Summary
이 문서는 기본 셀 문화, 및 종양 세포에서 적혈구와 섬유 아세포의 contaminations를 제거하는 방법에 신선한 얻은 흑색 증 조직의 준비에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 어떻게 묘사 CD133
Abstract
사용 가능한 흑색 증 오늘은 개선 치료 옵션에도 불구하고, 고급 악성 흑색 증 환자는 여전히 진행 무료 및 전반적인 생존 가난한 예후 (豫 后)가 있습니다. 따라서, 병진 연구는 악성 melanomas에 대한 타겟 치료를 개선하기 더 분자 증거를 제공해야합니다. 흑색 증에 관한 과거 종양 발생 메커니즘에 광범위하게 구축 된 세포 라인에서 공부했다. 각각의 유전자 프로파일에 따라 맞춤 치료 regimens로가는 길에, 우리는 환자 파생 세포 라인 대신 일반 세포 라인을 사용하여 제안합니다. 함께 특히 환자 후속에 대한 고품질의 임상 데이터와 함께 이러한 세포는 더 흑색 증의 진행 뒤에 분자 메커니즘을 이해하기 수단이 될 것입니다.
여기, 우리는 해부하는 새로운 종양 조직에서 기본 흑색 증 문화의 설립을 신고합니다. 이 절차는 하나의 셀에 날카과 조직의 분해, 재를 포함적혈구와 섬유 아세포뿐만 아니라 주요 문화와 세포 '흑색 증 원본을 신뢰할 수있는 인증과 contaminations의 moval.
최근 보고서 발표 그 melanomas, 종양의 대부분이 같은 항구 독점적으로 전이성 상태에 대한 종양 개시 및 진행을 연료 것 같습니다 암 줄기 세포 (CSCs)의 작은 subpopulation. 흑색 증의 CSC 식별 및 절연을위한 주요 마커 중 하나는 CD133입니다. 기본 흑색 증의 문화에서 CD133 + CSCs를 분리하기 위해, 우리는 수정과 자기가 활성화 된 셀 높은 정렬 순도의 결과로 Miltenyi에서 정렬 (맥) 절차와 CD133 + CSCs와 CD133의 생존 최적화 - 대량, 재배 및 기능적 분석 할 수 이후.
Introduction
피부 악성 melanomas 피부 암의 가장 일반적인, 아직 대부분의 치명적인 유형입니다. 증가 발생, 사망의 1,2을 관련 악성 피부 종양의 75 %를 종과 빠른 보급의 높은 학년, 지금 melanomas 계정으로 인해. 기본 종양, 화학 요법, 방사선 치료, immunotherapy와 metastasized 흑색 증의 결합 화학 및 immunotherapy의 수술 절단 외에 흑색 증 치료 3,4의 최신 전략입니다. 그러나, 악성 흑색 증은 chemotherapeutics에 가난한 응답 (5-12%) 5,6,하고 vemurafenib 7 치료 등 새로운 타겟 치료를 약속에서 BRAF V600E 유전자 변이 혜택을 들고 흑색 증 환자 만 50-70%에 의해 특징입니다 전체 생존을 개선, 흑색 증의 tumorigenesis의 메커니즘을 훨씬 더 이해가 필요합니다.
과거 잘 알려진 commer에 그 메커니즘을 연구하기 위해cially 가능한 셀 라인은 사용되었습니다. 암 개시 및 진행의 분자 이벤트를 공부하는 최근의 접근 방법은 종양 조직에서 직접 파생 된 주요 문화 활용 - 전략 베어링 매니 폴드 혜택을 : 연구원은 환자 및 조직 선택에 대한 모든 권한이 있습니다. 샘플 셀 전문적 선택 종양 조직에서 얻은, 모든 이질성과 종양과 유사하고 후속 환자의 데이터와 자세한 병리는 문화의 특성을 원래의 종양 (8)의 사람들과 비교 할 수 있도록 할 수 있습니다.
반면, 암 연구에 관련 모델 시스템과 같은 설립 세포 라인의 사용은 controversially 설명되어 있습니다. 이미 1987 년에 오스본과 동료는 다른 실험실 9 일부터 MCF-7 인간 유방암 세포 라인 간의 중요한 생물학적 차이를 설명했다. 하위 문화 중 RNA의 발현에있는이 광범위한 게놈의 불안정과 유사 공동했습니다Hiorns 외로 nfirmed.와 셀 라인으로써 인간의 암 (10)의 모델 등의 설립 문화의 직접적인 관련성을 약화, 문화 발전 않는 증거에 대한 지원 데이터를 제공했습니다.
크게 년 동안 무시되었습니다 또 다른 중요한 고려 사항은, 세포 라인의 큰 번호가 헬러에 의해 오염 된 것으로 첫번째 시연에서 20 년 이상 전에 강조했다 무관 'false'로 세포와 문화의 오염이나 전면에 자라 난의 위험이 세포 8,11. 'false'로 셀 라인의 데이터 오해는 최근 다시 문학에 불하게되었습니다. DNA 프로파일과 분자 cytogenetics의 조합을 사용하여, MacLeod 외이 있습니다. 252 새로운 종양 파생 인간의 세포 라인, 미생물 및 세포 문화 (DSMZ)의 독일 모음에서 입금 거의 18%이 intraspecies이 발견되거나 교차 interspecies 것으로 밝혀 - 오염 물질 12,13.
이러한 문제를 방지하고 위에서 언급 한 장점을 이용하기 위해, 우리는 신선한 excised metastases에서 낮은 통로 흑색 증 세포 라인을 구축하기로 결정했습니다.
강력한 세포 분리 및 분석 기술은 동시에 독특한 표면 단백질의 세포 죽음과 파괴를 제한하면서 단일 셀 준비가 생성되어야합니다. 단일 셀 중지로 조직의 자동화 분리에 대한 benchtop 악기는 Miltenyi에 의해 제조 gentleMACS의 Dissociator입니다. 항원 epitopes을 보존하고 셀 손실을 줄이면서 gentleMACS C 튜브 및 최적화 된 분리 솔루션 폐쇄 된 시스템에서 종양 조직의 효과적이고 부드러운 해리와 함께 사용하면 달성된다. 악기가 특정 어플리케이션과 guaranties 흑색 증 조직 14 일부터 단일 셀 현탁액의 표준화 준비 다양한 최적화 된 사전 설정 프로그램을 제공합니다.
<P 클래스 = "jove_content"> 종양의 대부분이 독점적으로 종양 - 시작 및 용량을 자기 갱신을 전시라는 암 줄기 세포 (CSCs)의 작은 subpopulation을 품다 것으로 밝혀 최근보고합니다. 피부의 진피에 melanocyte - 생산 줄기 세포의 식별은 UVA 방사선에 노출은 악성 변형 15 셀을 수상 할 수 있기 때문에 이러한 세포가 흑색 증의 암 줄기 세포 (CSCs)의 근원이 될 수 있다는 가설을 이끌었다. 이러한 유전자 병변의 결과는 종양과 줄기 세포 특성의 조합을 가지고 있고, 셀 것입니다.흑색 증에 CSCs의 subpopulation을 표현하기 위해 제안 된 주요 마커 중 하나는 CD133 16-20입니다. CD133 (또한 Prominin 1로 알려져 있음), pentaspan transmembrane의 glycoproteins의 회원은 조혈 줄기 세포, 내피 전구 세포, neuronal 및 glial 줄기 세포 21-23에 표시됩니다. CD133의 표현이과 상관있다비대칭 세포 분열 24, 및 CD133의 glycosylated 에피토프는 세포 분화 25시 downregulated로 표시했습니다. 최근 CD133 + 흑색 증 세포는 자기 갱신과 종양 - 개시 용량 19,20가 게재되었습니다.
CD133 + putative 흑색 증 CSCs의 기능을 연구하기 위해, 우리는 수정 및 CD133의 매우 풍부하고 가능한 인구 +와 CD133 얻을 수 Miltenyi 생명 공학에서 자기가 활성화 된 셀 정렬 (맥) 시스템 최적화 - 세포를.
Matheu 외하여 그림과 같이 자석 구슬 기반의 세포 분리도 부정적인 선택할 수 있습니다. 26 긍정적 인 선택 우리가 여기에 표시로. 긍정적 인 선택하는 동안 특정 대상 셀 유형, 예를 들어 CD133 표현 세포는 자기 (磁气)에 대한 매우 구체적인 항체에 복합 아르 MicroBeads, 50 나노 미터 superparamagnetic 입자으로 표시됩니다특정 세포 표면 항원. 라벨이없는 세포를 통해 유동 반면 분리하는 동안 자기 (磁 气) 라벨 세포는 분리의 자기장의 항목에서 유지됩니다. 세척 단계 후, 열 구분 기호의 자기장에서 제거되고, 대상 셀은 열에서 용출되어 있습니다. LS 또는 MS 항목은 고순도로 표시하고 라벨이없는 세포의 분수에 긍정적 인 선택 결과 중에 사용됩니다. 한편, 부정적인 선택에 사용되는 LD 열, 레이블 분수의 약간 낮은 순도하는 결과를 가져올 수도 있습니다. 자신의 매트릭스의 포장 밀도로 인해이 항목에 유속은 열에 갇힌 할 레이블이 지정되지 않은 세포의 높은 위험이 낮은 결과로 수 있습니다. LD 열 따라서 원치 않는 세포 subpopulation의 엄격한 고갈 용으로 만 사용되어야합니다. 긍정적 인 선택은 incubatio 다음 MicroBeads와 함께 직접 (MicroBeads에 커플 링 된 항체) 또는 간접적으로 자기 라벨 (부화에 의해 수행 될 수N 차 항체로). 특정 맥의 MicroBeads은 전립선이나 흑색 증 27 등의 주요 종양 세포의 다양한 세포 유형의 긍정적 인 선택하실 수 있습니다.
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Protocol
기본 세포 배양, 섬유 아세포 고갈과 CD133의 자기 세포 정렬의 종양 조직, 특성의 기본 단일 세포의 준비를 포함하여 실험의 전체 계획은 +와 CD133 - 흑색 증 세포는 그림 1에 표시됩니다.
1. 샘플 취득
- 다음 단계를 고려하기 전에 윤리적 승인을 확인합니다.
- 멸균 PBS가 수술 또는 팀 이상 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신 최종 농도와 손으로 보충과 함께 50 ML 튜브를 준비합니다.
- 4 ° C.에서 수술에서 세포 배양 연구소로 종양 조직의 빠른 전송을 구성
2. 종양 조직에서 기본 흑종 단일 세포를 준비
- 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다.
- 종양을 절제하기 전에, 하나는 해리 믹스를 준비해야합니다. 2-4g 조직 당 10 ML 해리 혼합이 필요합니다. 믹스는 immedia를 사용할 수 있습니다tely 또는 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 10 ML aliquots에 저장됩니다.
- 150 밀리미터 나트륨 염화물을 포함하는 솔루션을 준비합니다. 솔루션이 명확 할 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. 만약 0.22 μm 필터를 사용하여 필요한 멸균 - 여과 나트륨 염화물 솔루션입니다.
- DNase I을 무게 10 밀리그램 / 150mM 나트륨 염화물에 ML DNase I을 포함하는 솔루션을 준비합니다. 솔루션이 명확 할 때까지 버팅으로 섞는다.
- PBS에서 100mg/ml Collagenase IV를 포함하는 솔루션을 준비합니다. 솔루션이 명확 할 때까지 버팅으로 섞는다. collagenase 솔루션의 Aliquots은 몇 달 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신, 1 MG / ML Collagenase IV 및 0.1 밀리그램 / 양자 263 매체에서 ML DNase I의 최종 농도로 해리 믹스를 준비합니다. 소용돌이를 사용하여 섞는다. 선택 사항 : 1.5 μg / ML Amphotericin B.의 최종 농도로 분리 믹스로 피부를 추가 Amphotericin B 솔루션에서 파생 흑색 증 세포를 사용하는 경우
- 사전 따뜻한 req37 해리 믹스, PBS 및 양자 263 매체의 uired 양 ° C.
- 멸균 페트리 접시에 장소 종양 조직. 조직에서 과도한 솔루션을 기음 500 μl 분리 믹스를 추가합니다. 신선한, 멸균 메스를 사용하여 2-4밀리미터 작은 조각으로 종양을 이기다.
- 전송 2~4그램 5 ML 해리 혼합을 포함하는 gentleMACS C 관에 종양 조직을 다진. 추가 4.5 ML 분리 믹스로 페트리 접시를 씻어 gentleMACS C 튜브에 남아있는 조직 조각을 추가 할 수 있습니다.
- gentleMACS C 관을 닫고 gentleMACS의 Dissociator의 소매에 거꾸로을 첨부합니다. gentleMACS 프로그램 "h_tumor_01"를 실행합니다.
- dissociator에서 gentleMACS C 관을 분리하고 37 30 분의 샘플을 배양 ° C 정착 조직 조각을 resuspend하기 위해 최선을 5 분 가장 높은 실행 속도 (12 RPM) 또는 수동으로 튜브를 회전하여 MACSmix 튜브 회선 근을 사용하여 연속 회전에 따라 .
- t의 소매에 거꾸로 gentleMACS C 관을 첨부그는 gentleMACS Dissociator하고 gentleMACS 프로그램 "h_tumor_02"를 실행합니다.
- dissociator에서 gentleMACS C 관을 분리하고 37 30 분의 샘플을 배양 ° C 정착 조직 조각을 resuspend하기 위해 최선을 5 분 가장 높은 실행 속도 (12 RPM) 또는 수동으로 튜브를 회전하여 MACSmix 튜브 회선 근을 사용하여 연속 회전에 따라 .
- gentleMACS의 Dissociator의 소매에 거꾸로 gentleMACS C 관을 첨부하여 gentleMACS 프로그램 "h_tumor_03"를 실행합니다.
- dissociator, resuspend 샘플에서 gentleMACS C 관을 분리하고 50 ML 튜브에 위치 70 μm 세포 스트레이너에 세포 현탁액을 적용합니다. 필터의 막힘 것이 발생하면 전체 현탁액을 통해 실행까지 살균 필터 팁과 세포 현탁액을 젓는다.
- 5 ML 양자 263 매체와 셀 스트레이너를 씻어.
- 선택 사항 : 당신은 여전히 양자 263 매체와 적절한 세포 배양 말요에 씨앗을에 필터를 resuspend 조각에 남아있는 조직 조각이있는 경우H. 37 조각을 길러 ° C 5 % CO 2.
- 셀 스트레이너을 취소하고 소화 세포 현탁액으로 50 ML 튜브를 닫습니다. 300 XG에서 5 분에 세포 현탁액을 원심 분리기하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 선택 사항 : 셀 펠렛 인해 적혈구 500 μl PBS로 두 번 증류수, resuspend 세포 펠렛의 10 배 솔루션 1시 10분을 diluting하여 1X 적혈구 용해 용액을 준비하는 높은 금액으로, 5 ML 1X 적혈구 용해를 추가 빨간색 표시되는 경우 솔루션입니다. 10 분 동안 실온에서 소용돌이 5 초 및 품다. 300 XG에서 5 분 동안 원심 분리기와 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 양자 263과 씨앗 적절한 세포 배양 플라스크에 세포와 종양 세포를 Resuspend. 37 번 문화 종양 세포 ° C 5 % CO 2가 80 % 합류에 도달 정기적으로 통로 세포.
3. 기본 셀 문화와 섬유 아세포 고갈의 특성
- phenotypically microsco를 사용하여 기본 세포 배양를 분석PE.
- 기본 세포 배양의 작은 양 (0.5x 10 6 세포)를 수확하고 neoplastic -, 흑색 증 -, 줄기 세포와 기질 세포 마커 유전자에 대한 프리 머와 RT-PCR을 수행합니다. 분석 할 수있는 가장 중요한 유전자는 CD90 (섬유 아세포 마커), 티르 (흑색 증 / melanocyte 마커), CD133 (암 줄기 세포 마커), CD83 (성숙 수지상 세포 마커) 및 하우스 키핑 유전자 (예 : HPRT 또는 GAPDH)입니다.
- RT-PCR 동안 현미경 분석과 CD90의 높은 표현이 섬유 아세포와 기본 흑색 증 문화의 높은 오염을 공개하는 경우, 당신은 Miltenyi에서 안티 섬유 아세포의 MicroBeads 및 D 열을 사용하여 섬유 아세포를 고갈해야합니다.
4. 자기 세포 CD133의 정렬 +와 CD133 - LS 열을 사용하여 흑종 셀
- PBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5 % FCS를 포함하는 맥 버퍼를 준비합니다. 0.22 μm Steritop-GP 필터 유닛을 사용하여 반전 및 살균 - 여과 버퍼로 섞는다. 4-8 ° C에 칠 버퍼사용하기 전에 및 가스를 제거하다.
- 37 미리 따뜻한 Accutase, PBS 및 양자 263 매체 ° C.
- PBS로 80% 합류 세포를 씻으십시오. Accutase의 적절한 금액을 추가하고 셀 문화 표면에서 분리 될 때까지 알을 품다. 양자 263 매체를 사용하여 50 ML 튜브에 세포를 수집합니다.
- 휴대폰 번호를 결정하고시 5 분에 세포의 필요한 번호 (배 10 9 셀의 최대 수는 LS 칼럼 당로드 할 수 있습니다. 셀 라인을 특정 최적의 번호가 결정되어야하며 상당히 낮을 수 있습니다 Miltenyi의 프로토콜에 따라.) 원심 분리기 300 XG와 4-8 ° C. 완전히 표면에 뜨는 대기음.
- 350 μl 맥 버퍼와 1X 10 8 셀의 최대 (높은 세포 숫자가 따라 모든 다음 맥 버퍼를 확장, FcR 차단 시약, CD133/1-Biotin 및 안티 - 비오틴 MicroBeads은 볼륨 용) Resuspend.
- 100 μl FcR 차단 시약을 추가합니다.
- 50 μl CD133/1-Biotin을 추가합니다. 4-8에서 소용돌이과 품다를 사용하여 잘 혼합 ° C F또는 10 분.
- 300 XG와 4-8 ° C.에서 5 분 10 ML 맥 버퍼와 원심 분리기를 추가하여 세포를 씻으십시오 완전히 표면에 뜨는 대기음.
- 세척 단계 (4.8)을 반복
- 400 μl 맥 버퍼와 Resuspend 세포 펠릿.
- 100 μl 방지 비오틴 MicroBeads을 추가합니다. 15 분에 4-8 ° C에서 소용돌이과 품다를 사용하여 잘 섞는다.
- 한편, 자기 분리의 맥 구분 기호를 준비합니다. 맥 격리 멀티 스탠드에 QuadroMACS을 첨부합니다. QuadroMACS의 자기장의 전면에 열 날개와 LS 열 필요한 번호를 삽입합니다. 각 항목 아래 각 LS 열 및 적절한 수집 관 (15 ML 50 ML)로 사전 분리 필터 (30 μm 나일론 메쉬 포함) 놓습니다. 3 ML 맥 버퍼와 린스에 의해 필터 항목을 준비합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 300 XG와 4-8 ° C.에서 5 분 10 ML 맥 버퍼와 원심 분리기를 추가하여 세포를 씻으십시오 완전히 표면에 뜨는 대기음.
- 500 μl와 세포를 Resuspend맥 사전 분리 필터와 함께 LS 열에 세포 현탁액을 버퍼와 적용됩니다.
- 열 당 3 ML 맥 버퍼로 세 번 씻으십시오. 열 저장소가 비어있는 경우에만 새로운 버퍼를 추가 할 수 있습니다.
- 세포 분율 - 수집 된 총 유출은 라벨이 지정되지 않은 CD133이 포함되어 있습니다.
- 사전 분리 필터를 삭제 하시겠습니까, 구분 기호에서 열을 제거하고 적절한 회수 관에 배치.
- 5 ML 맥 버퍼를 적용 할 수 있습니다. 즉시 단단히 열로 플런저를 밀어 레이블 CD133 + 세포를 제거.
- 부정적인 분수의 순도를 높이기 위해 QuadroMACS에 삽입하는 equilibrated LS 칼럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 분수 - 유출은 CD133이 포함되어 있습니다.
- 열을 폐기하십시오.
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Representative Results
종양 조직에서 단일 세포의 준비
그림 2 (A)와 (B) 기계 분리 한 후 2~4mm 조각에 전에 늦은 단계 흑색 증 환자의 resected의 림프절 전이의 실천. 70 μm 나일론 메쉬를 통해 조직과 여과의 효소 분해 후, 세포는 pelleted이었고 표면에 뜨는를 삭제했습니다. 이 단계에서 우리는 그림 2C의 셀 펠렛의 붉은 색으로 표시로 적혈구와 높은 오염을 관찰했다. 그 후, 우리는 밝은 갈색 색상 (그림 2D)의 세포 펠렛으로 이어진 붉은 혈액 세포를 고갈. 이러한 세포는 37 resuspended과 양자 263 매체 배양 된 ° C 5 % CO 2.
기본 셀 문화의 특성
세포가 종양에서 발생한 여부를 확인하고하지 기질 주변에서, 우리는 RT-PCR을 수행melanocyte/melanoma-의, 섬유 아세포 -, 수지상 및 줄기 세포 마커 유전자. 성인 melanocytes는 티르와 줄기 세포 마커 CD133에 양성 반응 제어로 배아 암종 세포 라인 NCCIT에 대한 정상적인 제어 세포로 하였다. 그림 3에 표시된 PCR 결과, 일부 주요 세포가 melanocytic 원산지 실제로 아르 (티르에 대한 긍정적 인)과 성숙 수지상 세포 (CD83)의 마커에 대한 부정적인 것으로 나타났다. 또한, 흑색 증 세포 라인 특급 CD133, 비대칭 세포 분열 및 알려진 암 줄기 세포 마커에 중요한 유전자로 발견되었습니다. HPRT이 컨트롤을로드로 사용되었다.
CD90의 높은 표현 (왼쪽 그림 3, 상단 패널)에 의해 표시된대로 처음에는 기본 세포 배양은 또한 섬유 아세포와 높은 오염이 포함되어 있습니다.
섬유 아세포 고갈 후,이 세포 배양은 티르가 포함 + 흑색 증 세포를s와 더 이상 섬유 아세포 (CD90 -) (그림 3 왼쪽, 하단 패널). 그림 4와 같이 섬유 아세포의 부재는 brightfield 현미경으로 확인 할 수있다.
자기 CD133의 정렬 셀 +와 CD133 - 흑색 증 세포
셀 - RT-PCR로 표시로 CD133 표현을 보여 주 흑색 증 세포는 CD133 +와 CD133으로 정렬 할 수 있습니다. 수정 된 간접 CD133 Microbead 키트, 고순도 (> 99.75 %)에서 프로토콜과 CD133의 항복으로 +와 CD133-분수뿐만 아니라, 정렬 후, 달성 두 분수의 높은 가능성. 그림 5A와 B와 같이 정렬 효능과 순도는 항상 immunofluoresence의 얼룩이나 서쪽 블로 팅 분석으로 확인해야합니다.
1 그림. 실험의 전체 계획은. 기본 흑색 증 세포의 문화와 CD133 + putative 암 줄기 세포의 분리는 DNase I 및 Collagenase IV와 gentleMACS의 Dissociator와 분리 믹스를 사용하여 종양 세포의 기계적 효소 분해에 이어 종양의 절제술을 포함합니다. 종양 세포는 높은 적혈구으로 오염하는 경우, 적혈구 고갈 단계를 권장합니다. 양식 기본 셀은 그 사람들이 흑색 증 세포 인 경우 확인을 위해 마이크로 및 RT-PCR 분석을 특징으로합니다. CD90의 표현으로 표시 섬유 아세포와 높은 오염 Miltenyi의 방지 섬유 아세포의 microbeads를 사용하여 섬유 아세포 고갈에 의해 제거 할 수 있습니다. 마지막으로, CD133 +와 CD133-흑색 증 세포는 Miltenyi에서 간접 CD133 마이크로 비드 키트 인간을 사용하여 fractionated 될 수 있습니다. 정렬 후, 순도가 확인되고 CD133 +D CD133 - 흑색 증의 분수가 나란히 분석 할 수 있습니다.
그림 2. 종양 조직에서 단일 세포의 준비. A :. 하나의 셀에 분리하기 전에 resected의 흑색 증의 전이의 샘플 B : 두 멸균 메스를 사용하여 2-4밀리미터 조각으로 종양 조직의 기계적 분리 후 흑종의 전이 C :.. 높은 적혈구 D로 오염 된 단일 세포 펠릿 : 적혈구 고갈에 따라 단일 세포의 펠릿.
그림 3. 기본 셀 문화의 표현 분석. 멜라닌 생산 (티르), 섬유 아세포 마커 (CD90), 수지상 세포 마커 (관련 유전자의 RT-PCR 분석 CD83)와 비대칭 세포 분열 (CD133)에 중요한 유전자는 처음, 기본 세포 배양은 CD133를 포함하는 + 흑색 증 세포 (티르 +)없이 수지상 세포를 (CD83-) 보여하지만, 높은 섬유 아세포 (CD90 +) (왼쪽, 상단 패널)으로 오염 된 . 다음 섬유 아세포 고갈이 세포 배양은 티르의 + 및 CD90 - 흑색 증 세포 (왼쪽, 하단 패널)이 포함되어 있습니다. HPRT이 통제로드로 사용되었다. NCCIT 및 성인 melanocytes는 각각, CD133과 티르에 대한 긍정적 인 컨트롤을 역임했습니다.
4 그림. 섬유 아세포 고갈 전후 차 전지의 문화 Micrographs. A : 기본 세포 배양의 Brightfield의 현미경은 높은 섬유 아세포로 오염 B :. 섬유 아세포 고갈 후 같은 기본 흑색 증 세포 문화의 Brightfield 현미경은.
그림 5. immunofluorescence 얼룩과 blotting 서쪽를 통해 맥을 확인한다. A : 흑색 증 세포의 Immunofluorescence micrographs Miltenyi에서 간접 CD133 Microbead 키트로 분류 후 24 시간. 전지 커버 전표에 놓는와 알렉사 형석 488 염소 안티 - 토끼 차 항체와 부화 다음 CD133 / 1 (W6B3C1) 항체 물들했다. 만 CD133 + 분율에있는 세포막에서 특정 신호는 흰색 화살표 (왼쪽 패널)에 의해와 같은 표시 관찰되었다. CD133-세포는 단백질 (오른쪽 패널)의 존재를 착색하지 않은 B :. blotting 양적 형광 서쪽으로 정렬 순도 확인. 매우 약한 CD133 표현이 일에서 관찰 된 반면, 강한 CD133 신호는 CD133 + 분율에 감지되었습니다전자 CD133-인구.
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Discussion
종양 세포 펠렛에서 적혈구 contaminations를 제거하기 위해 우리는 매우 Miltenyi에서 적혈구 용해 용액을 사용하는 것이 좋습니다. 기존의 Ficoll 밀도 기울기 원심 분리를 통해 적혈구를 lysing의 장점은 빠르고 간단는 것입니다. 또한, Ficoll 또는 적혈구와 종양 세포의 손실과 contaminations을 피할 수 있습니다. 너무 오래 대기 할 때 일반적으로 종양 세포를 ...보다 빨리 자라다 이후이 기본 세포 배양에서 섬유 아세포의 성장을 관찰 할 때 즉시 제거해야합니다.
Miltenyi의 맥 기법으로 세포를 정렬 할 때 우리는 효소 세포를 수확하는 것이 좋습니다. 셀 스크레이퍼를 사용하면 세포와 표면 epitopes에 gentler 될 수 있지만, 맥 컬럼에 nonspecifically 바인딩하고 열을 방해 셀 조각을도를 생성합니다. 기존의 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 치료를 통해 Accutase의 장점은 감소 세포 스트레스, 레아를 포함개선 생존과 세포 배양에 우발적 에이전트를 소개 최소화 위험 땡. Accutase 준비는 포유류 나 재조합 박테리아 단백질 28이 포함되어 있지 않습니다.
세포 표면 및 비 특정 셀 라벨 하나에 항체의 상한을 방지하려면, 빠른 작동 세포가 차가운 유지하고 미리 냉각 솔루션을 사용해야합니다. 낮은 온도는 부화 시간을 증가시킬 수 있기 때문에 모든 인큐베이션 단계 ° C,하지만 얼음에 2-8으로 수행해야합니다. 열 당 이상적인 셀 번호는 각각의 새로운 세포 배양에 대해 결정해야합니다. 우리 연구실에서는 4 배 10 7 세포의 최대 휴대폰 번호는 LS 열 당 적용 할 수있는 흑색 증 세포 라인과 함께했습니다. MS 열이 세포 유형에 대해 전혀 작동하지 않았다. 매우 큰 세포에 대한 Miltenyi도 대신 사용되어야 대형 셀 열을 제공합니다.
Miltenyi에서 권장하는 맥 버퍼는 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 PBS에 0.5 % BSA가 포함되어 있습니다. 를 통해 감소하는 경우자기 정렬이 관찰 된 후 세포의 bility,이 BSA 및 / 또는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼가 원인 일 수 있습니다. 세포 생존 능력의 BSA를 개선하기 위해하는 것은 일반적으로 더 나은 BSA보다 용납입니다 5% FCS로 대체 할 수 있습니다. 맥 버퍼에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)는 세포의 생존을 증가하지만, 2~3%에 의해 정렬 순결을 줄일 수 생략 할 수 있습니다.
열을 평형에 사용 맥 버퍼는 폐기해야합니다. 그것은이 세포를 손상시킬 수 있기 때문에이 평균 솔루션에 정렬 세포를 수집하는 것은 권장하지 않습니다. 대신, 정렬 셀에서 직접 정렬 한 후 세포를 안정화 문화 매체와 함께 제공 관에서 수령하실 수 있습니다.
열 막힘 방지하려면 약 30 μm 나일론 메쉬 (= 사전 분리 필터)를 통해 세포를 전달하여 자기 정렬하기 전에 단일 셀 정지를 얻는 것이 중요합니다. 신선한 equilibrated LS 열 또는 LD 열을 통해 부정적인 분수, 두 번째 실행의 순결을 늘리려면(= 세포의 고갈)을 권장합니다.
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Disclosures
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
Acknowledgments
저자는이 일을 지원하고 비판적으로 원고를 읽기 위해 교수 M. Dietel와 더크 슈마허 감사드립니다.
이러한 결과로 이어지는 연구 보조금 협정 N 아래의 혁신적인 의약품 사업 공동 인수 ° 115,234, 유럽 연합 (EU)의 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)와 EFPIA 회사 '에서의 금전적 인 기부로 구성되는 자원의 지원을받은 친절한 기여. 이 작품은 베를린 Krebsgesellschaft (BKG)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
| Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
| anti-fibroblasts microbeads | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
| CD133/1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
| DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
| D-PBS without Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
| FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
| Indirect CD133 Micro-Bead Kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
| Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
| Equipment | |||
| Cell strainer (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
| MACS Separator Multi Stand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS Seperation Columns 25 LS Columns | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
| Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) | Carl Roth GmbH Co. KG | P668.1 | |
| Steritop-GP Filter Unit 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE | |
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