terwijl een zeer zwakke CD133 expressie werd waargenomen in the CD133-bevolking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Om erythrocyten verontreinigingen uit de tumorcel pellet raden wij de rode bloedcel lysisoplossing van Miltenyi. De voordelen van het lyseren van de erytrocyten in de traditionele Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugeren worden dat het sneller en eenvoudiger. Bovendien worden verontreinigingen met Ficoll of rode bloedcellen en het verlies van tumorcellen vermeden. Wanneer u de groei van fibroblasten in de primaire celcultuur in acht moeten ze onmiddellijk worden verwijderd omdat zij normaal gesproken overwoekeren de tumorcellen tijdens het wachten te lang.

Bij het sorteren cellen met Miltenyi's MACS techniek die we raden het oogsten van de cellen enzymatisch. Met een celschraper kan zachter voor de cellen en hun oppervlakte-epitopen, maar produceren ook celfragmenten, die niet-specifiek binden aan het MACS kolommen en verstoppen de kolommen. De voordelen van Accutase opzichte van de traditionele trypsine / EDTA behandeling zijn verminderd cel stress, leading tot een betere leefbaarheid en minimaal risico van de invoering van vreemde stoffen in de cel culturen. De Accutase preparaat bevat geen zoogdier-of recombinante bacteriële eiwitten 28.

Om aftopping van antilichamen op het celoppervlak en niet-specifieke labeling een cel voorkomen moeten snelle werking houden cellen koude en gebruiken voorgekoelde oplossingen. Alle incubatie stappen moeten worden uitgevoerd bij 2-8 ° C, maar niet op ijs omdat lagere temperaturen kunnen toenemen incubatietijden. Het ideale aantal cellen per kolom moet worden vastgesteld voor elke nieuwe celkweek. In ons lab werkten we met melanoom cellijnen waar een maximum aantal cellen van 4x 10 7 cellen kunnen worden toegepast per LS kolom. MS kolommen niet helemaal werken voor dit type cel. Voor zeer grote cellen Miltenyi biedt ook grote Cell kolommen, die zouden moeten worden gebruikt.

De MACS buffer aanbevolen door Miltenyi bevat 2 mM EDTA en 0,5% BSA in PBS. Als een verminderde vialijkheid van de cellen na magnetische sortering wordt waargenomen, kan dit door de BSA en / of EDTA in de buffer. Levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren BSA kan worden vervangen door 5% FCS, die gewoonlijk beter getolereerd dan BSA. EDTA in de MACS buffer kan weggelaten worden om de cel levensvatbaarheid toenemen maar zal het sorteren zuiverheid dalen 2-3%.

MACS buffer gebruikt om de kolommen evenwicht moet worden weggegooid. Het is niet aan te raden om de gesorteerde cellen te verzamelen in deze evenwichtstoestand oplossing, omdat het kan schade aan de cellen. In plaats daarvan moeten gesorteerde cellen worden verzameld in een buis voorzien van kweekmedium om de cellen te stabiliseren direct na sortering.

Om verstopping te voorkomen van de kolommen is het belangrijk om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen voor magnetische sortering van de cellen passeren door een 30 pm nylon mesh (= Pre-Separation Filters). Om de zuiverheid van de negatieve breuk, een tweede termijn te vergroten door middel van een frisse, in evenwicht gebracht LS kolom of zelfs LD kolom(= Voor depletie van cellen) voorgesteld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs danken prof. dr. M. Dietel en Dirk Schumacher voor de ondersteuning van dit werk en het kritisch lezen van het manuscript.

Het onderzoek dat leidt tot deze resultaten heeft steun gekregen van het Innovative Medicines Initiative gemeenschappelijke onderneming onder subsidieovereenkomst nr. 115234, middelen waarvan van de financiële bijdrage bestaat uit Zevende Kaderprogramma van de Europese Unie (FP7/2007-2013) en EFPIA ondernemingen "in soort bijdrage. Dit werk werd ondersteund door de Berliner Krebsgesellschaft (BKG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
  2. Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
  3. Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
  4. Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
  5. Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. Der Onkologe. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).
  6. Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
  7. Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
  8. Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
  9. Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
  10. Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
  11. Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
  12. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
  13. Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
  14. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
  15. Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
  16. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  17. Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
  18. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
  19. Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
  20. Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
  21. Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
  22. Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
  25. Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
  26. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
  27. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).
  28. Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).

Tags

Kankerbiologie Geneeskunde Stem Cell Biology Cellular Biology Moleculaire Biologie Biomedische Technologie Genetica Oncologie Primaire celkweek melanoom MACS kanker stamcellen CD133 kanker prostaatkanker cellen melanoom stamcellen celcultuur persoonlijke behandeling
Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, … More

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter