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Biology

染色体制备培养细胞

doi: 10.3791/50203 Published: January 28, 2014

Summary

染色体可以从活细胞如淋巴细胞或皮肤成纤维细胞中分离出来,并从生物体包括人或小鼠。这些染色体制剂可进一步用于常规G显带和分子细胞遗传学方法,如荧光原位杂交(FISH),比较基因组杂交(CGH)和光谱核型分析(SKY)。

Abstract

染色体(遗传学)分析被广泛用于染色体不稳定性的检测。当随后G显带和如荧光原位杂交(FISH)分子生物学技术,此法必须分析单个细胞对于涉及基因组重排,并涉及一个或多个染色体部分的收益或亏损畸变强大的能力。在人类中,染色体异常发生率约为每1 160个活产1,2,所有流产的60-80%3,4,死胎10%2,5,患有先天性心脏疾病6,3-6%个人13%不孕不育病例2,并在许多患者的发育迟缓和出生缺陷7。恶性肿瘤的细胞遗传学分析是经常使用的研究人员和临床医生,作为克隆性染色体异常的观测已经显示出具有诊断和预后意义8,9。60,染色体分离是非常宝贵的基因治疗和干生物,包括非人灵长类动物和啮齿动物10-13细胞研究。

染色体可以从活组织,包括外周血淋巴细胞,皮肤成纤维细胞,羊膜细胞,胎盘,骨髓和肿瘤样品的细胞中分离出来。染色体在有丝分裂的中期阶段进行分析,当它们被大部分冷凝并因此更加清晰可见。染色体分离技术的第一步涉及主轴纤维的破坏由孵化与秋水仙胺,以防止细胞从进到随后的后期阶段。然后将细胞用低渗溶液,并在其膨胀状态与卡诺固定液保存。的细胞,然后下降到幻灯片,然后可以用于各种各样的程序。 G显带包括胰蛋白酶处理,然后进行染色用姬姆萨打造特色光和暗带。同样的公关ocedure分离的染色体,可用于制备细胞对诸如荧光原位杂交(FISH),比较基因组杂交(CGH),和光谱核型分析(SKY)14,15程序。

Introduction

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染色体核型分析是利用世界性诊断染色体不稳定和重排,导致遗传性疾病和恶性肿瘤1,2,8,9的常规技术。此外,对于宪法和癌症获得的遗传异常的诊断和研究更高的分辨率可与经典遗传学方法和分子细胞遗传学方法,如荧光原位杂交(FISH)的组合,比较基因组杂交(CGH)来实现和光谱核型分析(SKY)14,15。最近,这些技术已被用于与干细胞研究相关的染色体不稳定性的评价。核型异常如长期培养的胚胎干细胞(ES)和各种生物体的成体干细胞的非整倍体已经报道由多个实验室。最近的证据支持某些细胞系在本质上更倾向于染色体instabiLITY不管文化条件为此,建立和/或维持人,小鼠,或恒河猴干细胞系时,染色体分析,建议作为质量控制过程的一部分。许多报告描述了使用常规和分子细胞遗传学监测干细胞和恶性细胞或有机体的各种文化10-13的染色体的稳定性越来越大的兴趣。这些协议正越 ​​来越多地使用非遗传实验室的培养细胞13染色体的快速评估。我们提出我们的基本程序,用于从不同的细胞类型,这可以应用于从多种生物衍生的临床和研究的目的和细胞染色体制备。

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Protocol

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1。贴壁细胞的染色体收获

  1. 标准协议
    1. 根据特定的细胞培养条件下生长的细胞。当细胞达到对数生长期(80%铺满),加入秋水仙胺的10微升/毫升的细胞培养瓶中。建议最小2×10 6细胞。
    2. 在5%CO 2培养箱中45分钟,孵育细胞,在37℃。用无菌吸管,从传输介质的细胞成15毫升锥形管。备用。
    3. 轻轻地加入2ml的HBSS缓冲液加入到烧瓶中洗细胞。漩涡缓冲,然后用移液管除去。丢弃。
    4. 加入1 ml的胰蛋白酶,确保它涵盖了烧瓶的整个表面上。唯一留下的细胞在胰蛋白酶进行约2分钟。一旦大部分细胞已经分离,吸取在锥形管中的介质倒流到细胞上。
    5. 转移的细胞悬浮液在10毫升的等分试样分成15毫升锥形管中。离心机在200×g离心10分钟。去除上清,重悬沉淀。
    6. 加入10毫升0.075M的氯化钾已预热至37℃到在锥形管中剩余的粒料。涡流管在中速混合KCl和细胞。
    7. 培养细胞在37℃,10分钟。离心机在200×g离心5分钟,在25℃下除去上清液(直到约0.5ml遗体),重悬沉淀。
    8. 小心地加入5毫升新鲜卡诺固定液(3:1比率的甲醇:冰醋酸)的细胞,同时涡旋。然后加入5 ml更多固定液没有涡旋的总体积为10ml。
    9. 离心机在200×g离心5分钟。去除上清,重悬细胞。加入5 ml固定液到每个管中。
    10. 离心机在200×g离心5分钟。去除上清,重悬细胞。加入5 ml固定液到每个管中。细胞现在可以存储在4℃可保存一年。
  2. 修改协议:染色体harvesti淋巴母细胞系的NG
    1. 根据特定的细胞培养条件下生长的细胞。 (使用烧瓶适当的培养细胞的量)。当细胞达到对数生长期(约两天后的细胞分裂),加入秋水仙胺的10微升/毫升的细胞培养瓶中。
  3. 修改协议:染色体从全血中收获
    植物血凝素(PHA),从红菜豆衍生的外源凝集素,是一种强有力的促细胞分裂剂对人T细胞16。加入PHA的在培养后72小时,约45%的细胞处于S期。这代表了高峰期有丝分裂活性,并且是最佳点时收获的染色体研究。其它有丝分裂原如美洲商陆(1-10微克/毫升)在分析B细胞17,18可被使用。
    1. 收集至少有1毫升全血的绿色顶端肝素钠管。使用内采集后3天。血液储存在室温未直到准备使用。
    2. 等分部分0.25的全血在10毫升含L-谷氨酰胺(20%胎牛血清,1%青霉素/链霉素,1%两性霉素B,和1%PHA)的完全RPMI介质中的溶液。培养在37℃,5%CO 2。
  4. 修改协议:染色体从骨髓采集
    对骨髓细胞遗传学分析是有用的在许多恶性血液疾病为观察染色体异常克隆的可能诊断为白血病的特定类型。染色体的研究也用于评估疾病的进展,如急和对治疗的反应的发生。自骨髓细胞活跃分裂的,不分裂原刺激是必要9,19。对于急性白血病24和48小时的文化也成立。
    1. 收集至少1毫升骨髓的绿色顶端肝素钠管。等分0.25骨髓在10ml含L-谷氨酰胺(2完全RPMI介质中的溶液0%胎牛血清,1%青霉素/链霉素,1%两性霉素B)。培养在37℃,5%CO 2。

2。玻片制备和染色固

一位代表幻灯片的快速评估将继续进一步的程序,如G显带,FISH,CGH,或Sky之前提供关于收获的质量信息。一些实验室倾向于固体染色的细胞进行快速采集和染色体评估。可替代地,在相差显微镜可用于这种分析。幻灯片最好准备当湿度约为50%,而环境温度(20-25℃)。

  1. 离心细胞,在200×g离心5分钟,在25℃下除去上清液,直到只有0.3-0.5毫升遗体。
  2. 经过沉淀,吸液管3滴从约2中的距离的细胞悬浮液轻轻重悬在其上倾斜约45°的角度,并允许该悬浮液的滑动横跨滑动与滚动。添加一个大的一滴新鲜卡诺固定液的幻灯片。
  3. 干滑的背部在纸巾上,然后坐在滑板,取出,晾干至少10分钟。幻灯片应完全干燥。
  4. 准备新鲜的姬姆萨染色溶液(3:1比例格尔缓冲区和姬姆萨染色的)。将载玻片上染色架。覆盖在姬姆萨染色液整个幻灯片。让载玻片保持在5分钟的染色溶液。幻灯片冲洗用蒸馏水,排水,并让​​其自然风干。
  5. 加入4滴Permount和盖玻片的幻灯片。确保有盖玻片下无气泡。该excess Permount可以与纸巾除去。
  6. 根据10倍和100倍的放大倍率光学显微镜分析细胞。如果中期细胞丰富,以及扩散,剩下的幻灯片可以被用于其它实验程序。

3。 G显带用胰蛋白酶和姬姆萨(GTG)

<P>胰蛋白酶是在变性DNA区域常染色质组蛋白具有较高的转录活性产生的蛋白水解酶。下面的姬姆萨染色,这些地区将出现光带。高度浓缩的染色质,很少或没有转录活性(异)将其从组蛋白的胰蛋白酶保护的很大一部分,因此,会弄脏黑暗以下​​Giemsa染色。至关重要的是最初G带一张幻灯片监控条件并在必要时调整胰岛素的时间为随后的幻灯片。

  1. 添加下面的解决方案,以4科普林氏罐子。
    缸#1 = 30毫升的1X HBSS和4ml的10×胰蛋白酶(0.5%)
    罐#2 = 50毫升的1X的HBSS
    缸#3 = 45毫升的1X HBSS和5毫升胎牛血清的
    罐#4 = 50毫升的1X的HBSS
  2. 沉浸在罐#1每张幻灯片持续5秒,快速冲洗罐中#2,互留在滑罐#3至少30秒,快速冲洗罐中#4,然后让片干燥。
  3. 准备FRESħ姬姆萨染色溶液(3:1比例格尔缓冲区和姬姆萨染色的)。将载玻片上染色架。覆盖在姬姆萨染色液整个幻灯片。让载玻片保持在5分钟的染色溶液。
  4. 在蒸馏水中清洗玻片以相同的顺序,他们进行染色。使载玻片干燥约10分钟。幻灯片应完全干燥。
  5. 加入4滴Permount和盖玻片的幻灯片。确保有盖玻片下无气泡。过量Permount可以用纸巾除去。
  6. 根据10倍和100倍的放大倍率光学显微镜分析细胞。调整基于所述第一滑动件的结果的幻灯片的其余部分的胰蛋白酶定时。

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Representative Results

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高品质的中期息差的染色体分析是必不可少的。一个成功的试验产生的染色体这是很好的传播合适的染色体形态和。正确的G-带染色体包含的特征光与暗的条纹图案。

图1
图1:一个成功的染色体蔓延,其中染色体平均长度,以及传播,很容易从一个另一个可辨,和光与暗带之间有足够的对比度,良好的染色体形态允许个体染色体和评估的鉴定表明任何重排染色体不稳定。

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Discussion

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我们已经利用本程序为从各种生物体,包括从人获得的各种细胞类型,恒河猴,大鼠和小鼠11,20-22的细胞染色体隔离。标准协议提供的,但某些关键步骤和变量,可能需要调整细胞这些不同的类型。几个具体的步骤是关键的染色体制备和G带,以确保结果的可能的最佳质量两者。一种可影响测定的变量是秋水仙胺孵育时间。时间在秋水仙胺不足会产生更少的中期扩展和更长的,重叠的染色体。在秋水仙胺较长的温育时间将导致更短和更厚的染色体这是难以分析。另一个重要变量是低渗溶液的摩尔浓度。一个0.075M的氯化钾溶液会膨胀的细胞就足以产生正确的染色体蔓延,没有裂解细胞。同时加入该卡诺固定液溶液中,第一5毫升必须被添加到该沉淀,同时混合。这确保了所有多余的蛋白质储存的样品制备或幻灯片之前被除去。如果在该单元未充分混合足够的情况下,为黄色蛋白帽将形成的沉淀物的顶部,在随后的程序,这可能导致的并发症。

适当的滑动制剂是必要的。而去掉了重悬细胞沉淀在载玻片上,确保该滑动倾斜约45°角,并有足够的距离(至少2英寸)从滴管向滑动,以使染色体能够适当地分散到幻灯片进行分析。洪水与固定液紧随到幻灯片丢弃细胞幻灯片也将有助于染色体蔓延。的温度和湿度,从而影响多快的细胞悬浮液干燥到幻灯片上,都是影响染色体扩散的其他因素。这些可以是通过在约50%的湿度和大约20-25℃的温度的环境中使用幻灯片的控制,和/或通过将载玻片上的滑动套更快的干燥。对于G显带,影响染色体的质量的主要因素是胰蛋白酶的曝光时间。具有较长的胰蛋白酶接触,染色体可能会出现扩散和肿胀。相反,一个充分短潜伏期的胰蛋白酶将产生染色体有没有区别乐队和对比度很小。胰蛋白酶孵育时间可能会改变这取决于每个特定细胞系和收获条件。因此,有代表性的G-带滑动时,应先将准备染色的幻灯片的其余部分之前,评估胰蛋白酶的条件。胎牛血清用于染色前灭活胰蛋白酶活性。我们提供一种使用吉姆萨(GTG)的协议,但也可以用来代替吉姆萨瑞氏染色为GTW带和产率相似的结果。

吨“>此过程是相对便宜和有效的执行。G显带,可用于诊断染色体异常,如易位,缺失和非整倍性的常见于恶性肿瘤,遗传性疾病,和干细胞的体外培养10,11 ,13,这提供了染色体结构和在多个小区中的整个基因组的全局评价的不可缺少的可视化。它是常用于临床和研究实验室中使用全世界癌症细胞10。产前诊断,预后和治疗的评价产后组织样品例行评估的引起的遗传性疾病如唐氏综合征数值和结构异常的识别。干细胞能够迅速地评估染色体不稳定性的存在,然而,G显带的分辨率的识别被限制看到在METAS微缺失或复杂的染色体异常塔蒂奇恶性肿瘤。

因此,当常规染色体G显带的补充,如荧光原位杂交(FISH),比较基因组杂交(CGH)和光谱核型分析(SKY)的程序,染色体异常的检出率显着增加23。出于这个原因,在与这些分子细胞遗传学方法结合了本协议的使用率正越来越多地在这两个临床和研究设置13-15采用不同的实验室进行染色体不稳定性的评估。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

在这个手稿中描述的工作成为可能,从帕特里克F.泰勒基金会的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KaryoMAX Colcemid Gibco 15212-012
HBSS Buffer Gibco 24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x Gibco 15400-054
Permount Fisher Scientific SP15-100
Buffer Tablets "GURR" Gibco 10580-013
Geimsa Stain Ricca Chemical Company 3250-16
Centrifuge 5810 Eppendorf
Methanol Caledon Laboratory Chemicals 6700130
Glacial Acetic Acid Krackeler Scientific Inc. 11-9508-05

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Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).More

Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).

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