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Biology

Chromosome Préparation partir des cellules cultivées

doi: 10.3791/50203 Published: January 28, 2014

Summary

Les chromosomes peuvent être isolés à partir de cellules vivantes telles que des lymphocytes ou des fibroblastes de la peau, et à partir d'organismes, y compris les humains et les souris. Ces préparations de chromosomes peuvent en outre être utilisés pour G-banding routine et les procédures de cytogénétique moléculaire telles que l'hybridation fluorescente in situ (FISH), l'hybridation génomique comparative (CGH), et le caryotype spectral (SKY).

Abstract

Chromosome (cytogénétique) analyse est largement utilisée pour la détection de l'instabilité chromosomique. Lorsque suivi par G-banding et techniques moléculaires tels que l'hybridation fluorescente in situ (FISH), ce test a l'avantage de pouvoir analyser des cellules individuelles pour les aberrations qui impliquent des gains ou des pertes de portions du génome et des réarrangements impliquant un ou plusieurs chromosomes. Chez l'homme, des anomalies chromosomiques surviennent chez environ 1 pour 160 naissances vivantes 1,2, 60-80% de toutes les fausses couches 3,4, 10% des mortinaissances 2,5, 13% des personnes ayant une maladie cardiaque congénitale 6, 3-6% des cas d'infertilité 2, et chez de nombreux patients atteints de déficience intellectuelle et des malformations congénitales 7. L'analyse cytogénétique des tumeurs malignes est couramment utilisé par les chercheurs et les cliniciens, comme il a été démontré observations d'anomalies chromosomiques clonales à avoir à la fois une signification diagnostique et pronostique 8,9.60, l'isolement de chromosomes est inestimable pour la thérapie génique et les cellules souche d'organismes y compris les primates non humains et les rongeurs 10-13.

Les chromosomes peuvent être isolés à partir de cellules de tissus vivants, notamment des lymphocytes de sang, les fibroblastes de la peau, les cellules amniotiques, le placenta, la moelle osseuse, et des échantillons de tumeur. Les chromosomes sont analysées au stade de la métaphase de la mitose, quand ils sont les plus condensées et donc plus visible. La première étape de la technique d'isolement du chromosome implique la rupture des fibres du fuseau par incubation avec Colcemid, pour empêcher les cellules de passer à l'étape ultérieure de l'anaphase. Les cellules sont ensuite traitées avec une solution hypotonique et conservés dans leur état gonflé, avec le fixateur de Carnoy. Les cellules sont ensuite déposés sur de diapositives et peuvent ensuite être utilisés pour une variété de procédures. G-banding implique un traitement à la trypsine suivie d'une coloration au Giemsa à créer de la lumière caractéristique et bandes sombres. Le même procedure pour isoler les chromosomes peuvent être utilisés pour la préparation de cellules pour des procédures telles que l'hybridation in situ par fluorescence (FISH), l'hybridation génomique comparative (CGH), et le caryotypage spectral (SKY) 14,15.

Introduction

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L'analyse des chromosomes est une technique classique utilisée dans le monde entier pour diagnostiquer l'instabilité chromosomique et réarrangements conduisant à des troubles génétiques et cancer 1,2,8,9. En outre, une résolution plus élevée pour le diagnostic et la recherche d'anomalies génétiques constitutionnels et cancer acquis peut être réalisé avec la combinaison des procédures cytogénétique classique et des méthodes de cytogénétique moléculaire telles que l'hybridation fluorescente in situ (FISH), l'hybridation génomique comparative (CGH) , et le caryotype spectral (SKY) 14,15. Plus récemment, ces techniques ont été utilisées pour l'évaluation de l'instabilité chromosomique associée à la recherche sur les cellules souches. Anomalies caryotypiques telles que l'aneuploïdie des cellules en culture à long terme embryonnaires (ES) et des cellules souches adultes de divers organismes ont été rapportés par plusieurs laboratoires. Les données récentes confirment que certaines lignées cellulaires sont par nature plus enclins à chromosome instabilité, indépendamment des conditions de culture. Pour cette raison, lors de l'établissement et / ou le maintien de lignées de cellules souches rhésus humain, une souris ou, une analyse chromosomique est recommandé dans le cadre du processus de contrôle de la qualité. De nombreux rapports décrivent l'intérêt croissant pour l'utilisation de la cytogénétique et moléculaire de routine pour surveiller la stabilité chromosomique de cellules souches et de cellules malignes ou de divers organismes en culture de 10 à 13. Ces protocoles sont de plus en plus utilisés par des laboratoires non génétiques pour l'évaluation chromosomique rapide de leurs cellules en culture 13. Nous présentons nos procédures de base pour la préparation des chromosomes de différents types de cellules, qui peuvent être appliquées à des fins et des cellules cliniques et de recherche provenant de divers organismes.

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Protocol

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Une. Chromosome récolte de cellules adhérentes

  1. Protocole standard
    1. Cultiver des cellules selon les conditions particulières de culture cellulaire. Lorsque les cellules ont atteint la phase logarithmique (80% de confluence), ajouter 10 ul / ml de Colcemid dans le ballon de culture de cellules. Un minimum de 2 x 10 6 cellules est recommandée.
    2. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant 45 min. En utilisant une pipette stérile, transférer médias de cellules dans un tube de 15 ml conique. Mettre de côté.
    3. Lavez délicatement les cellules en ajoutant 2 ml de HBSS tampon dans le flacon. Tampon tourbillon puis retirez à l'aide d'une pipette. Jeter.
    4. Ajouter 1 ml de trypsine, en veillant à ce qu'il couvre toute la surface du flacon. Ne laisser que les cellules de la trypsine pendant environ 2 min. Une fois que la majorité des cellules ont détaché, la pipette les médias dans le tube conique en arrière sur les cellules.
    5. Transférer la suspension cellulaire en aliquotes de 10 ml dans des tubes de 15 ml coniques.Centrifuger à 200 g pendant 10 min. Retirer le surnageant et remettre le culot.
    6. Ajouter 10 ml de 0,075 M de KCl, qui a été préchauffée à 37 ° C et le culot restant dans le tube conique. Vortex à vitesse moyenne pour mélanger KCl et cellules.
    7. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 10 min. Centrifuger à 200 g pendant 5 min à 25 ° C. Retirer le surnageant (jusqu'à environ 0,5 ml restes) et remettre le culot.
    8. Ajouter avec précaution 5 ml de fixateur de Carnoy frais (3:1 de méthanol: acide acétique glacial) pour les cellules tout en vortex. Ajouter ensuite 5 ml de fixateur sans plus de vortex pour un total de 10 ml.
    9. Centrifuger à 200 g pendant 5 min. Éliminer les cellules surnageant et remettre en suspension. Ajouter 5 ml de fixateur dans chaque tube.
    10. Centrifuger à 200 g pendant 5 min. Éliminer les cellules surnageant et remettre en suspension. Ajouter 5 ml de fixateur dans chaque tube. Les cellules peuvent à présent être stockées dans le 4 ° C pendant jusqu'à un an.
  2. Modification du protocole: harvesti chromosomiquesng de lignées de cellules lymphoblastoïdes
    1. Cultiver des cellules selon les conditions particulières de culture cellulaire. (Utilisez le flacon approprié pour la quantité de cellules mises en culture). Lorsque les cellules ont atteint la phase logarithmique (environ 2 jours après les cellules sont split), ajouter 10 ul / ml de Colcemid dans le ballon de culture de cellules.
  3. Modification du protocole: Chromosome récolte du sang total
    Phytohémagglutinine (PHA), un dérivé de la lectine de haricot rouge, est un puissant agent mitogene pour les cellules T humaines 16. 72 h après l'addition de PHA à la culture, environ 45% des cellules sont en phase S. Cela représente le pic d'activité mitotique, et est le point optimal pour la récolte pour les études de chromosomes. D'autres agents mitogènes tels que la phytolaque (1-10 pg / ml) peuvent être utilisés dans l'analyse de cellules B 17,18.
    1. Prélever au moins 1 ml de sang total dans un tube à héparine de sodium top vert. Utiliser dans les 3 jours suivant la collecte. sang de magasin à la température ambiante nontil prêt à l'emploi.
    2. Aliquote de 0,25 ml de sang total dans 10 ml de milieu RPMI complet contenant de la L-glutamine (sérum de veau fœtal à 20%, 1% de pénicilline / streptomycine, 1% de fungizone et 1% de PHA). Culture à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  4. Modification du protocole: Chromosome récolte de moelle osseuse
    L'analyse cytogénétique de la moelle osseuse est utile dans de nombreux troubles hématologiques malignes comme l'observation d'un clone de chromosome anormal peut être de diagnostic pour un type spécifique de la leucémie. Des études chromosomiques sont également utilisés pour évaluer la progression de la maladie telle que l'apparition d'une crise blastique et la réponse au traitement. Comme les cellules de la moelle osseuse se divisent activement, aucune stimulation mitogène est nécessaire 9,19. Pour les leucémies aiguës 24 et 48 h cultures sont également mis en place.
    1. Prélever au moins 1 ml de moelle osseuse dans un tube à héparine de sodium top vert. Aliquote de 0,25 ml de la moelle osseuse dans 10 ml de milieu RPMI complet contenant de la L-glutamine (20% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline / streptomycine, 1% Fungizone). Culture à 37 ° C avec 5% de CO 2.

2. Glisser Préparation et coloration solide

Une évaluation rapide d'une diapositive représentant fournira des informations sur la qualité de la récolte avant de continuer à d'autres procédures telles que G-banding, FISH, CGH, ou SKY. Certains laboratoires préfèrent tache solide, les cellules de récolte rapide et de l'évaluation de chromosome. En variante, un microscope à contraste de phase peut être utilisé pour cette analyse. Les lames sont préparés au mieux lorsque le taux d'humidité est d'environ 50% et la température ambiante de (20 à 25 ° C).

  1. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min à 25 ° C. Retirer le surnageant jusqu'à seulement 0,3-0,5 ml restes.
  2. Après remise en suspension doucement la pastille, pipettes trois gouttes de la suspension de cellules à partir d'une distance d'environ 2 à sur une lame qui est incliné à un angle d'environ 45 ° et permettre à la suspensionà rouler à travers la diapositive. Ajoutez une grosse goutte de fixateur de Carnoy frais à la diapositive.
  3. Sécher le dos de la lame sur une serviette en papier, puis reposer la diapositive à sécher pendant au moins 10 min. La lame doit être complètement sec.
  4. Préparer une nouvelle solution de coloration Giemsa (3:1 ratio de tampon Gurr et Giemsa). Placer les lames sur un support de coloration. Couvrir l'ensemble de la diapositive dans la solution de coloration de Giemsa. Que les glissières restent dans la solution de coloration pendant 5 min. Rincer les lames avec de l'eau distillée, les égoutter et laisser sécher à l'air.
  5. Ajouter 4 gouttes de Permount et une lamelle sur la lame. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles sous la lamelle. L'excédent Permount peut être enlevé avec une serviette en papier.
  6. Analyser les cellules avec un microscope optique à 10X et 100X. Si les cellules en métaphase sont abondants et bon étalement, les lames restantes peuvent être utilisées pour d'autres procédures expérimentales.

3. G-baguage utilisant de la trypsine et Giemsa (GTG)

<p> La trypsine est une enzyme protéolytique qui dénature euchromatiques histones dans des régions d'ADN avec une activité transcriptionnelle plus élevée qui en résulte. Après Giemsa, ces régions apparaissent comme des bandes claires. Chromatine fortement condensée avec l'activité transcriptionnelle peu ou pas (hétérochromatine) aura une grande partie de ses histones protégées à partir de la trypsine et ne sera donc tache sombre suivant la coloration de Giemsa. Il est essentiel de d'abord la bande G une diapositive à surveiller les conditions et ajuster le calendrier de la trypsine si nécessaire pour les diapositives suivantes.

  1. Ajouter les solutions suivantes pour 4 jarres de Coplin.
    Pot # 1 = 30 ml de HBSS 1x et 4 ml de 10x la trypsine (0,5%)
    Pot n ° 2 = 50 ml de HBSS 1x
    Pot n ° 3 = 45 ml de HBSS 1x et 5 ml de sérum foetal bovin
    Pot n ° 4 = 50 ml de HBSS 1x
  2. Plongez chaque diapositive dans le pot n ° 1 pendant 5 sec, rinçage rapide dans le pot n ° 2, laisser chaque diapositive dans le pot n ° 3 pendant au moins 30 secondes, rinçage rapide dans le pot n ° 4 puis laissez lames sécher.
  3. Préparer fresh Giemsa Solution (3:1 de tampon Gurr et Giemsa). Placer les lames sur un support de coloration. Couvrir l'ensemble de la diapositive dans la solution de coloration de Giemsa. Que les glissières restent dans la solution de coloration pendant 5 min.
  4. Rincer les lames dans de l'eau distillée dans le même ordre qu'ils ont été colorées. Laisser les lames sécher pendant environ 10 min. La lame doit être complètement sec.
  5. Ajouter 4 gouttes de Permount et une lamelle sur la lame. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles sous la lamelle. L'excédent Permount peut être enlevé avec une serviette en papier.
  6. Analyser les cellules avec un microscope optique à 10X et 100X. Ajuster la trypsine synchronisation du reste des diapositives sur la base des résultats de la première glissière.

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Representative Results

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Métaphase écarts de qualité sont essentiels pour l'analyse des chromosomes. Un test réussi donne chromosomes qui sont bien répartis et de la morphologie des chromosomes approprié. Chromosomes correctement G-bagués contiennent la lumière caractéristique et profils de bandes sombres.

Figure 1
Figure 1. Un étalement chromosomique réussie dans laquelle les chromosomes sont de longueur moyenne, bien répartie et facilement discernables les uns des autres, et un contraste suffisant entre la lumière et des bandes sombres. Bonne morphologie des chromosomes permet l'identification des chromosomes et l'évaluation individuelles pour toutes les réarrangements indicatifs de l'instabilité chromosomique.

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Discussion

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Nous avons utilisé la présente procédure pour l'isolement du chromosome à partir de cellules de différents organismes, y compris divers types de cellules obtenues à partir de l'homme, les macaques rhésus, les rats, les souris et les 11,20-22. Le protocole standard est fourni, mais peut être ajustée pour ces divers types de cellules certaines étapes et variables clés. Plusieurs mesures spécifiques sont indispensables à la fois dans la préparation chromosomique et G-bandes pour assurer la meilleure qualité possible des résultats. L'une des variables qui peuvent affecter le dosage est le temps d'incubation Colcemid. Manque de temps en Colcemid génère moins de marges de métaphase et plus, les chromosomes se chevauchent. De plus longs temps d'incubation dans Colcemid entraîneront chromosomes court et épais qui sont difficiles à analyser. Une autre variable importante est la molarité de la solution hypotonique. Une solution de chlorure de potassium 0,075 M va gonfler les cellules juste assez pour donner chromosome bon étalement, sans lyse des cellules. Tout en ajoutantLa solution de fixateur de Carnoy l', les 5 premiers ml doit être ajouté à la pastille tout en mélangeant. Cela garantit que toutes les protéines supplémentaires sont retirés avant de stocker les échantillons ou préparer des lames. Si dans le cas où les cellules ne sont pas suffisamment bien mélangés, un capuchon de protéine jaune se forme sur le dessus de la pastille, ce qui peut entraîner des complications pendant les procédures suivantes.

Préparation de la lame appropriée est essentielle. Tout en abandonnant le culot cellulaire remis en suspension sur des lames, assurez-vous que la lame est inclinée à environ un angle de 45 ° et il est assez loin (au moins 2 pouces) à partir du compte-gouttes à la diapositive de sorte que les chromosomes peuvent bien se disperser sur la lame pour analyse . Inondant la diapositive avec un fixateur immédiatement après l'abandon des cellules sur la lame aidera également les chromosomes se propager. Température et l'humidité, qui affectent la rapidité de la suspension cellulaire sèche à la diapositive, sont d'autres facteurs qui influent sur le chromosome propagation. Ceux-ci peuvent être commandé par la préparation de diapositives dans un milieu à environ 50% d'humidité et une température d'environ 20-25 ° C, et / ou en plaçant les lames sur une lame chaude pour accélérer le séchage. G-baguage, le principal facteur qui influe sur la qualité des chromosomes est le temps d'exposition de la trypsine. Avec une exposition plus trypsine, les chromosomes peuvent apparaître diffuse et gonflé. Inversement, une incubation de la trypsine insuffisamment courte donnera chromosomes avec des bandes indiscernables et peu de contraste. Le calendrier d'incubation de la trypsine est sous réserve de modification en fonction de chaque lignée cellulaire spécifique et des conditions de récolte. Par conséquent, un toboggan G-bandes représentant devrait être le premier prêt à évaluer les conditions de la trypsine avant la coloration du reste des diapositives. Sérum fœtal bovin est utilisé pour inactiver l'activité de la trypsine avant la coloration. Nous fournissons le protocole utilisant Giemsa (GTG), mais la coloration de Wright peut être utilisé à la place de Giemsa pour GTW baguage et donne des résultats similaires.

t "> Cette procédure est relativement peu coûteux et efficace d'effectuer. bandes G peut être utilisé pour diagnostiquer des anomalies chromosomiques telles que les translocations, les suppressions et aneuploïdie qui sont fréquemment observées dans les tumeurs malignes, les maladies génétiques, et les cellules souches cultivées in vitro 10,11 , 13. Ceci permet la visualisation indispensable de la constitution chromosomique et l'évaluation globale de l'ensemble du génome dans les cellules multiples. Il est couramment utilisé dans les laboratoires cliniques et de recherche à travers le monde pour le diagnostic, le pronostic et l'évaluation thérapeutique des cellules cancéreuses 10. prénatales et des échantillons de tissu post-nataux sont couramment évalués pour l'identification des anomalies numériques et structurelles qui provoquent des troubles génétiques tels que le syndrome de Down. cellules souches peuvent être évaluées rapidement la présence de l'instabilité chromosomique. Cependant, la résolution de G-banding est limitée pour l'identification de microdélétions ou des anomalies chromosomiques complexes comme vu dans metasmalignes Tatic.

Par conséquent, lorsque le chromosome routine bandes G est complétée par des procédures telles que l'hybridation fluorescente in situ (FISH), l'hybridation génomique comparative (CGH), et le caryotype spectral (SKY), les taux d'anomalies chromosomiques de détection sont considérablement augmenté 23. Pour cette raison, l'utilisation de la présente protocole en combinaison avec ces autres procédures de cytogénétique moléculaire est de plus en plus utilisée par les différents laboratoires pour l'évaluation de l'instabilité chromosomique dans les deux cliniques et de recherche mise en 13-15.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Travaux décrits dans ce manuscrit a été rendue possible grâce au financement de la Fondation Patrick F. Taylor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KaryoMAX Colcemid Gibco 15212-012
HBSS Buffer Gibco 24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x Gibco 15400-054
Permount Fisher Scientific SP15-100
Buffer Tablets "GURR" Gibco 10580-013
Geimsa Stain Ricca Chemical Company 3250-16
Centrifuge 5810 Eppendorf
Methanol Caledon Laboratory Chemicals 6700130
Glacial Acetic Acid Krackeler Scientific Inc. 11-9508-05

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Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).More

Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).

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