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Biology

Cromosoma Preparazione da cellule in coltura

doi: 10.3791/50203 Published: January 28, 2014

Summary

I cromosomi possono essere isolate da cellule vive come linfociti o fibroblasti cutanei, e da organismi compresi gli esseri umani o topi. Queste preparazioni cromosomiche possono essere ulteriormente utilizzati per routine di G-banding e le procedure di citogenetica molecolare quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY).

Abstract

Cromosoma (citogenetica) analisi è ampiamente utilizzato per il rilevamento di instabilità cromosomica. Quando seguito da G-banding e le tecniche molecolari come ibridazione in situ fluorescente (FISH), questa analisi ha la potente capacità di analizzare le singole celle per le aberrazioni che coinvolgono gli utili o le perdite di porzioni del genoma e riarrangiamenti che coinvolgono uno o più cromosomi. Negli esseri umani, anomalie cromosomiche si verificano in circa 1 ogni 160 nati vivi 1,2, il 60-80% di tutti gli aborti spontanei 3,4, il 10% dei nati morti 2,5, il 13% degli individui con malattia cardiaca congenita 6, 3-6% dei casi di infertilità 2, e in molti pazienti con ritardo dello sviluppo e difetti di nascita 7. Analisi citogenetica di malignità è abitualmente utilizzato dai ricercatori e clinici, come osservazioni di anomalie cromosomiche clonali hanno dimostrato di avere sia un significato diagnostico e prognostico 8,9.60; isolamento Cromosoma è prezioso per la terapia genica e la ricerca sulle cellule staminali degli organismi inclusi primati non umani e roditori 10-13.

I cromosomi possono essere isolate da cellule di tessuti vivi, compresi i linfociti del sangue, fibroblasti cutanei, amniociti, placenta, midollo osseo, e campioni tumorali. I cromosomi sono analizzati nella fase metafase della mitosi, quando sono più condensati e quindi più visibile. Il primo passo della tecnica di isolamento cromosoma comporta la rottura delle fibre del fuso mediante incubazione con Colcemid, per evitare che le cellule di procedere alla fase successiva anafase. Le cellule sono poi trattate con una soluzione ipotonica e conservati nel loro stato gonfio di fissativo di Carnoy. Le cellule vengono poi trascinati nella vetrini e possono quindi essere utilizzati per una varietà di procedure. G-banding comprende il trattamento tripsina seguita da colorazione con Giemsa per creare luce caratteristico e bande scure. Lo stesso procedure isolare cromosomi può essere utilizzato per la preparazione di cellule per procedure quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY) 14,15.

Introduction

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Analisi cromosomica è una tecnica tradizionale utilizzata in tutto il mondo per diagnosticare instabilità cromosomica e riarrangiamenti che portano a malattie genetiche e tumori maligni 1,2,8,9. Inoltre, una risoluzione maggiore per la diagnosi e la ricerca di anomalie genetiche e costituzionali cancro acquisita può essere realizzato con la combinazione delle procedure citogenetiche classiche e metodologie citogenetiche molecolari come ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH) , e cariotipo spettrale (SKY) 14,15. Più recentemente, queste tecniche sono state utilizzate per la valutazione di instabilità cromosomica associata ricerca sulle cellule staminali. Anomalie del cariotipo come aneuploidia di cellule in coltura a lungo termine embrionali (ES) e cellule staminali di diversi organismi sono stati riportati da diversi laboratori. Recenti evidenze sostiene che alcune linee cellulari sono intrinsecamente più inclini al cromosoma instabilità indipendentemente dalle condizioni di coltura. Per questo motivo, al momento di stabilire e / o il mantenimento di linee di cellule staminali umane Rhesus, mouse, o, analisi cromosomica è raccomandata come parte del processo di controllo di qualità. Molti rapporti descrivono il crescente interesse per l'uso di routine e citogenetica molecolare per monitorare la stabilità cromosomica di cellule staminali e cellule maligne o vari organismi in coltura 10-13. Questi protocolli sono sempre più utilizzati dai laboratori non genetici per una rapida valutazione cromosomica delle loro cellule in coltura 13. Presentiamo nostre procedure di base per la preparazione cromosoma da vari tipi di cellule, che possono essere applicate per entrambi gli scopi e le cellule clinici e di ricerca derivati ​​da vari organismi.

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Protocol

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1. Cromosoma raccolta di cellule aderenti

  1. Protocollo standard
    1. Crescere le cellule in base alle specifiche condizioni di coltura delle cellule. Quando le cellule hanno raggiunto la fase logaritmica (80% di confluenza), aggiungere 10 microlitri / ml di Colcemid al pallone di coltura cellulare. Si raccomanda un minimo di 2 x 10 6 cellule.
    2. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 45 min. Usando una pipetta sterile, trasferire file multimediali da cellule in una provetta da 15 ml. Mettere da parte.
    3. Lavare delicatamente le cellule aggiungendo 2 ml di HBSS tampone nel pallone. Tampone Swirl e poi rimuovere con una pipetta. Scartare.
    4. Aggiungere 1 ml di tripsina, assicurando che copre l'intera superficie del pallone. Lasciare solo le cellule in tripsina per circa 2 min. Una volta che la maggior parte delle cellule sono distaccato, pipettare i media nel tubo conico indietro sulle cellule.
    5. Trasferire la sospensione cellulare in aliquote da 10 ml in provette da 15 ml coniche.Centrifugare a 200 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet.
    6. Aggiungere 10 ml di 0,075 M KCl preriscaldata a 37 ° C al pellet rimasto nel tubo conico. Tubo Vortex a velocità media per mescolare KCl e le cellule.
    7. Incubare le cellule a 37 ° C per 10 min. Centrifugare a 200 xg per 5 min a 25 ° C. Rimuovere il surnatante (fino a circa 0,5 ml resti) e risospendere pellet.
    8. Aggiungere con cautela 5 ml di fissativo fresco di Carnoy (3:1 rapporto di metanolo: acido acetico glaciale) alle cellule, mentre vortex. Aggiungere quindi 5 ml più di fissativo, senza vortex per un totale di 10 ml.
    9. Centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e sospendere nuovamente. Aggiungere 5 ml di fissativo ad ogni provetta.
    10. Centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e sospendere nuovamente. Aggiungere 5 ml di fissativo ad ogni provetta. Le cellule possono essere conservate a 4 ° C fino ad un anno.
  2. Modifica del protocollo: harvesti cromosoming di linee cellulari linfoblastoidi
    1. Crescere le cellule in base alle specifiche condizioni di coltura delle cellule. (Usa pallone appropriato per la quantità di cellule in coltura). Quando le cellule hanno raggiunto la fase logaritmica (circa 2 giorni dopo le cellule sono split), aggiungere 10 microlitri / ml di Colcemid al pallone di coltura cellulare.
  3. Modifica del protocollo: Cromosoma raccolta da sangue intero
    Fitoemoagglutinina (PHA), una lectina derivato dal fagiolo rosso, è un potente mitogeno per le cellule T umane 16. 72 ore dopo l'aggiunta di PHA alla cultura, circa il 45% delle cellule sono in fase S. Questo rappresenta il picco di attività mitotica, ed è il punto ottimale in cui per raccogliere per gli studi cromosomici. Altri mitogeni come pokeweed (1-10 mg / ml) possono essere utilizzati nell'analisi cellule B 17,18.
    1. Raccogliere almeno 1 ml di sangue intero in una parte superiore del tubo di sodio eparina verde. Usare entro 3 giorni dopo la raccolta. Sangue Conservare a temperatura ambiente delle Nazioni Unitetil pronto all'uso.
    2. Aliquotare 0,25 ml di sangue intero in 10 ml di mezzi RPMI completo contenente L-glutammina (siero fetale bovino 20%, 1% di penicillina / streptomicina, 1% fungizone, e 1% PHA). Coltura a 37 ° C con 5% di CO 2.
  4. Modifica del protocollo: Cromosoma raccolta dal midollo osseo
    Analisi citogenetica sul midollo osseo è utile in molti disturbi ematologici maligni come l'osservazione di un clone cromosomicamente anormale può essere diagnostica per un tipo specifico di leucemia. Studi cromosomiche sono utilizzati anche per valutare la progressione della malattia, come l'insorgenza di crisi blastica e risposta al trattamento. Poiché le cellule del midollo osseo sono attivamente dividono, nessuno stimolo mitogeno è necessaria 9,19. Per le leucemie acute 24 e 48 hr culture sono anche impostati.
    1. Raccogliere almeno 1 ml di midollo osseo in una parte superiore del tubo di sodio eparina verde. Aliquotare 0,25 ml di midollo osseo in 10 ml di mezzi RPMI completo contenente L-glutammina (20% di siero bovino fetale, 1% di penicillina / streptomicina, 1% fungizone). Coltura a 37 ° C con 5% di CO 2.

2. Presentazione Preparazione e colorazione Solid

Una rapida valutazione di una diapositiva rappresentante fornirà informazioni sulla qualità del raccolto prima di procedere ad ulteriori procedure come G-banding, FISH, CGH, o SKY. Alcuni laboratori preferiscono macchia solida alle cellule per la raccolta rapida e la valutazione dei cromosomi. In alternativa, un microscopio a contrasto di fase può essere utilizzata per questa analisi. I vetrini sono meglio preparati quando l'umidità è circa il 50% e la temperatura ambiente (20-25 ° C).

  1. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min a 25 ° C. Rimuovere il surnatante fino a soli 0,3-0,5 ml resti.
  2. Dopo aver risospeso delicatamente i pellet, pipette tre gocce della sospensione di cellule da una distanza di circa 2 in su un vetrino che è inclinato di un angolo di circa 45 ° e consentire la sospensionerotolare attraverso la diapositiva. Aggiungere una grossa goccia di fissativo fresco di Carnoy alla diapositiva.
  3. Asciugare il retro del vetrino su un tovagliolo di carta e poi sedersi il vetrino ad asciugare per almeno 10 min. La slitta deve essere completamente asciutto.
  4. Preparare fresco Giemsa soluzione (rapporto 3:1 di Gurr Buffer e Giemsa). Porre i vetrini in un rack per colorazione. Coprire l'intera diapositiva nella soluzione colorante Giemsa. Lasciare che i vetrini rimangono nella soluzione colorante per 5 min. Sciacquare i vetrini con acqua distillata, drenare, e lasciare asciugare.
  5. Aggiungere 4 gocce di Permount e un vetrino alla diapositiva. Assicurarsi che non vi siano bolle sotto il vetrino. L'eccesso Permount può essere rimosso con un tovagliolo di carta.
  6. Analizzare le cellule con un microscopio ottico sotto 10X e 100X ingrandimento. Se le cellule in metafase sono abbondanti e ben diffusione, le diapositive rimanenti possono essere utilizzati per altre procedure sperimentali.

3. G-Banding Uso tripsina e Giemsa (GTG)

<p> La tripsina è un enzima proteolitico che denatura istoni eucromatiche nelle regioni del DNA con l'attività trascrizionale maggiore risultante. A seguito di Giemsa, queste regioni appariranno come bande luminose. Cromatina altamente condensato con poca o nessuna attività trascrizionale (eterocromatina) avrà un gran parte delle sue istoni protette dalla tripsina e pertanto macchia scura seguente Giemsa. È essenziale inizialmente G-band una diapositiva a monitorare le condizioni e regolare la temporizzazione tripsina se necessario per le diapositive successive.

  1. Aggiungere le seguenti soluzioni a 4 vaschette Coplin.
    Jar # 1 = 30 ml di 1x HBSS e 4 ml di tripsina 10x (0,5%)
    Jar # 2 = 50 ml di 1x HBSS
    Jar ° 3 = 45 ml di 1x HBSS e 5 ml di siero fetale bovino
    Jar # 4 = 50 ml di 1x HBSS
  2. Immergere ogni diapositiva in Jar # 1 per 5 secondi, rapido risciacquo in Jar # 2, lasciare ogni diapositiva in Jar # 3 per almeno 30 secondi, rapido risciacquo in Jar # 4 poi permettono vetrini si asciughino.
  3. Preparare fresh Giemsa colorazione Solution (rapporto 3:1 di Gurr Buffer e Giemsa). Porre i vetrini in un rack per colorazione. Coprire l'intera diapositiva nella soluzione colorante Giemsa. Lasciare che i vetrini rimangono nella soluzione colorante per 5 min.
  4. Sciacquare i vetrini in acqua distillata nello stesso ordine in cui erano macchiate. Lasciare i vetrini ad asciugare per circa 10 min. La slitta deve essere completamente asciutto.
  5. Aggiungere 4 gocce di Permount e un vetrino alla diapositiva. Assicurarsi che non vi siano bolle sotto il vetrino. L'eccesso Permount può essere rimosso con un tovagliolo di carta.
  6. Analizzare le cellule con un microscopio ottico sotto 10X e 100X ingrandimento. Regolare la temporizzazione tripsina del resto delle diapositive sulla base dei risultati della prima slitta.

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Representative Results

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Spread metafase alta qualità sono essenziali per l'analisi cromosomica. Un test riuscito produce cromosomi che sono ben diffuse e di adeguata morfologia cromosoma. Cromosomi Correttamente G-banda contengono la luce caratteristico e modelli di bande scure.

Figura 1
Figura 1. Una diffusione cromosomico successo in cui i cromosomi sono di lunghezza media, ben distribuite e facilmente distinguibili l'uno dall'altro, e sufficiente contrasto tra bande chiare e scure. Buona cromosoma morfologia consente l'identificazione dei singoli cromosomi e valutazione di eventuali riarrangiamenti indicativi di instabilità cromosomica.

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Discussion

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Abbiamo utilizzato il presente procedimento per il cromosoma isolamento da cellule di vari organismi, tra cui vari tipi di cellule ottenute da umano, macachi Rhesus, ratti e topi 11,20-22. Il protocollo standard è disponibile, ma alcuni passaggi chiave e variabili potrebbe essere necessario regolare per questi diversi tipi di cellule. Diversi passaggi specifici sono cruciali sia nella preparazione cromosomica e G-bande per garantire la migliore qualità dei risultati. Una delle variabili che possono influenzare il test è il tempo di incubazione Colcemid. Tempo insufficiente in Colcemid produce meno spread metafase e più lunghi, cromosomi sovrapposti. Tempi di incubazione più lunghi in Colcemid provocheranno cromosomi più corti e più spessi che sono difficili da analizzare. Un'altra variabile importante è la molarità della soluzione ipotonica. Una soluzione di cloruro di potassio 0,075 M gonfierà le cellule appena sufficiente per produrre una corretta cromosoma diffusione, senza la lisi delle cellule. Mentre l'aggiunta diSoluzione fissativa del Carnoy, i primi 5 ml deve essere aggiunto al pellet durante la miscelazione. Questo assicura che tutte le proteine ​​supplementari vengono rimossi prima di riporre i campioni o preparare diapositive. Se nel caso in cui le cellule non sono mescolati abbastanza bene, un tappo proteina gialla formerà sopra il pellet, che può causare complicazioni durante le procedure successive.

Una preparazione adeguata diapositiva è essenziale. Mentre cadere il pellet cellulare risospeso su vetrini, assicurarsi che la diapositiva è inclinato di circa 45 ° di angolo e c'è una distanza sufficiente (almeno 2 pollici) dal contagocce alla diapositiva in modo che i cromosomi possono correttamente disperdere sul vetrino per l'analisi . Inondando il vetrino con fissativo subito dopo cadere le cellule al vetrino aiuterà anche i cromosomi a diffondersi. Temperatura e umidità, che influenzano la velocità con la sospensione cellulare asciuga al vetrino, sono altri fattori che influenzano la diffusione cromosoma. Questi possono essere controllata da preparare vetrini in un ambiente con circa il 50% di umidità e una temperatura di circa 20-25 ° C, e / o mettendo diapositive su un vetrino più caldo per essiccamento veloce. Per G-fasce, il fattore principale che influenza la qualità dei cromosomi sono i tempi di esposizione tripsina. Con una esposizione più lunga tripsina, i cromosomi possono apparire diffusa e gonfio. Viceversa, un inadeguato breve incubazione tripsina produrrà cromosomi con bande indistinguibili e poco contrasto. I tempi di incubazione tripsina è soggetta a cambiamento a seconda di ogni linea cellulare specifica e condizioni di raccolta. Pertanto, rappresentante scivolo G fasciato dovrebbe essere preparato prima di valutare le condizioni tripsina prima della colorazione del resto delle diapositive. Siero fetale bovino è utilizzato per inattivare l'attività tripsina prima della colorazione. Forniamo il protocollo con Giemsa (GTG), ma colorazione di Wright può essere utilizzato al posto di Giemsa per GTW banding e produce risultati simili.

t "> Questa procedura è relativamente poco costoso ed efficace per eseguire. G-banding può essere utilizzato per diagnosticare anomalie cromosomiche, quali le traslocazioni, delezioni, e aneuploidie che sono comunemente visti in tumori maligni, malattie genetiche, e le cellule staminali coltivate in vitro 10,11 , 13. Ciò fornisce la visualizzazione indispensabile della costituzione cromosomica e la valutazione globale dell'intero genoma in più celle. È comunemente usato nei laboratori clinici e di ricerca in tutto il mondo per la diagnosi, la prognosi e la valutazione terapeutica delle cellule tumorali 10. prenatale e campioni di tessuto postnatali sono regolarmente valutati per l'individuazione di anomalie numeriche e strutturali che causano malattie genetiche come la sindrome di Down. cellule staminali possono essere rapidamente valutati per la presenza di instabilità cromosomica. Tuttavia, la risoluzione del G-bande è limitata per l'identificazione di microdelezioni o anomalie cromosomiche complesse, come visto in METASneoplasie Tatic.

Pertanto, quando il cromosoma di routine G-banding è completato con procedure come ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY), tassi di rilevamento di anomalie cromosomiche sono aumentati drammaticamente 23. Per questo motivo, l'utilizzo del presente protocollo in combinazione con queste altre procedure citogenetica molecolare è sempre più utilizzato da laboratori diversi per la valutazione del cromosoma instabilità sia nella ricerca e clinica impostazione 13-15.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato reso possibile da un finanziamento della Fondazione Patrick F. Taylor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KaryoMAX Colcemid Gibco 15212-012
HBSS Buffer Gibco 24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x Gibco 15400-054
Permount Fisher Scientific SP15-100
Buffer Tablets "GURR" Gibco 10580-013
Geimsa Stain Ricca Chemical Company 3250-16
Centrifuge 5810 Eppendorf
Methanol Caledon Laboratory Chemicals 6700130
Glacial Acetic Acid Krackeler Scientific Inc. 11-9508-05

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Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).More

Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).

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