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Medicine

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133 doi: 10.3791/50200 Published: March 13, 2013

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von frisch gewonnenen Melanomgewebe in primären Zellkulturen und wie Kontaminationen von Erythrozyten und Fibroblasten von den Tumorzellen zu entfernen. Schließlich beschreiben wir, wie CD133

Abstract

Trotz verbesserter Behandlungen Optionen für Melanome heute verfügbar ist, Patienten mit fortgeschrittenen malignen Melanom noch eine schlechte Prognose für das progressionsfreie Überleben und das Gesamtüberleben. Daher muss der translationalen Forschung weiter molekulare Beweise für gezielte Therapien für maligne Melanome zu verbessern. In der Vergangenheit haben onkogenen Mechanismen im Zusammenhang mit Melanom wurden ausgiebig in etablierten Zelllinien untersucht. Auf dem Weg zur personalisierten Behandlungsschemata auf individuelle genetische Profile basieren, schlagen wir vor, Patienten-Zelllinien anstelle von generischen Zelllinien zu verwenden. Zusammen mit hochwertigen klinischen Daten, vor allem auf Patienten-Follow-up, werden diese Zellen maßgeblich zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, die hinter Melanom Progression.

Hier berichten wir über die Einrichtung von primären Melanomen Kulturen aus seziert frischem Tumorgewebe. Dieses Verfahren beinhaltet Zerkleinerns und Dissoziation des Gewebes in einzelne Zellen, refernung von Verunreinigungen mit Erythrozyten und Fibroblasten sowie primäre Kultur und zuverlässige Überprüfung der Zellen Melanom Herkunft.

Jüngste Berichte zeigten, dass Melanome, wie die Mehrzahl der Tumoren, Hafen eine kleine Subpopulation von Krebsstammzellen (CSCs), die ausschließlich Kraftstoff Tumorinitiation und Progression in Richtung der metastatischen Stadium sein. Einer der wichtigsten Marker für CSC Identifizierung und Isolierung in Melanom ist CD133. Um CD133 + CSCs aus primären Melanom Kulturen zu isolieren, haben wir modifiziert und optimiert die Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) Verfahren von Miltenyi was zu hohen Sortenreinheit und Lebensfähigkeit der CD133 + CSCs und CD133 - bulk, die angebaut werden können und funktionell analysiert danach.

Introduction

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Kutane maligne Melanome sind die am wenigsten verbreitet, doch die meisten tödlichen Form von Hautkrebs. Aufgrund der steigenden Inzidenz, ein hoher Grad der Bösartigkeit und einer raschen Verbreitung, Melanome machen inzwischen 75% der malignen Hauttumoren Todesfälle 1,2. Neben chirurgischen Exzision des Primärtumors, Chemotherapie, Strahlentherapie, Immuntherapie und kombinierte Chemo-und Immuntherapie des metastasierten Melanoms sind die state-of-the-art Strategien für Melanom Behandlung 3,4. Allerdings ist das maligne Melanom durch eine schlechte Reaktion auf Chemotherapeutika (5-12%) 5,6, und nur diejenigen, 50-70% der Melanom-Patienten mit der BRAF V600E Genmutation profitieren von vielversprechenden neuen zielgerichteten Therapien wie die Behandlung mit vemurafenib 7 Um gekennzeichnet Verbesserung der allgemeinen Überlebensrate, wird ein viel besseres Verständnis der Mechanismen der Melanom Tumorgenese benötigt.

Um diese Mechanismen in der Vergangenheit gut etablierte kommerzielle studierenallem zur Verfügung stehenden Zelllinien verwendet wurden. Neuere Ansätze, um die molekularen Ereignisse von Krebs Initiation und Progression zu studieren nutzen primären Kulturen direkt aus Tumorgewebe - eine Strategie Lager vielfältigen Vorteile: Der Forscher hat die volle Kontrolle des Patienten und Gewebe Auswahl. Die Zellproben gewonnenen fachmännisch ausgewählt Tumorgewebe, ähneln den Tumor mit all ihrer Heterogenität und Follow-up-Daten des Patienten und eine detaillierte Pathologie ist verfügbar, um die Charakteristiken der Kultur mit denen des ursprünglichen Tumors 8 verglichen werden.

Im Gegensatz dazu ist die Verwendung von etablierten Zelllinien als relevant Modellsystemen in der Krebsforschung kontrovers diskutiert. Bereits 1987 Osborne und Kollegen beschrieben signifikante biologische Unterschiede zwischen humanen MCF-7 Brustkrebs-Zelllinien aus verschiedenen Laboratorien 9. Diese umfassende genomische Instabilität und Variation in RNA Expression während der Subkultur war Confirmed durch Hiorns et al. und sofern unterstützenden Daten nach Beweisen, dass Zelllinien nicht in Kultur zu entwickeln und damit eine Schwächung der direkten Relevanz solcher etablierten Kulturen als Modelle von Krebs beim Menschen 10.

Ein weiterer wichtiger Aspekt, der weitgehend über die Jahre ignoriert wurde, ist das Risiko einer Kontamination oder übermäßiges Wachstum von Kulturen mit fremden 'false' Zellen, die erste hervorgehoben wurde vor über zwanzig Jahren durch den Nachweis, dass eine große Anzahl von Zelllinien durch HeLa kontaminiert waren Zellen 8,11. Die Fehlinterpretation von Daten aus 'false' Zelllinien hat vor kurzem gekommen, um in der Literatur wieder anzuzünden. Mit einer Kombination von DNA-Profiling und molekularen Zytogenetik zeigte MacLeod et al., Dass von 252 neuen Tumor-abgeleiteten humanen Zelllinien hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), fast 18% wurden Intraspezies sein oder Interspezies Kreuz -Verunreinigungen 12,13.

Um diese Probleme zu vermeiden und die Nutzung der oben genannten Vorteile zu machen, haben wir beschlossen, low-Passage Melanom-Zelllinien aus frisch herausgeschnitten Metastasen zu etablieren.

Robust Zelle Trennung und Analyse Technologien erfordern Single-Cell-Präparate erzeugt gleichzeitig begrenzen Zelltod und die Zerstörung der charakteristischen Oberflächenproteine ​​werden. Ein Tischgerät für die automatisierte Dissoziation von Gewebe in den Single-Zellsuspensionen ist die gentleMACS Dissoziator von Miltenyi hergestellt. Wenn in Kombination mit gentleMACS C Rohre und optimierte Dissoziation Lösungen, eine effektive und schonende Spaltung von Tumorgewebe in einem geschlossenen System verwendet wird erzielt unter Beibehaltung Antigenepitope und Reduzieren Zellverlust. Das Gerät bietet optimiert voreingestellten Programmen für eine Vielzahl spezifischer Anwendungen und garantiert standardisierte Herstellung von Einzelzell-Suspensionen, die aus Melanom Gewebe 14.

<p class = "jove_content"> Jüngste Berichte ergab, dass die Mehrzahl der Tumoren eine kleine Subpopulation von sogenannten Krebsstammzellen (CSCs), die ausschließlich weisen Tumor-Initiierung und sich selbst erneuernde Fähigkeit beherbergen. Die Identifizierung von Melanozyten-produzierenden Stammzellen in der Dermis der Haut führte zu der Hypothese, dass diese Zellen könnte die Entstehung von Krebs-Stammzellen (CSCs) in Melanomen, da UVA-Bestrahlung können diese Zellen für maligne Transformation 15 grundieren. Das Ergebnis eines solchen genetischen Läsion würden Zellen, die eine Kombination von Tumor und Stammzelleigenschaften beherbergen sein.

Einer der wichtigsten Marker vorgeschlagen, die Subpopulation von CSCs in Melanomen darstellen, ist CD133 16-20. CD133 (auch als Prominin 1 bekannt), ein Mitglied der pentaspan transmembranen Glykoproteinen, wird in hämatopoetischen Stammzellen, Endothelprogenitorzellen, neuronale und gliale Stammzellen 21-23 exprimiert. Expression von CD133 mit korreliertenasymmetrischen Zellteilung 24 und das glykosylierte Epitop von CD133 konnte gezeigt werden herunterreguliert auf Zelldifferenzierung 25. Kürzlich wurden CD133 + Melanomzellen gezeigt, Selbsterneuerung und Tumor-Initiation Kapazität 19,20 zu haben.

Um die Funktion von CD133 + putative Melanom CSCs zu studieren, haben wir modifiziert und optimiert die Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS)-System von Miltenyi Biotech, hoch angereichert und lebensfähige Populationen von CD133 + und CD133 zu erhalten - Zellen.

Magnetkügelchen-basierten Zellabtrennung erlaubt entweder negative Selektion von Matheu et al. 26 oder positiver Selektion, wie wir hier zeigen. Während positiver Selektion die bestimmte Zielzelle Typ, zB CD133-exprimierenden Zellen, wird magnetisch mit MicroBeads, 50-nm-Partikel, superparamagnetische konjugiert hochspezifische Antikörper gegen ein markiert sindInsbesondere Zelloberflächenantigen. Während der Trennung werden die magnetisch markierten Zellen in der Säule in das Magnetfeld des Separators zurückgehalten, während unmarkierte Zellen durchfließen. Nach Waschschritten wird die Säule aus dem Magnetfeld des Separators entfernt wird, und die Zielzellen von der Säule eluiert. Die LS oder MS Spalten während positive Selektion Ergebnis in Bruchteilen von markierten und nicht markierten Zellen mit hoher Reinheit verwendet. Auf der anderen Seite, LD Spalten zur negativen Selektion verwendet wird, führen zu einer etwas geringeren Reinheit des markierten Fraktion. Aufgrund der dichteren Packung ihre Matrix die Strömungsgeschwindigkeit in diesen Spalten niedriger ist, was zu einem höheren Risiko von unmarkierten Zellen in der Säule eingefangen werden. LD Spalten sollten daher nur für strenge Depletion von einer unerwünschten Zell-Subpopulation verwendet werden. Positive Selektion kann durch direkte (Antikörper gekoppelt MicroBeads) oder indirekten magnetischen Kennzeichnung (Inkubation mit MicroBeads werden nach dem incubatio durchgeführtn mit den primären Antikörper). Spezifisch MACS MicroBeads sind für die positive Selektion von zahlreichen Zelltypen von primären Tumorzellen wie Prostata oder Melanom 27 verfügbar.

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Protocol

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Das Gesamtkonzept des Versuchs einschließlich der Herstellung von primären Zellen aus Single-Tumorgewebe Charakterisierung des primären Zellkultur, Fibroblasten-Depletion und magnetische Zellsortierung von CD133 und CD133 + - Melanomzellen ist in Abbildung 1 gezeigt.

Ein. Beispiel Acquisition

  1. Überprüfen ethischen Zulassung vor der Prüfung die nächsten Schritte.
  2. Bereiten Sie eine 50-ml-Tube mit sterilem PBS mit 1% Penicillin-Streptomycin Endkonzentration und Übergabe der Operation OP-Team ergänzt.
  3. Organisieren schnellen Transport von Tumorgewebe von Operation Zellkulturlabor bei 4 ° C.

2. Herstellung von primären Melanom Single-Zellen aus Tumorgewebe

  1. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen.
  2. Vor Resektion des Tumors, muss man die Dissoziation zuzubereiten. 10 ml Dissoziation Mix pro 2-4 g Gewebe erforderlich ist. Die Mischung kann Immedia verwendet werdenTely oder in 10 ml-Aliquots bei -20 ° C für die spätere Verwendung gespeichert.
    1. Vorbereiten einer Lösung enthaltend 150 mM Natriumchlorid. Mix mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. Bei Bedarf steril Filtrat Natriumchlorid-Lösung mit einer 0,22 um-Filter.
    2. Abzuwiegen DNase I und Herstellung einer Lösung, die 10 mg / ml DNase I in 150 mM Natriumchlorid. Mix durch Invertieren, bis die Lösung klar ist.
    3. Bereiten Sie eine Lösung mit 100mg/ml Collagenase IV in PBS. Mix durch Invertieren, bis die Lösung klar ist. Aliquots von Kollagenase-Lösung kann bei -20 ° C für mehrere Monate gelagert werden.
    4. Bereiten Sie die Dissoziation Mischung mit einer Endkonzentration von 1% Penicillin-Streptomycin, 1 mg / ml Kollagenase IV und 0,1 mg / ml DNase I in Quantum 263 Medium. Mix mit einem Vortex. Optional: bei Verwendung von der Haut Melanomgewebe merken Amphotericin B-Lösung zur Dissoziation Mischung abgeleitet zu einer Endkonzentration von 1,5 ug / ml Amphotericin B.
  3. Pre-warm die required Mengen Dissoziation Mischung, PBS und Quantum 263 mittel bis 37 ° C.
  4. Ort Tumorgewebe auf einer sterilen Petrischale. Absaugen übermäßige Lösung aus dem Gewebe und 500 ul Dissoziation Mix. Mince Tumor in kleine Stücke von 2-4 mm mit frischen, sterilen Skalpellen.
  5. Transfer 2-4 g Hackfleisch Tumorgewebe in einem gentleMACS C Tube mit 5 ml Dissoziation Mix. Spülen Petrischale mit zusätzlichen 4,5 ml Dissoziation Mix und fügen übrigen Gewebefragmente der gentleMACS C Tube.
  6. Schließen gentleMACS C Rohr und befestigen Sie sie kopfüber auf der Hülse des gentleMACS Dissoziator. Führen Sie das gentleMACS Programm "h_tumor_01".
  7. Nehmen Sie den gentleMACS C Rohr aus dem Dissoziator und inkubieren Sie die Probe für 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation mit dem MACSmix Tube Rotator auf dem höchsten Laufgeschwindigkeit (12 rpm) oder durch Drehen des Rohres manuell alle 5 min ständiger Gewebefragmente resuspendieren .
  8. Bringen gentleMACS C Rohr kopfüber auf dem Ärmel ter gentleMACS Dissoziator und führen Sie das gentleMACS Programm "h_tumor_02".
  9. Nehmen Sie den gentleMACS C Rohr aus dem Dissoziator und inkubieren Sie die Probe für 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation mit dem MACSmix Tube Rotator auf dem höchsten Laufgeschwindigkeit (12 rpm) oder durch Drehen des Rohres manuell alle 5 min ständiger Gewebefragmente resuspendieren .
  10. Bringen gentleMACS C Rohr kopfüber auf der Hülse des gentleMACS Dissoziator und führen Sie das gentleMACS Programm "h_tumor_03".
  11. Nehmen Sie den gentleMACS C Rohr aus dem Dissoziator, resuspendieren Probe und gelten die Zellsuspension auf eine 70 um Zellsieb auf einem 50 ml Röhrchen gegeben. Wenn ein Verstopfen des Filters auftritt, rühren Zellsuspension mit einem Sterilfilter Spitze bis zur vollständigen Suspension durchlief.
  12. Spülen Zellsieb mit 5 ml Quantum 263 Medium.
  13. Optional: wenn Sie noch Gewebestücke in den Filter, resuspendieren Fragmente in Quantum 263 mittel-und Saatgut in einer geeigneten Zellkultur dis linksh. Inkubieren Fragmente bei 37 ° C und 5% CO 2.
  14. Entsorgen Zellsieb und schließen Sie die 50 ml Tube mit der verdauten Zellsuspension. Zentrifuge Zellsuspension für 5 min bei 300 xg und Überstand verwerfen.
  15. Optional: Wenn Zellpellet erscheint rot aufgrund einer hohen Menge an Erythrozyten vorzubereiten 1x Red Blood Cell Lysis Solution durch Verdünnen 10x Lösung 1:10 in doppelt destilliertem Wasser, Zellpellet in 500 ul PBS und 5 ml 1x Red Blood Cell Lysis Solution. Vortex 5 sec und Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. Zentrifuge für 5 min bei 300 xg und Überstand verwerfen.
  16. Resuspendieren Tumorzellen mit Quantum 263 und Saatgut die Zellen in geeigneten Zellkultur-Flasche. Kultur Tumorzellen bei 37 ° C und 5% CO 2 und routinemäßig Durchgang Zellen, wenn sie 80% Konfluenz erreichen.

3. Charakterisierung von primären Zellkultur und Fibroblast Depletion

  1. Analysieren primäre Zellkultur phänotypisch mit einem mikroskopischenpe.
  2. Ernten eine geringe Menge (0,5 x 10 6 Zellen) des primären Zellkultur und führen RT-PCR mit Primern für neoplastische-, Melanom-, Stammzell-und Stromazelle Markergene. Die wichtigsten Gene zu analysieren sind CD90 (Fibroblasten Marker), TYR (Melanom / Melanozyten Marker), CD133 (Krebsstammzellen Marker), CD83 (Marker für reife dendritische Zellen) und ein Housekeeping-Gen (zB HPRT oder GAPDH).
  3. Wenn mikroskopische Analyse und hohe Expression von CD90 während der RT-PCR ergab eine hohe Kontamination des primären Melanomen Kultur mit Fibroblasten, müssen Sie Fibroblasten mit den Anti-Fibroblasten MicroBeads und D Säulen von Miltenyi erschöpfen.

4. Magnetic Cell Sorting von CD133 + und CD133 - Melanomzellen mit LS Columns

  1. Planen MACS-Puffer, enthaltend 2 mM EDTA und 5% FCS in PBS. Mix durch Invertieren und steril Filtrat Puffer unter Verwendung eines 0,22 um Steritop-GP Filter Unit. Chill Puffer auf 4-8 ° Cund entgasen vor dem Gebrauch.
  2. Pre-warm Accutase, PBS und Quantum 263 mittel-bis 37 ° C.
  3. Waschen 80% konfluenten Zellen mit PBS. Fügen Sie entsprechende Menge Accutase und inkubieren, bis die Zellen aus der Kultur Oberfläche lösen. Collect Zellen in einem 50 ml-Röhrchen mit 263 Quantum Medium.
  4. Ermitteln der Zellzahl und zentrifugieren die erforderliche Anzahl von Zellen (Laut Miltenyi dem Protokoll eine maximale Anzahl von 2x 10 9 Zellen pro LS Spalte geladen werden kann. Zelllinie spezifische optimalen Zahlen bestimmt werden sollte, und kann wesentlich geringer sein.) Für 5 min bei 300 xg und 4-8 ° C. Absaugen Überstand vollständig.
  5. Resuspendieren maximal 1x 10 8 Zellen mit 350 ul MACS-Puffer (für höhere Zellzahlen bis zu skalieren alle folgenden MACS-Puffer, FcR Blockierungsreagenz, CD133/1-Biotin und Anti-Biotin MicroBeads Volumina entsprechend).
  6. Fügen Sie 100 ul FcR Blockierungsreagenz.
  7. Fügen Sie 50 ul CD133/1-Biotin. Mix gut mit einem Vortex und inkubieren bei 4-8 ° C foder 10 min.
  8. Waschen der Zellen durch Zugabe von 10 ml MACS-Puffer und Zentrifugieren für 5 min bei 300 xg und 4-8 ° C. Absaugen Überstand vollständig.
  9. Wiederholen Waschschritt (4,8)
  10. Zellpellet mit 400 ul MACS-Puffer.
  11. Fügen Sie 100 ul Anti-Biotin-Mikrokugeln. Mix gut mit einem Vortex und inkubieren bei 4-8 ° C für 15 min.
  12. Unterdessen bereiten die MACS Separator für die magnetische Separation. Bringen QuadroMACS um MACS Separator Multi Stand. Legen die erforderliche Anzahl von Spalten mit den LS Spalte Flügel nach vorne in dem magnetischen Feld des QuadroMACS. Legen Sie eine Pre-Separation Filter (mit 30 um Nylon-Mesh) in jedes LS Säule und einer entsprechenden Sammelstelle Rohr (15 ml oder 50 ml) unter jeder Spalte. Planen Filter und Spalte durch Spülen mit 3 ml MACS-Puffer. Durchfluss verwerfen.
  13. Waschen der Zellen durch Zugabe von 10 ml MACS-Puffer und Zentrifugieren für 5 min bei 300 xg und 4-8 ° C. Absaugen Überstand vollständig.
  14. Die Zellen mit 500 ulMACS-Puffer und gelten Zellsuspension auf die LS Spalte mit dem Pre-Separation Filter.
  15. Waschen dreimal mit 3 ml MACS-Puffer pro Spalte. Nur neue Puffer, wenn die Spalte leer ist.
  16. Die gesammelten Gesamtabwassers enthält die unmarkierte CD133 - Zellfraktion.
  17. Entsorgen Sie die Pre-Separation Filter entfernen Spalte aus dem Separator und legen Sie sie auf einer geeigneten Sammelstelle Rohr.
  18. Bewerben 5 ml MACS-Puffer. Unmittelbar spülen die markierten CD133 + Zellen, die durch fest drückt den Kolben in die Spalte.
  19. Um die Reinheit des negativen Fraktion zu erhöhen, wird Zellsuspension auf eine neue äquilibriert LS Spalte in der QuadroMACS eingefügt. Der Abstrom enthält die CD133 - Fraktion.
  20. Entsorgen Sie Spalten.

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Representative Results

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Herstellung von ein-Zellen aus Tumorgewebe

Abbildung 2 zeigt beispielhaft ein resezierten Lymphknotenmetastasen von einem späten Stadium Melanom Patienten vor (A) und nach (B) mechanische Dissoziation in 2-4 mm große Stücke. Nach enzymatischer Spaltung des Gewebes und Filtration durch ein 70 um Nylonnetz wurden die Zellen pelletiert und der Überstand verworfen. Bei diesem Schritt beobachteten wir eine hohe Kontamination mit Erythrozyten als durch die rötliche Farbe des Zellpellets in 2C angegeben. Anschließend abgereichert wir die roten Blutkörperchen, die in einer Zelle Pellet von hellbrauner Farbe (2D) resultierte. Diese Zellen wurden resuspendiert und kultiviert mit Quantum 263-Medium bei 37 ° C und 5% CO 2.

Charakterisierung von primären Zellkulturen

Um zu überprüfen, ob die Zellen vom Tumor stammen und nicht aus den umliegenden Stroma, führten wir RT-PCRder melanocyte/melanoma-, Fibroblasten-, dendritische-und Stammzell-Marker-Gene. Erwachsenen Melanozyten normal Kontrollzellen für TYR und der embryonalen Karzinom-Zelllinie NCCIT als positive Kontrolle für die Stammzellmarker CD133 serviert. PCR-Ergebnisse, wie in Abbildung 3 dargestellt, ergab, dass einige primäre Zellen sind in der Tat von melanozytären Ursprung (positiv für TYR) und sind für die Markierung von reifen dendritischen Zellen (CD83) negativ. Darüber hinaus wurden Melanom-Zelllinien zur Expression von CD133, ein Gen von entscheidender Bedeutung für die asymmetrische Zellteilung und eine bekannte Krebs Stammzellmarker gefunden. HPRT als Ladekontrolle verwendet wurde.

Zunächst wird die primäre Zellkultur enthielt auch eine hohe Kontamination mit Fibroblasten durch die hohe Expression von CD90 (Abbildung 3 links, oben) angegeben.

Nach Fibroblasten Erschöpfung, enthielt diese Zellkultur nur TYR + Melanomzellens und nicht mehr Fibroblasten (CD90 -) (Abbildung 3 links, unten). Die Abwesenheit von Fibroblasten konnte durch Hellfeldmikroskopie bestätigt werden, wie in Abbildung 4 dargestellt.

Magnetische Zellsortierung der CD133 + und CD133 - Melanomzellen

Zellen - primäres Melanom-Zellen, die CD133 Expression zeigen, wie durch RT-PCR gezeigt können in CD133 und CD133 + sortiert werden. Mit dem modifizierten Protokoll von der Indirekt CD133 Nichtmetallisches Kit, ein hochreines (> 99,75%) und die Ausbeute von CD133 und CD133 +-Fraktionen, sowie eine hohe Lebensfähigkeit der beiden Fraktionen nach dem Sortieren erzielt wird. Sortierung Wirksamkeit und Reinheit sollte immer von Immunfluoreszenz-Färbung oder Western-Blot-Analyse überprüft werden, wie in Abbildung 5A und B gezeigt.

Abbildung 1 Abbildung 1. Gesamtschema des Experiments. Primäre Melanomzellen Kultur und Isolierung von CD133 + putativen Krebsstammzellen umfasst die Resektion eines Tumors durch mechanische und enzymatische Dissoziation der Tumorzellen mit einer Dissoziation Mischung mit DNase I und IV und der Collagenase gentleMACS Dissoziator gefolgt. Wenn die Tumorzellen hoch mit roten Blutkörperchen kontaminiert sind, wird eine Erythrozyten Abreicherungsschritt empfohlen. Kultivierten primären Zellen müssen dann durch mikroskopische und RT-PCR-Analyse charakterisiert werden, um zu bestätigen, ob sie Melanomzellen sind. Ein hoher Kontamination mit Fibroblasten durch die Expression von CD90 angegeben kann durch Fibroblasten Depletion mit Miltenyi Anti-Fibroblasten Mikroperlen entfernt werden. Schließlich kann CD133 + und CD133-Melanomzellen fraktioniert werden nach der indirekten CD133 Micro-Bead Kit Menschen von Miltenyi. Nach der Sortierung wird Reinheit bestätigt und die CD133 + eind CD133-Melanom-Fraktionen nebeneinander analysiert werden.

Abbildung 2
Abbildung 2. Herstellung von ein-Zellen von Tumorgewebe. A:. Muster eines resezierten Melanom Metastasen vor der Trennung in einzelne Zellen B: Melanom Metastasen nach mechanischer Dissoziation des Tumorgewebes in 2-4 mm große Stücke mit zwei sterilen Skalpellen C:. Pellet von einzelnen Zellen stark mit roten Blutkörperchen D kontaminiert. : Pellet von Einzelzellen nach Erythrozyten Erschöpfung.

Abbildung 3
Abbildung 3. Expression Analyse von primären Zellkulturen. RT-PCR-Analyse von Genen im Zusammenhang mit Melanin-Produktion (TYR), Fibroblasten-Marker (CD90), dendritischen Zellen Marker ( CD83) und Gene von entscheidender Bedeutung für die asymmetrische Zellteilung (CD133) zeigten, dass zunächst die primäre Zellkultur CD133 enthalten + Melanomzellen (TYR +) und keine dendritischen Zellen (CD83-), wurde aber stark mit Fibroblasten (CD90 +) (linke, obere Panel verschmutzt) . Nach Fibroblasten Verarmung diese Zellkultur enthielt nur TYR + und CD90-Melanomzellen (links, unten). HPRT wurde als Ladekontrolle verwendet. NCCIT und erwachsenen Melanozyten als Positivkontrolle für CD133 und TYR serviert sind.

Abbildung 4
Abbildung 4. Mikroaufnahmen von primären Zellkulturen vor und nach Depletion Fibroblasten. A: Hellfeld Aufnahme einer primären Zellkultur mit Fibroblasten hochgradig kontaminiert B:. Hellfeld Gefügeaufnahme der gleichen primären Melanom Zellkultur nach Fibroblasten Abreicherung.

e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Abbildung 5
Abbildung 5. Überprüfung der MACS über Immunfluoreszenzfärbung und Western Blot. A: Immunfluoreszenz-Aufnahmen von Melanomzellen 24 Stunden nach der Sortierung mit der indirekten CD133 Nichtmetallisches Kit von Miltenyi. Zellen wurden auf Deckgläser ausgesät und gefärbt mit CD133 / 1 (W6B3C1) Antikörper durch Inkubation mit Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper gefolgt. Nur in der CD133 +-Fraktion ein spezifisches Signal an die Zellmembran beobachtet, wie durch weiße Pfeile (linkes Feld). CD133-Zellen nicht auf die Anwesenheit des Proteins (rechte Tafel) Fleck B:. Bestätigung der Sortenreinheit durch quantitative fluoreszierenden Westernblotting. Ein starkes Signal wurde CD133 in der CD133 +-Fraktion nachgewiesen werden, während eine sehr schwache Expression in CD133 th beobachtet wurdee CD133-Bevölkerung.

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Discussion

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Um Kontaminationen Erythrozyten aus dem Tumor Zellpellet entfernen empfehlen wir unter Verwendung des roten Blutkörperchens Lyselösung von Miltenyi. Die Vorteile Lysieren der Erythrozyten gegenüber dem traditionellen Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation sind, dass sie schneller und einfacher ist. Weiterhin werden Verunreinigungen mit Ficoll oder roten Blutkörperchen und dem Verlust von Tumorzellen vermieden. Wenn Sie das Wachstum von Fibroblasten in der primären Zellkultur beobachten sie sollten sofort entfernt werden, da sie überwuchern normalerweise die Tumorzellen, wenn man zu lange wartet.

Beim Sortieren von Zellen mit Miltenyi der MACS-Technik empfehlen wir Ernten der Zellen enzymatisch. Mit einem Zellschaber könnte schonender für die Zellen und ihre Oberfläche Epitope, sondern auch zu produzieren Zellfragmente, die unspezifisch an die MACS Säulen und verstopfen die Spalten. Die Vorteile der Accutase gegenüber der traditionellen Trypsin / EDTA-Behandlung gehören reduzierte Zelle Stress, leading verbessert Rentabilität und minimiert Risiko der Einschleppung von Fremdstoffen in den Zellkulturen. Die Herstellung Accutase enthält keine Säugetier-oder rekombinanten bakteriellen Proteine ​​28.

Um Deckelung der Antikörper auf der Zelloberfläche und unspezifische Markierung von Zellen ein zu verhindern, sollte schnell arbeiten, halten Zellen kalten und verwenden vorgekühlten Lösungen. Alle Inkubationen bei 2-8 ° C, aber nicht auf Eis durchgeführt werden, da niedrigere Temperaturen Inkubationszeiten erhöhen kann. Die ideale Zellzahl pro Spalte muss für jede neue Zellkultur bestimmt werden. In unserem Labor arbeiteten wir mit Melanom-Zelllinien, wo eine maximale Zellzahl von 4x 10 7 Zellen pro LS-Säule aufgetragen werden konnte. MS-Säulen überhaupt nicht arbeiten, für diesen Zelltyp. Für sehr große Zellen Miltenyi auch Großzellig Säulen, die alternativ verwendet werden sollte.

Die MACS-Puffer durch Miltenyi empfohlen enthält 2 mM EDTA und 0,5% BSA in PBS. Wenn eine verringerte viakeit der Zellen nach magnetischen Sortierung beobachtet wird, könnte dies darauf zurückzuführen sein, BSA und / oder EDTA im Puffer. Um die Lebensfähigkeit der Zellen BSA verbessern können um 5% FCS, die häufig besser als BSA toleriert ersetzt werden. EDTA in der MACS-Puffer weggelassen werden, um der Zelle die Lebensfähigkeit zu erhöhen, aber das Sortenreinheit um 2-3% verringern.

MACS-Puffer verwendet, um die Spalten ausgleichen sollte verworfen werden. Es wird nicht empfohlen, um die sortierten Zellen in diesem Äquilibrierungslösung sammeln, da es die Zellen schädigen können. Stattdessen sollte sortierten Zellen in einem Rohr mit Kulturmedium zugeführt, um die Zellen direkt nach dem Sortieren zu stabilisieren gesammelt werden.

Zur Vermeidung von Verstopfung der Säulen ist es wichtig, eine Einzelzell-Suspension vor magnetischen Sortierung erhalten, indem die Zellen durch eine 30 um Nylonsieb (= Vor-Separation-Filter). Um die Reinheit des negativen Fraktion, einen zweiten Durchlauf durch eine frische, äquilibriert LS Säule oder sogar erhöhen LD Spalte(= Zur Depletion von Zellen) wird vorgeschlagen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Prof. M. Dietel und Dirk Schumacher für die Unterstützung dieser Arbeit und die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Unterstützung der Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking unter Finanzhilfevereinbarung n ° 115234, Ressourcen, von denen die finanzielle Beteiligung Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (FP7/2007-2013) und EFPIA Unternehmen in zusammengesetzt sind erhalten Sacheinlage. Diese Arbeit wurde von der Berliner Krebsgesellschaft (BKG) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma
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Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).More

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

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