Summary
本文介绍了准备的新鲜获得的原代细胞培养，以及如何去除污染的红细胞和成纤维细胞的肿瘤细胞的黑色素瘤组织到。最后，我们介绍了如何CD133
Abstract
尽管改进治疗方法的选择黑色素瘤的今天，晚期恶性黑色素瘤患者的无进展生存和总体生存的预后较差。因此，翻译研究的需要，以改善恶性黑色素瘤的靶向治疗提供进一步的分子生物学证据。在过去，致癌黑色素瘤有关的机制在已建立的细胞系中进行了广泛的研究。在个人基因图谱的基础上，以更加个性化的治疗方案，我们建议使用患者来源的细胞系，而不是普通的细胞株。再加上高品质的临床数据，尤其是在患者随访，这些细胞将有助于更好地理解背后的分子机制黑色素瘤的进展。
在这里，我们报告的原发性黑色素瘤的解剖新鲜肿瘤组织文化的建立。此过程包括切碎的组织分离成单个细胞，再moval与红细胞和成纤维细胞的原代培养细胞的黑色素瘤起源和可靠的核查以及污染。
最近的报告表明，多数肿瘤，黑色素瘤，如港口小亚群的肿瘤干细胞（CSCs），这似乎是专门推动肿瘤的发生和发展对转移状态。 CSC在黑色素瘤的识别和隔离的关键指标之一是CD133。隔离CD133 +干细胞从原发黑色素瘤的文化，我们修改和优化，磁激活细胞分选（MACS）从美天旎程序导致排序纯度高和活力的CD133 +干细胞，CD133 -散装，它可以培育和功能分析此后。
Introduction
皮肤恶性黑色素瘤是最常见的，也是最致命的皮肤癌类型。由于发病率越来越高，一个高品位的恶性和快速的传播，恶性黑色素瘤占75％的恶性皮肤肿瘤相关死亡1,2。除了 手术切除原发肿瘤，化疗，放疗，免疫治疗和化疗和免疫治疗转移性黑色素瘤是国家的最先进的黑色素瘤的治疗策略，3,4。然而，恶性黑色素瘤的特点是对化疗药物的反应不佳（5-12％）5,6，和只有50％-70％的恶性黑色素瘤患者携带BRAF V600E基因突变的好处有前途的新的靶向治疗药物的治疗vemurafenib 7提高总生存率，更好地了解黑色素瘤肿瘤的机制是必要的。
为了研究这些机制在过去，完善的市售单独购买可用的细胞株。利用最近的方法来研究癌症的发生和发展的分子事件的主要直接来源于肿瘤组织的文化 - 一种策略轴承多方面的好处：研究者具有完全控制的患者和组织的选择。采样的细胞获得的专业选择肿瘤组织的肿瘤，像所有的异质性，对病人的随访数据和详细的病理是允许的文化进行比较的特点与原发肿瘤8。
与此相反，在癌症研究中作为相关的模型系统的建立的细胞系的使用有争议的讨论。早在1987年，奥斯本和他的同事们描述了来自不同实验室9人乳腺癌MCF-7细胞株显着的生物差异。这种广泛的基因组不稳定性，在传代过程中RNA的表达变化合作nfirmed由Hiorns 等，并提供证据表明，细胞系在培养演变，从而削弱了这种既定文化作为人类癌症10的模型直接相关的数据支持。
多年来，这在很大程度上被忽视了，是另一个重要的考虑无关的'假'的细胞，这是第一次在20年前通过展示突出文化与污染或过度生长的风险，大量被污染的细胞系HeLa细胞细胞8,11。误解'假'细胞株的数据，最近在文献中再次暴露出来。使用DNA分析和分子细胞遗传学的结合，MacLeod 等人发现，252个新的人类肿瘤源性细胞株存放在德国收集的微生物和细胞培养（DSMZ），近18％被认为是种内或种间杂种污染物12,13。
为了避免这些问题，并利用上述的优点，我们决定建立低传代新鲜切除转移的黑色素瘤细胞系。
同时限制细胞的死亡和破坏特征的表面蛋白单细胞的准备工作，以产生强大的细胞分离和分析技术。台式仪器的自动分离成单细胞悬液组织是由美天旎制造gentleMACS离解。当使用结合gentleMACSÇ管和优化的解离的解决方案，在一个封闭的系统中的肿瘤组织的一个有效和温和解离来实现，同时保留抗原表位，并减少信元丢失。该仪器提供了优化，预先设定的程序的各种特定的应用程序和担保标准化制备单细胞悬浮液从黑色素瘤组织14。
<P类=的“jove_content”>最近的报告表明，多数肿瘤怀有小亚群所谓的肿瘤干细胞（CSCs），只表现出肿瘤的启动和自我更新的能力。的皮肤的真皮层中的黑素细胞产生的干细胞的识别导致的假设，即这些细胞可能会对在黑素瘤中的肿瘤干细胞（CSCs）的起源，因为暴露于紫外线辐射可以灌注，这些细胞的恶性转化15。这种遗传病变的结果将是怀有相结合的肿瘤干细胞特性的细胞。建议在黑色素瘤干细胞亚群的代表的关键标志物之 一是CD133的16-20。 CD133（也称为作为Prominin 1），一个部件的pentaspan跨膜糖蛋白，是表示，在造血干细胞，血管内皮祖细胞，神经元和神经胶质干细胞21-23。 CD133表达与不对称细胞分裂24，以及被证明是糖基化的抗原表位的CD133下调细胞分化时25。最近，CD133 +黑色素瘤细胞具有自我更新和肿瘤起始容量19,20。
为了研究CD133 +公认的黑色素瘤干细胞的功能，我们修改和优化的磁性活化细胞分选系统（MACS）从美天旎生物技术获得的丰富和可存活种群的CD133 +和CD133 -细胞。
基于磁珠细胞分离可以是负选择Matheu 等 26或积极的选择，我们在这里展示。阳性选择的过程的特定的靶细胞类型， 例如 CD133的表达细胞，微珠，50-nm的超顺磁性粒子，是共轭高度特异性抗体针对磁标记特定的细胞表面抗原。分离过程中，磁标记的细胞被保留在柱中，在磁场中的隔板，而标记的细胞流经。洗涤步骤之后，该列被删除从磁场的分离器，和靶细胞，从柱中洗脱。 LS或使用MS列的分数高纯度的标记和未标记的细胞阳性选择的过程。另一方面，LD列，用于负选择，导致稍微低的纯度的标记的部分。由于它们的矩阵变浓的包装在这些列中的流速是低级所得在被困在列中的未标记细胞的风险较高。 LD列，因此，应仅用于不需要的细胞亚群的严格耗尽。可以通过直接（耦合到微珠的抗体）或间接的磁性标记（孵化后incubatio与微珠的阳性筛选n与第一抗体）。具体MACS微珠可用于许多类型的细胞的阳性筛选原发性肿瘤细胞，如前列腺癌或黑素瘤27。
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Protocol
实验的总体方案包括制备初级单细胞从肿瘤组织中，表征初级细胞培养，成纤维细胞耗竭和磁性细胞分选的CD133 +和CD133 -黑色素瘤细胞的是，在图1中所示。
1。样品采集
- 伦理审查的检查，然后再考虑下一个步骤。
- 准备一个50毫升的试管，用无菌PBS与1％青霉素 - 链霉素的最终浓度和交出手术或团队补充。
- 组织快速运输手术的肿瘤组织细胞培养实验室，在4°C。
2。准备原发性黑色素瘤单细胞肿瘤组织
- 在无菌条件下执行所有步骤。
- 在切除肿瘤之前，需要准备的分解组合。 10毫升的分解组合，每2-4克组织是必需的。可以使用的混合immediately或存储在10毫升的等分试样在-20℃下，购买使用。
- 准备含有150mM氯化钠的溶液。混合使用的涡流，直到溶液澄清。如果有必要的无菌滤液的氯化钠溶液，用0.22μm的过滤器。
- 称取DNA酶I，并含有10毫克/毫升DNA酶I在150MM氯化钠制备的溶液。通过翻转混合，直到溶液澄清。
- 在PBS中含有100mg/ml胶原酶IV准备的解决方案。通过翻转混合，直到溶液澄清。胶原酶溶液的等分试样在-20℃下，可以存储数个月。
- 准备与最终浓度为1％青霉素 - 链霉素，1毫克/毫升胶原酶IV和0.1毫克/毫升DNA酶I量子263介质中离解混合。混合使用的旋涡。可选：当使用来自从皮肤添加两性霉素B溶液至终浓度为1.5微克/毫升两性霉素B的解离混合的黑色素瘤组织
- 温暖的REQuired量的PBS和量子分解组合，263中等至37°C
- 将肿瘤组织在无菌培养皿中。组织和吸入过量的溶液，加入500μl分解组合。百果2-4毫米，采用新鲜，无菌手术刀切成小块肿瘤。
- 传输2-4克肿瘤组织绞碎成gentleMACS C管含5毫升的分解组合。冲洗培养皿中，用4.5毫升分离混合，并加入剩余的组织碎片的gentleMACS C管。
- 关闭gentleMACS C管，并将它附加倒挂在套筒上的gentleMACS离解。运行的gentleMACS计划“h_tumor_01。
- 分离的gentleMACS C管的离解器和样品孵育30分钟，在37℃下连续旋转使用的MACSmix管肩的最高运行速度（12转）或通过手动转动管，每5分钟，以重新悬浮结算组织碎片。
- 颠倒gentleMACS C管安装在套筒上的t他gentleMACS离解和运行的gentleMACS的节目“h_tumor_02”的。
- 分离的gentleMACS C管的离解器和样品孵育30分钟，在37℃下连续旋转使用的MACSmix管肩的最高运行速度（12转）或通过手动转动管，每5分钟，以重新悬浮结算组织碎片。
- 将gentleMACS C管，倒挂在套筒上的gentleMACS离解，运行gentleMACS计划“h_tumor_03”。
- 分离的gentleMACS的C管的离解，重悬样品，应用细胞悬液50毫升的试管放在一个70微米的细胞过滤器。如果过滤器的堵塞时，搅拌细胞悬浮液用无菌的过滤嘴，直到完整的悬浮液穿过。
- 用5毫升的量子263培养基冲洗细胞过滤网。
- 可选：如果你还有组织碎片留在过滤器，重悬片段在263昆腾的介质和种子，他们在适当的细胞培养显示小时。孵育片段，在37℃和5％CO 2的 。
- 弃细胞过滤器，并关闭50毫升管与消化的细胞悬液。 5分钟离心细胞悬液300×g离心，弃去上清液。
- 可选：如果细胞沉淀出现红色的，由于高量的红细胞准备1个红血细胞裂解液500μLPBS稀释10倍的解决方案，双蒸水重悬细胞沉淀在1:10，加入5毫升1个红细胞裂解解决方案。涡5秒后，在室温下孵育10分钟的温度。在300 XG离心5分钟，弃去上清液。
- 重悬与Quantum 263和种子细胞在适当的细胞培养瓶中的肿瘤细胞。文化的肿瘤细胞，在37℃和5％CO 2和常规传代细胞，当他们达到80％汇合。
3。原代细胞培养的表征和成纤维细胞耗竭
- 分析原代细胞培养的表型使用microscoPE。
- 收获的原代细胞培养中的一个小的量（0.5×10 6个细胞），并与肿瘤，黑色素瘤，干细胞和基质细胞的标记基因的引物，进行RT-PCR。最重要的基因分析的是CD90（成纤维细胞标记），TYR（黑色素瘤/黑素细胞标记物），CD133（癌干细胞标志物），CD83（标记为成熟树突状细胞）和管家基因（ 例如 HPRT或GAPDH）。
- 如果微观分析，在RT-PCR显示高污染的原发性黑色素瘤文化与成纤维细胞高表达CD90，你需要消耗使用反成纤维细胞微珠和D列美天旎的成纤维细胞。
4。磁性细胞分选的CD133 +和CD133 -黑色素瘤细胞LS列
- 准备MACS缓冲液含有2mM EDTA和5％FCS的PBS。混合使用0.22微米Steritop的GP过滤器的反相和无菌滤液缓冲。 4-8°C的冷藏缓冲并对其进行脱气后方可使用。
- 前的温暖Accutase，PBS和Quantum 263中的37°C。
- 用PBS洗净80％汇合的细胞。加入适量的Accutase和孵化，直到细胞的培养表面脱离。在一个50毫升的试管使用量子263培养基，收集细胞。
- 确定的细胞数和离心的所需数目的细胞（根据Miltenyi公司的协议的一个最大数的2×10 9细胞可以被加载每LS柱。细胞行具体的最优数目应被确定，并可以相当低的。）5分钟，在300 xg和4-8°C。完全吸出上清液。
- 重悬最大为1×10 8个细胞，350μLMACS缓冲（更高的手机号码规模以下所有MACS缓冲，FcR阻断的试剂，CD133/1-Biotin和抗生物素微珠体积相应）。
- 加入100μlFcR阻断剂。
- 加入50微升CD133/1-Biotin。混合使用的旋涡，并培育4-8°C F或10分钟。
- 在300 xg和4-8℃，加入10ml MACS缓冲液和5分钟离心洗涤细胞完全吸出上清液。
- 重复洗涤步骤（4.8）
- 重悬细胞沉淀用400μl的MACS缓冲。
- 加入100μl抗生物素微球。混合使用涡，并在4-8°C孵育15分钟。
- 同时，准备MACS分离器，磁分离。附加QuadroMACS MACS分离器多架。插入所需数量的LS列与列翼的前部中的磁场的QuadroMACS。预分离过滤器（30μm的尼龙网）放置到每个LS柱和一个适当的集合管（15毫升或50毫升），根据每列。准备过滤器和列的通过用3ml MACS缓冲液漂洗。丢弃流过。
- 在300 xg和4-8℃，加入10ml MACS缓冲液和5分钟离心洗涤细胞完全吸出上清液。
- 重悬细胞用500μlMACS缓冲和应用细胞悬液的LS栏上与前分离滤芯。
- 洗涤三次，用3ml MACS每列的缓冲区。列水库是空的，只有添加新的缓冲区。
- 将收集的总流出物含有未标记的CD133 -细胞组分。
- 丢弃前分离过滤器，删除列从分离器，并把它放在一个合适的收集管中。
- 加5毫升MACS缓冲。立即冲洗出来的标记CD133 +细胞，用力推将柱塞压入列。
- 若要增加纯度负馏分，细胞悬浮液应用到一个新的平衡LS柱插入在QuadroMACS。污水中含有的CD133 -分数。
- 丢弃列。
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Representative Results
从肿瘤组织中的单细胞的制备
图2例示的晚期黑色素瘤患者切除的淋巴结转移前（A）和（B）机械分离后为2-4毫米。酶解后的组织并通过70微米尼龙网过滤，将细胞沉淀，并弃去上清。在这一步骤中，我们观察到高污染的红细胞的细胞沉淀，在图2C中所表示的颜色偏红。接着，我们耗尽的红血细胞，这导致在细胞沉淀的浅棕色（ 图2D）。这些细胞再悬浮，并在37℃和5％CO 2的量子263培养基与培养。
原代细胞培养物的表征
为了验证是否来源于肿瘤细胞，而不是从我们周围的基质，进行RT-PCRmelanocyte/melanoma-，成纤维细胞，树突状和干细胞的标记基因。担任成人黑素细胞TYR作为阳性对照的干细胞标记CD133和胚胎癌细胞线NCCIT的正常对照组。 PCR的结果，在图3中所示，显示，一些初级细胞确实是黑素细胞起源（阳性TYR）和成熟树突状细胞的标记（CD83）为阴性。此外，黑色素瘤细胞系中发现表达CD133，不对称的细胞分裂和公知的癌干细胞标志物的基因的关键。HPRT用作加载控制。
最初，与成纤维细胞原代细胞培养也包含高污染，如所指示的高表达CD90（ 图3左，上面板）。
这个细胞培养成纤维细胞耗竭，只包含的TYR +黑色素瘤细胞s和没有更多的成纤维细胞（CD90 - ）（ 图3左，下面板）。明视野显微镜，可以确认，如在图4中示出的成纤维细胞的缺乏。
磁性细胞分选的CD133 +和CD133 -黑色素瘤细胞
原发性黑色素瘤细胞，如表示通过RT-PCR显示CD133的表达可以被排序成CD133 +和CD133 -细胞。与修改后的协议从间接CD133微珠套件，高纯度（> 99.75％）和产率的CD133 +和CD133馏分，以及排序后，实现两个级分的高可行性。排序的疗效和纯度应始终验证通过免疫荧光染色或Western印迹分析，如在图5A和B所示。
图1。总体方案的实验。初级黑色素瘤细胞的CD133 +假定肿瘤干细胞的培养和分离包括随后机械和酶的肿瘤细胞用DNase I和胶原酶IV和gentleMACS的离解器中使用的解离混合解离的肿瘤切除。如果高度污染的肿瘤细胞与红血细胞，红细胞耗尽步骤建议。原代培养的细胞，然后必须将其特征在于，显微镜和RT-PCR分析，以确认，如果他们是黑素瘤细胞。高污染与成纤维细胞表达CD90表示可以由成纤维细胞耗尽使用Miltenyi公司的抗成纤维细胞微珠除去。最后，CD133 +和CD133-黑色素瘤细胞可以分离使用间接CD133微珠试剂盒人类从美天旎。经过分选，纯度得到确认和CD133 +的ðCD133-黑色素瘤的分数可以分析相映成趣。
图2。从肿瘤组织中的单细胞的制备。甲 ：示范切除黑色素瘤转移之前，解离成单个细胞。 乙 ：黑色素瘤，转移后的肿瘤组织的机械分离成2-4毫米的片，使用两个无菌解剖刀。C：佩莱高度污染的红血细胞。D的单细胞颗粒的单细胞，红细胞消耗。
图3。原代细胞培养的表达分析。黑色素的生产（TYR），成纤维细胞标记（CD90），树突状细胞的标记有关的基因的RT-PCR分析（ CD83）和非对称细胞分裂（CD133）的关键基因的表明，最初，在初级细胞培养含有的CD133 +黑色素瘤细胞（TYR +）和没有的树突状细胞（CD83-），但被高度污染的成纤维细胞（CD90 +）（左，上面板） 。下面的成纤维细胞耗尽此细胞培养物中只含有TYR +和CD90-黑色素瘤细胞（左，下面板）。 HPRT被用作装载控制。 NCCIT和成年人的黑色素细胞CD133和TYR阳性对照，分别担任。
图4。原代细胞培养成纤维细胞耗尽之前和之后的显微照片。答 ：明视场显微镜照片与成纤维细胞的原代细胞培养高度污染的，B：相同的主成纤维细胞耗尽后的黑色素瘤细胞培养的明视场显微照片。
图5。 MACS通过免疫荧光染色和免疫印迹法验证。 A：黑色素瘤细胞的免疫荧光显微排序与间接CD133微珠试剂盒美天旎的24小时之后。细胞接种于盖玻片和CD133 / 1（W6B3C1）随后用Alexa Fluor 488山羊抗兔第二抗体孵育的抗体染色。的CD133 +馏分在细胞膜上的一个特定的信号只有在观察到由白色箭头（左面板）所示。 CD133-细胞没有染色的蛋白质的存在下（右面板），B：确认纯度排序通过定量荧光蛋白质印迹。一个强有力的信号中检测到CD133 CD133 +分数，而一个非常薄弱的CD133表达，观察日ËCD133人口。
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Discussion
为了去除红细胞污染的肿瘤细胞沉淀，我们强烈建议您使用红细胞裂解液从美天旎。比传统的Ficoll密度梯度离心的红细胞裂解的优点是，它是更快，更简单。此外，利用Ficoll或红血细胞和肿瘤细胞的损失，避免污染。当你观察到的原代细胞培养成纤维细胞生长，应立即删除，因为它们通常生长肿瘤细胞时等待时间过长。
排序时细胞与美天旎MACS技术，我们建议收集细胞酶。使用手机刮刀的细胞，其表面的抗原决定簇可能是温和的，而且还会产生细胞碎片，非特异性结合的阻塞的MACS列和列。的Accutase优势比传统的胰蛋白酶/ EDTA治疗包括降低细胞的压力，执法机关丁改进的可行性和风险最小化的不定剂进入细胞培养。 Accutase制备不包含任何哺乳动物的或重组的细菌蛋白质的28。
为了防止在细胞表面上的抗体和非特异性细胞标记1的封盖应该工作速度快，保持细胞冷和使用预冷却解决方案。所有孵化的步骤应该在2-8°C，但不能在冰可能会增加，因为较低的温度下孵化的时间。必须确定每一个新的细胞培养理想的细胞数列。在我们的实验室中，我们的工作与黑色素瘤细胞株，最大4倍10 7个细胞的细胞数可应用于每LS列。 MS列没有在所有的工作，这种细胞类型。对于非常大的细胞，Miltenyi公司还提供了大细胞列，而应使用。
推荐的Miltenyi公司的MACS缓冲器包含2 mM EDTA和0.5％BSA的PBS。如果减少通过bility观察磁性分选后的细胞，这可能是由于给BSA和/或在缓冲器中的EDTA。可以替换为5％FCS的，这通常是更好的耐受性比BSA改善细胞活力的BSA。 EDTA的中的MACS缓冲区可以被省略，以增加细胞的生存能力，但会降低2-3％分拣纯度。
MACS缓冲液平衡的列应该被丢弃。这是不建议收集细胞，在这个平衡的解决方案，因为它可以对细胞造成损害。相反，排序条件必须被收集在细胞培养基供给的管，以稳定的细胞后直接排序。
为了避免堵塞的列，重要的是要获得一个单细胞悬浮液通过细胞通过30微米尼龙筛（=预分离的过滤器），磁性分选之前。为了提高纯度的负面部分，第二次运行到一个新的，平衡的LS列，甚至LD柱（=细胞耗竭）建议。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
该的作者感谢的M. Dietel教授和德克·舒马赫为支持这项工作，并批判性阅读的手稿。
导致这些结果的研究创新药物倡议联合承诺根据赠款协议Ñ°115234，资源的财政贡献，这是由欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）和EFPIA公司中所获得的支持实物捐助。也支持这项工作的：柏林Krebsgesellschaft（BKG）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
| Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
| anti-fibroblasts microbeads | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
| CD133/1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
| DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
| D-PBS without Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
| FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
| Indirect CD133 Micro-Bead Kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
| Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
| Equipment | |||
| Cell strainer (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
| MACS Separator Multi Stand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS Seperation Columns 25 LS Columns | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
| Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) | Carl Roth GmbH Co. KG | P668.1 | |
| Steritop-GP Filter Unit 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE | |
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