Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133 doi: 10.3791/50200 Published: March 13, 2013

Summary

מאמר זה מתאר את ההכנה של רקמה המתקבלת מלנומה טרי לתרבויות העיקריות של תאים, וכיצד להסיר זיהומים של אריתרוציטים ופיברובלסטים מתאי הגידול. לבסוף, אנו מתארים כיצד CD133

Abstract

למרות אפשרויות טיפולים משופרות עבור מלנומה זמין היום, חולים עם מלנומה ממאירה מתקדמת עדיין יש פרוגנוזה גרועה להישרדות ללא התקדמות וכוללת. לכן, מחקר translational צריך לספק ראיות מולקולריות נוסף כדי לשפר את הטיפולים ממוקדים עבור מלנומה ממאיר. במנגנונים האחרונים, שהעור הקשורים ללנומה נחקרו בהרחבה בשורות תאים ותיקות. בדרך למשטרי טיפול מותאמים אישית המבוססים על פרופיל גנטי אישי, אנו מציעים להשתמש בשורות תאי חולה המופקים במקום קווים סלולריים גנריות. יחד עם נתוני איכות גבוהות קליניים, במיוחד על מעקב מטופל, תאים אלה יהיו סייעו כדי להבין טובים יותר את המנגנונים המולקולריים מאחורי התקדמות מלנומה.

כאן, אנו מדווחים על הקמת תרבויות מלנומה ראשוניות מרקמת גידול טריה גזורה. הליך זה כולל ריסוק וניתוק של הרקמה לתאים בודדים, מחדשmoval של זיהומים עם אריתרוציטים ופיברובלסטים, כמו גם תרבות ראשונית ואימות אמינה ממוצא מלנומה של התאים.

הדיווחים האחרונים עולים כי מלנומה, כמו מרבית גידולים, נמל subpopulation קטן של תאי גזע סרטני (CSCS), אשר נראו באופן בלעדי לתדלוק ייזום והתקדמות גידול כלפי המדינה גרורתי. אחד הסמנים המרכזיים לזיהוי ובידוד CSC מלנומה הוא CD133. כדי לבודד CD133 + CSCS מתרבויות מלנומה העיקריות, יש לנו שונים ומותאם המיון מגנטי הופעל הסלולריים (MACS) הליך מMiltenyi כתוצאה טוהר מיון גבוה וכדאיות של CD133 + CSCS וCD133 - בתפזורת, שיכול להיות מתורבת ותפקודי נותח לאחר מכן.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מלנומה ממאיר עורית הם הסוג הפחות שכיח, אך קטלני ביותר של סרטן העור. בשל שכיחות גוברת, ציון גבוה של ממאירות והפצה מהירה, מלנומה כעת חשבון עבור 75% מגידולי עור ממאירים הקשורים 1,2 מקרי מוות. מלבד כריתה כירורגית של גידול הראשוני, כימותרפיה, הקרנות, כימותרפיה ואימונותרפיה והטיפול החיסוני המשולב של מלנומה עם גרורות הן אסטרטגיות מדינה-of-the-art לטיפול במלנומה 3,4. עם זאת, מלנומה ממאיר מאופיין בתגובה ירודה לchemotherapeutics (5-12%) 5,6, ורק אלה 50-70% מחולים מלנומה הנושאים את המוטציה בגן יתרון V600E BRAF ממבטיח טיפולים ממוקדים חדשים כטיפול עם 7 vemurafenib כדי לשפר את ההישרדות כוללת, הבנה טובה יותר של המנגנונים של tumorigenesis לנומה היא זקוקות.

ללמוד המנגנונים האלה בcommer העבר, המבוסס היטבשורות תאי cially זמינות היו בשימוש. גישות מאוחרות יותר כדי לחקור את האירועים המולקולריים של ייזום הסרטן וההתקדמות לנצל תרבויות עיקריות הנגזרות ישירות מרקמת גידול - יתרונות סעפת נושאי אסטרטגיה: החוקר יש שליטה מלאה של מטופל ובחירת רקמות. התאים שנדגמו נרכשו מרקמת גידול שנבחר במומחיות, דומה גידול עם כל ההטרוגניות שלה ומעקב נתונים של המטופל ופתולוגיות מפורטות זמינים כדי לאפשר את המאפיינים של התרבות שיש בהשוואה לאלו של גידול המקורי 8.

בניגוד לכך, השימוש בשורות תאים הוקמו כמערכות מודל רלוונטיות בחקר הסרטן נדון שנוי במחלוקת. כבר בשנת 1987 אוסבורן ועמיתים תארו הבדלים ביולוגיים משמעותיים בין קווי MCF-7 אדם תאי סרטן שד ממעבדות שונות 9. חוסר יציבות זו נרחבת גנומי ווריאציה בביטוי RNA במהלך תת היה שותףnfirmed ידי Hiorns et al. וספק נתונים תומכים לראיות ששורות תאים אל להתפתח בתרבות, ובכך להחליש את הרלוונטיות הישירות של תרבויות מבוססות כמו מודלים של הסרטן האנושי 10.

שיקול חשוב נוסף, אשר במידה רבה כבר התעלם במשך השנים, הוא הסיכון לזיהום או צמיחת יתר של תרבויות עם תאים שאינם קשורים 'שווא', שהיה מודגש ראשון מעל לפני עשרים שנה על ידי הוכחה כי מספר רב של שורות תאים היו מזוהם על ידי הלה תאים 8,11. הפירוש לא הנכון של נתונים משורות תאים "לא צודק" הגיע לאחרונה לאור בספרות שוב. באמצעות שילוב של פרופיל ה-DNA וציטוגנטיקה מולקולרית, מקלאוד et al. חשף כי מתוך 252 שורות תאים אנושיות חדשות המופקות מגידול הופקד באוסף הגרמני של מיקרואורגניזמים ותרביות תאים (DSMZ), כמעט 18% נמצאו intraspecies או interspecies צלב מזהמים-12,13.

כדי להימנע מבעיות אלה ולעשות שימוש ביתרונות שהוזכרו לעיל, החלטנו להקים שורות תאים מלנומה, מעבר נמוך מגרורות כרותות טרי.

טכנולוגיות הפרדה וניתוח סלולריים חזקות דורשות הכנות תא בודד שנוצרו תוך הגבלת מוות של תאים והרס של חלבוני שטח אופייניים. מכשיר benchtop לניתוק האוטומטי של רקמות להשעיות תא בודד הוא Dissociator gentleMACS מיוצר על ידי Miltenyi. כאשר משתמשים בשילוב עם gentleMACS C צינורות ופתרונות אופטימיזציה דיסוציאציה, ניתוק יעיל ועדין של רקמת גידול במערכת סגורה מושגת תוך שמירת אפיטופים אנטיגן וצמצום אובדן תא. המכשיר מציע תוכניות מותאמות, שנקבעו מראש עבור מגוון רחב של יישומים וערבויות הכנה סטנדרטית של השעיות תא בודד מרקמות מלנומה 14 ספציפיים.

<כיתת p = "jove_content"> הדיווחים האחרונים עולים כי רוב גידולי נמל subpopulation קטן של תאי הגזע סרטני שנקראו (CSCS), אשר באופן בלעדי תערוכת ייזום-גידול עצמי וחידוש בקיבולת. זיהוי של תאי גזע מלנוציט לייצור בדרמיס של העור הוביל להשערה כי תאים אלה עשויים להיות המקור של תאי גזע סרטני (CSCS) מלנומה מאז חשיפה לקרינת UVA יכולה להכין תאים אלה לשינוי ממאיר 15. התוצאה של פגיעה גנטית שכזה תהיה תאים כי נמל שילוב של גידול ובמאפיינים של תאי גזע.

אחד מסמני המפתח שהוצעו לייצג את תת האוכלוסיות של CSCS במלנומה הוא CD133 16-20. CD133 (הידוע גם כ1 Prominin), חבר של גליקופרוטאינים הטרנסממברני pentaspan, מתבטא בתאי גזע, תאי hematopoietic אנדותל, תאי גזע עצביים וגליה 21-23. ביטוי של CD133 מתואם עםחלוקה סימטרית תא 24, וepitope המסוכר של CD133 הוצגה להיות downregulated על התמיינות תא 25. לאחרונה, CD133 + תאים מלנומה, הראו לי התחדשות עצמית ויכולת גידול ייזום 19,20.

כדי לחקור את תפקידו של CD133 + המשוער לנום CSCS, יש לנו שונים ומותאם למערכת המיון מגנטי הופעל הסלולרי (MACS) מMiltenyi יוטק להשיג אוכלוסיות מועשרות ובת הקיימא ביותר של CD133 + וCD133 - תאים.

הפרדת תא חרוז מבוסס מגנטית מאפשרת גם סלקציה שלילית כפי שמוצג על ידי Matheu et al. 26 או סלקציה חיובית כפי שאנו מציגים כאן. במהלך סלקציה חיובית סוג מסוים יעד התא, למשל CD133 תאים לבטא, מתויג מגנטי עם microbeads, חלקיקים פאראמגנטי 50-nm שמצומד לנוגדנים הספציפיים ביותר נגדאנטיגן תא שטח מסוים. במהלך הפרדה, התאים שהכותרת מגנטית נשמרים בתוך העמודה בשדה המגנטי של המפריד, ואילו תאים ללא תווית לזרום. בעקבות צעדי כביסה, העמודה תוסר מהשדה המגנטי של המפריד, ואת תאי יעד eluted מהעמודה. עמודות MS LS או שימוש במהלך בחירת תוצאה החיובית בשברים של תאים שכותרת וללא תווית עם טוהר גבוה. מצד השני, עמודות LD, המשמשות לסלקציה שלילית, מביא לטוהר מעט נמוך יותר של החלק המסומן. בשל צפוף אריזה של המטריצה ​​שלהם את קצב הזרימה בעמודות אלה הוא נמוכים וכתוצאה מכך בסיכון גבוה יותר של תאים ללא תווית כדי להיות לכוד בעמודה. עמודות LD לכן יש להשתמש רק לדלדול חמור של תת אוכלוסיות של תאים לא רצויות. סלקציה חיובית יכולה להתבצע על ידי תיוג מגנטי ישיר (נוגדן מצמיד microbeads) או עקיף (דגירה עם microbeads בעקבות incubation עם הנוגדן הראשוני). Microbeads מקים מסוים זמינים לסלקציה החיובית של תאים מסוגים רבים של תאים סרטניים ראשוניים כמו ערמונית או מלנומה 27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המערך הכולל של הניסוי כולל הכנת תאים בודדים עיקריים מרקמת גידול, אפיון של תרבות התא העיקרי, דלדול פיברובלסטים ומיון תא המגנטי של CD133 + ו CD133 - תאים מלנומה מוצג באיור 1.

1. רכישת מדגם

  1. בדקו לאישור אתי לפני שתשקול את הצעדים הבאים.
  2. הכן את צינור מ"ל 50 עם סטרילי PBS בתוספת 1% ריכוז פניצילין-סטרפטומיצין סופי ולמסור לניתוח או לצוות.
  3. ארגן את התחבורה מהירה של רקמת גידול מניתוח למעבדת תרבית תאים ב 4 ° C.

2. הכנת תאים יחידים מלנומה ראשוניים מרקמת גידול

  1. לבצע את כל השלבים תחת תנאים סטריליים.
  2. לפני resecting גידול, צריך להכין את תערובת דיסוציאציה. לערבב 10 מ"ל דיסוציאציה לרקמה 2-4 גרמו נדרש. התערובת יכולה לשמש immediately או מאוחסן ב10 aliquots מ"ל ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
    1. הכן תמיסה המכילה נתרן כלורי mM 150. מערבב בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. אם פתרון נחוץ עקר תסנין נתרן כלורי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
    2. תשקול את DNase ולהכין תמיסה המכילה 10 מיליליטר DNase אני בנתרן כלורי 150mm מ"ג /. מערבב על ידי היפוך עד הפתרון הוא ברור.
    3. הכן תמיסה המכילה 100mg/ml collagenase הרביעי ב PBS. מערבב על ידי היפוך עד הפתרון הוא ברור. Aliquots של פתרון collagenase ניתן לאחסן ב -20 ° C למשך מספר חודשים.
    4. הכן תערובת הניתוק עם ריכוז סופי של 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1 מ"ג / המ"ל collagenase IV ו 0.1 מ"ג / מיליליטר DNase אני במדיום 263 קוונטית. מערבב בעזרת מערבולת. אופציונלי: בעת שימוש ברקמה מלנומה נגזרת מפתרון עור תוספת Amphotericin B לתערובת דיסוציאציה לריכוז סופי של 1.5 מיקרוגרם / המ"ל Amphotericin B.
  3. טרום החם reqכמויות uired של דיסוציאציה תמהיל, PBS ובינוני 263 קוונטית עד 37 ° C.
  4. רקמת גידול מניח על צלחת פטרי סטרילית. לשאוב פתרון מוגזם מהרקמות ולהוסיף תערובת דיסוציאציה 500 μl. ברר בגידול לחתיכות קטנות של 2-4 מ"מ באמצעות אזמלים טריים, מעוקרים.
  5. העברת 2-4 גרם טחון רקמת גידול לתוך צינור gentleMACS C המכיל תערובת 5 מ"ל דיסוציאציה. יש לשטוף את צלחת פטרי עם תוספת 4.5 מ"ל דיסוציאציה לערבב ולהוסיף קטעי רקמה שנותר לTube C gentleMACS.
  6. סגור צינור C gentleMACS ולצרפה הפוכים על שרוול Dissociator gentleMACS. הפעל gentleMACS התכנית "h_tumor_01".
  7. ניתוק צינור C gentleMACS מdissociator ודגירת המדגם למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בסיבוב רציף באמצעות Rotator Tube MACSmix על מהירות ריצה הגבוהה ביותר (12 סל"ד) או על ידי סיבוב הצינור באופן ידני כל 5 דקות כדי resuspend שברי רקמות מסולקות .
  8. צרף צינור C gentleMACS הפוך על השרוול של tהוא gentleMACS Dissociator ולהפעיל gentleMACS התכנית "h_tumor_02".
  9. ניתוק צינור C gentleMACS מdissociator ודגירת המדגם למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בסיבוב רציף באמצעות Rotator Tube MACSmix על מהירות ריצה הגבוהה ביותר (12 סל"ד) או על ידי סיבוב הצינור באופן ידני כל 5 דקות כדי resuspend שברי רקמות מסולקות .
  10. צרף צינור C gentleMACS הפוך על שרוול Dissociator gentleMACS ולהפעיל gentleMACS התכנית "h_tumor_03".
  11. ניתוק צינור C gentleMACS מdissociator המדגם, resuspend ולהחיל השעית התא למסננת תא 70 מיקרומטר מונח על צינור מ"ל 50. אם סתימה של המסנן מתרחשת, מערבבי השעית תא עם פילטר סטרילי עד ההשעיה המוחלטת עברה.
  12. יש לשטוף את מסננת עם תא בינוני 5 מ"ל קוונטית 263.
  13. אופציונלי: אם עדיין יש לך שברי רקמות שנותרו שבברי הסינון, resuspend במדיום וזרעם בתא תרבות דיס המתאים קוונטית 263ח. דגירת ברים על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2.
  14. השלך מסננת תא ולסגור את צינור המ"ל 50 עם השעית התא המעוכל. צנטריפוגה השעית תא למשך 5 דקות ב 300 XG ולהשליך supernatant.
  15. אופציונלי: אם תא הגלולה נראית אדומה בשל כמות גבוהה של אריתרוציטים להכין פתרון 1x תא דם אדום תמוגה על ידי דילול 1:10 פתרון 10x במים מזוקקי פעמים, resuspend תא גלול ב 500 PBS μl ולהוסיף תמוגה 5 מ"ל 1x תא דם אדום פתרון. מערבולת 5 שניות ולדגור בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 XG ולהשליך supernatant.
  16. Resuspend תאים סרטניים עם Quantum 263 וזרע התאים בתרבית תאי בקבוקון מתאים. תאים סרטניים תרבות ב 37 ° C ו 5% CO 2 ובאופן שגרתי תאי מעבר כאשר הם מגיעים למפגש 80%.

3. אפיון של תרבות הראשונית של תא ודלדול פיברובלסטים

  1. נתח את תרבות תאים העיקרית phenotypically באמצעות microscope.
  2. למסוק כמות קטנה (0.5x 10 6 תאים) של תרבית התאים הראשונית ולבצע RT-PCR עם פריימרים ל- neoplastic, מלנומה,-גזע ותאי גני stroma סלולריים סמן. הגנים החשובים ביותר לניתוח הם CD90 (סמן פיברובלסטים), Tyr (מלנומה / סמן מלנוציט), CD133 (סמן של תאי גזע לסרטן), CD83 (סמן לתאים דנדריטים בשלים) וגן משק (למשל HPRT או GAPDH).
  3. אם ניתוח מיקרוסקופי וביטוי גבוה של CD90 במהלך RT-PCR התגלו זיהום גבוה של מלנומה הראשונית עם התרבות fibroblasts, אתה צריך לרוקן את fibroblasts באמצעות microbeads Anti-fibroblasts ועמודות D מMiltenyi.

4. מיון מגנטי סלולרי של CD133 + ו CD133 - תאים מלנומה בעמודות LS

  1. הכן את חיץ MACS מכיל 2 mM EDTA ו5% FCS ב PBS. מיקס ידי חיץ היפוך ועקר תסנין באמצעות יחידת 0.22 מיקרומטר Steritop-GP סינון. חיץ צינה כדי 4-8 מעלות צלזיוסודגה לפני השימוש.
  2. טרום חם Accutase, PBS ובינוני 263 קוונטית עד 37 ° C.
  3. שטוף תאי confluent 80% עם PBS. הוסף כמות מתאימה של Accutase ולדגור עד תאים להתנתק ממשטח התרבות. איסוף תאים בצינור 50 מ"ל באמצעות מדיום 263 קוונטית.
  4. לקבוע את מספר התא וחובצה את המספר הדרוש של תאים (על פי הפרוטוקול של Miltenyi מספר מרבי של 2x 10 9 תאים ניתן לטעון לטור LS. מספרים אופטימליים ספציפיים קו סלולרי צריכים להיות נחושים ויכולים להיות נמוכה באופן משמעותי.) למשך 5 דקות ב 300 XG ו4-8 ° C. לשאוב supernatant לחלוטין.
  5. Resuspend מקסימום של 1x 10 8 תאים עם חיץ MACS μl 350 (למספרים סלולריים גבוהים יותר בהיקף של עד כל חיץ MACS הבא, FCR מגיב חסימה, וCD133/1-Biotin microbeads אנטי ביוטין כרכים בהתאם).
  6. הוסף מגיב FCR חסימת μl 100.
  7. הוסף CD133/1-Biotin μl 50. מערבב היטב בעזרת מערבולת ולדגור על 4-8 מעלות צלזיוס ואו 10 דקות.
  8. שטוף תאים על ידי הוספת 10 חיץ וצנטריפוגה MACS מ"ל למשך 5 דקות ב 300 XG ו4-8 ° C. לשאוב supernatant לחלוטין.
  9. חזור על שלב כביסה (4.8)
  10. Resuspend תא גלול עם חיץ MACS μl 400.
  11. הוסף 100 microbeads μl אנטי ביוטין. מערבב היטב בעזרת מערבולת ולדגור על 4-8 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  12. בינתיים מכין את מפריד MACS להפרדה המגנטית. צרף QuadroMACS למעמד מולטי מפריד MACS. הכנס את המספר הנדרש של עמודות LS עם כנפי העמודה לחזית בשדה המגנטי של QuadroMACS. הנח סינון לפני פרידה (עם רשת ניילון מיקרומטר 30) לכל עמודת LS וצינור איסוף מתאים (15 מ"ל או 50 מ"ל) מתחת לכל עמודה. הכן את המסנן ועמודה על ידי שטיפה עם חיץ 3 מ"ל MACS. השלך זרימה דרך.
  13. שטוף תאים על ידי הוספת 10 חיץ וצנטריפוגה MACS מ"ל למשך 5 דקות ב 300 XG ו4-8 ° C. לשאוב supernatant לחלוטין.
  14. Resuspend תאים עם 500 μlMACS יבלום ולהחיל השעית תא על עמודת LS עם המסנן לפני פרידה.
  15. לשטוף שלוש פעמים עם חיץ 3 מ"ל MACS לעמודה. רק להוסיף מאגר חדש כאשר מאגר העמודה ריק.
  16. אספו שפכי סך מכילים CD133 ללא תווית - שבריר תא.
  17. השלך את המסנן שלפני פרידה, להסיר עמודה מהמפריד ולמקם אותו על צינור איסוף מתאים.
  18. החל חיץ 5 מ"ל MACS. מייד לשטוף את CD133 + התאים שכותרתו על ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לעמודה.
  19. כדי להגביר את טוהר החלק השלילי, יחול השעית תא על עמודת LS מתאזן חדשה הוכנסה בQuadroMACS. השפכים מכילים CD133 - החלקיק.
  20. השלך עמודות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הכנה של תאים בודדים מרקמת גידול

איור 2 מדגים גרורות ימפה resected של חולה מלנומה בשלב מאוחר לפני () ואחרי (ב ') לניתוק מכאני 2-4 חתיכות מ"מ. בעקבות ניתוק האנזימטית של הרקמה והסינון דרך רשת ניילון מיקרומטר 70, תאים היו pelleted וsupernatant מושלכים. בשלב זה אנו נצפינו זיהום גבוה עם אריתרוציטים כפי שצוין על ידי הצבע האדמדם של התא גלול ב האיור 2C. כתוצאה מכך, אנחנו מרוקנים את תאי הדם האדום, דבר שהביאו בתא כדורי צבע חום בהיר (האיור 2D). תאים אלה resuspended ותרבית עם 263 בינוניים קוונטית ב 37 ° C ו 5% CO 2.

אפיון של תרביות תאים ראשוניות

כדי לאמת אם התאים שמקורם גידול ולא מסביבת stroma, בצע RT-PCRשל melanocyte/melanoma-, פיברובלסטים-, הדנדריטים וגנים סמן בתאי גזע. מלנוציטים מבוגרים שמשו כתאי ביקורת נורמליות לTyr וNCCIT קרצינומה של תאים העוברי הקו כביקורת חיובית עבור סמן תאי גזע CD133. תוצאות PCR, המוצגות באיור 3, התגלו כי כמה תאים ראשוניים הם אכן ממוצא melanocytic (חיובי לTyr) ושליליים למרקר לתאים דנדריטים בשלים (CD83). יתר על כן, שורות תאים מלנומה נמצאו מפורש CD133, גן ​​חיוני לחלוקת תאים סימטריים וסמן תאי גזע סרטן ידוע. HPRT שמשה טעינת שליטה.

בתחילה, תרבית התאים הראשונית הכילה גם זיהום גבוה עם fibroblasts כפי שעולה מהביטוי הגבוה של CD90 (איור 3 שמאל, פנל העליון).

בעקבות דלדול פיברובלסט, תרבות תא זה הכילה רק Tyr + תא מלנומהזה ולא יותר (fibroblasts CD90 -) (איור 3 שמאל, פנל תחתון). היעדר fibroblasts יכול להיות מאושר על ידי מיקרוסקופיה brightfield, כפי שמוצג באיור 4.

תא מגנטי מיון של CD133 + ו CD133 - תאים מלנומה

תאים מלנומה ראשוניים, אשר מראים CD133 ביטוי כפי שצוין על ידי RT-PCR ניתן למיין לCD133 + ו CD133 - תאים. עם פרוטוקול השונים מהעקיפים CD133 Microbead הקיט, טוהר גבוה (> 99.75%) ותשואה של CD133 + ו-CD133 שברים, כמו גם כדאיות גבוהה של שני השברים לאחר מיון, מושגת. יעילות וטוהר המיון תמיד צריכות להיות מאומתת על ידי צביעת immunofluoresence או ניתוח כתם מערבי כפי שמוצגים באיור 5 א 'וב'.

איור 1 איור 1. מערך כולל של הניסוי. התרבות ראשית מלנומה ובידוד של תאי CD133 + בתאי גזע סרטני משוערים כולל כריתה של גידול ואחרי ניתוק מכאני והאנזימטית של התאים הסרטניים באמצעות שילוב עם ניתוק DNase אני וcollagenase הרביעי וDissociator gentleMACS. אם תאי הגידול מזוהמים מאוד עם תאי דם אדומים, צעד דלדול כדורי אדום מומלץ. תרבית תאים ראשוניים אז חייבים להיות מאופיינים וMicroscopical RT-PCR ניתוח כדי לאשר אם הם תאים מלנומה. זיהום גבוה עם fibroblasts שצוין על ידי ביטוי של CD90 ניתן להסיר על ידי דלדול פיברובלסטים באמצעות microbeads של Miltenyi אנטי פיברובלסטים. לבסוף, CD133 + ותאים מלנומה יכולים להיות מופרדים CD133 באמצעות אדם העקיף CD133 מייקרו חרוז מקיט Miltenyi. לאחר מיון, טוהר והוא אשר CD133 +ד שברי CD133 מלנומה יכולים להיות מנותחים לצד זה.

איור 2
איור 2. הכנה של תאים בודדים מרקמת גידול. .: דוגמה של גרורות מלנומה resected לפני הניתוק לתאים בודדים B: גרורות מלנומה לאחר ניתוק מכאני של רקמת גידול לחתיכות 2-4 מ"מ באמצעות שני אזמלים סטריליים C:. גלולה של תאים בודדים המזוהמים ביותר בתאי דם אדומים D. : גלולה של תאים בודדים לאחר דלדול כדורי אדום.

איור 3
איור 3. ניתוח ביטוי של תרביות תאים ראשוניות. ניתוח RT-PCR של גנים הקשורים לייצור המלנין (Tyr), סמן פיברובלסט (CD90), סמן תאים דנדריטים ( CD83) וגנים חיוניים לחלוקת תאים סימטרית (CD133) הראו כי בתחילה, תרבית התאים העיקרית כלולה CD133 + תאים מלנומה (Tyr +) ולא תאים דנדריטים (CD83-) אבל מאוד היו מזוהם בfibroblasts (CD90 +) (פנל שמאלי, עליון) . דלדול פיברובלסטים הבא תרבית התאים הכיל רק + Tyr ותאי CD90 מלנומה (שמאלי, פנל תחתון). HPRT שמש טעינת שליטה. NCCIT ומלנוציטים מבוגרים שמשו כביקורת חיובית לCD133 וTyr, בהתאמה.

איור 4
איור 4. Micrographs של תרביות תאים ראשוניות לפני ואחרי דלדול פיברובלסטים. : מיקרוסקופ brightfield של תרבית תאים ראשונית מאוד מזוהם בfibroblasts B:. Brightfield מיקרוסקופ של אותה התרבות של תאים מלנומה הראשונית לאחר דלדול פיברובלסטים.

e_content "fo: לשמור-together.within עמודים =" תמיד "> איור 5
איור 5. אימות של MACS באמצעות צביעת immunofluorescence והסופג מערבי. : Micrographs immunofluorescence של תאים מלנומה 24 שעות לאחר מיון עם הערכה העקיפה CD133 Microbead מMiltenyi. תאים נזרעו בתלושי כיסוי ומוכתם בCD133 / 1 (W6B3C1) נוגדן ואחרי דגירה עם נוגדן Alexa פלואוריד 488 עיזים נגד ארנב משני. רק בחלק הקטן CD133 + אות מסוימת בקרום התא נצפתה כפי שצוינה על ידי חצים לבנים (פנל שמאלי). CD133-תאים לא כתם לנוכחות של החלבון (לוח ימני) B:. אישור על טוהר מיון לפי סופג מערבי ניאון כמותית. CD133 איתות חזקה זוהתה בשבריר CD133 +, ואילו CD133 ביטוי חלש מאוד נצפה בדואר CD133-אוכלוסייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

על מנת להסיר זיהומים כדוריים אדומים מתא גלולת גידול מומלץ מאוד להשתמש בפתרון תמוגה תא הדם האדום מMiltenyi. היתרונות של lysing את אריתרוציטים מעל צנטריפוגה שיפוע צפיפות Ficoll המסורתית הם כי הוא מהיר יותר ופשוט יותר. יתר על כן, עם זיהומי Ficoll או תאי דם אדומים ואובדן של תאים סרטניים נמנעים. כשאתה מתבונן על הצמיחה של fibroblasts בתרבית התאים הראשוניות יש להסיר באופן מיידי שכן הם בדרך כלל לגדול יותר התאים הסרטניים כשמחכים יותר מדי זמן.

בעת מיון תאים עם הטכניקה של MACS Miltenyi אנו ממליצים קצירת תאי enzymatically. באמצעות מגרד תא עלול להיות עדין יותר לתאים ואפיטופים פני השטח שלהם, אבל גם ייצור שברי תאים, אשר נקלטים nonspecifically לעמודות המקים ולסתום את העמודות. היתרונות של Accutase מעל הטיפול המסורתי טריפסין / EDTA כוללים לחץ מופחת תא, לאהדינג לכדאיות השתפרה וסיכון מזערי של החדרת סוכני adventitious לתוך תרביות תאים. הכנת Accutase אינו מכילה חלבוני יונקים או חיידקי רקומביננטי 28.

כדי למנוע מיצוי של נוגדנים על פני התא וסימון תאים לא ספציפי אחד צריך לעבוד מהר, לשמור על תאים קרים ולהשתמש בפתרונות מראש מקוררים. יש לבצע את כל שלבי הדגירה ב2-8 מעלות צלזיוס, אך לא על קרח מאז טמפרטורות נמוכות עלולות להגביר את זמני דגירה. מספר התא האידיאלי לעמודה צריך להיקבע לכל תרבית תאים חדשים. במעבדה שלנו שעבדנו עם שורות תאים מלנומה שבו מספר תא מרבי של 10 7 תאי 4x יכול להיות מיושמות לכל עמודת LS. עמודות MS לא עובדות בכלל לסוג תא זה. לתאים גדולים מאוד Miltenyi מספק גם עמודות של תאים גדולות, שאמור להיות בשימוש במקום.

חיץ MACS המומלץ על ידי Miltenyi מכיל 2 המ"מ EDTA ו0.5% BSA ב PBS. אם ירד דרךbility של התאים לאחר מיון מגנטי הוא ציין, זה יכול להיות בגלל BSA ו / או EDTA במאגר. כדי לשפר BSA כדאיויות תא יכול להיות מוחלף על ידי 5% FCS, שהוא בדרך כלל נסבל טוב יותר מאשר BSA. EDTA במאגר MACS ניתן להשמיט להגדיל כדאיות של התא, אך תקטין את טוהר המיון לפי 2-3%.

חיץ MACS נהג לאזן את העמודות אמור להיות מושלך. לא מומלץ לאסוף את התאים הממוינים בפתרון האיזון הזה שכן הוא יכול לגרום ניזק לתאים. במקום זאת, תאים ממוינים יש לאסוף בצינור שסופק עם התרבות בינונית כדי לייצב את התאים ישירות לאחר מיון.

כדי למנוע סתימה של העמודות חשוב לקבל השעית תא בודד לפני המיון מגנטי על ידי העברת התאים דרך רשת ניילון מיקרומטר 30 (= מסננים טרום הפרדה). כדי להגביר את טוהר החלק השלילי, ריצה שנייה דרך עמודה טריה, מתאזנת LS או אפילו טור LD(= לדלדול של תאים) הוא הציע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים לפרופ 'מ Dietel ודירק שומאכר לתמיכה בעבודה זו ובביקורתיות קרא את כתב היד.

המחקר שיוביל לתוצאות אלה קבל תמיכה מההתחייבות החדשנית תרופות היוזמה המשותפת תחת הסכם המענק n ° 115234, משאבים של אשר מורכבים של תרומה כספית מהתכנית השביעית של האיחוד האירופי Framework (FP7/2007-2013) וחברות EFPIA 'ב תרומה נדיבה. עבודה זו נתמכה גם על ידי ברלינר Krebsgesellschaft (BKG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133/1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenase IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNase I Applichem GmbH A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Equipment
Cell strainer (70 μm) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Multi Stand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) Carl Roth GmbH Co. KG P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
  2. Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
  3. Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
  4. Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
  5. Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. Der Onkologe. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).
  6. Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
  7. Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
  8. Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
  9. Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
  10. Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
  11. Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
  12. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
  13. Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
  14. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
  15. Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
  16. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  17. Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
  18. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
  19. Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
  20. Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
  21. Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
  22. Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
  25. Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
  26. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
  27. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952 (2012).
  28. Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).
תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).More

Welte, Y., Davies, C., Schäfer, R., Regenbrecht, C. R. A. Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma. J. Vis. Exp. (73), e50200, doi:10.3791/50200 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter