Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas

doi: 10.3791/50203 Published: January 28, 2014

Summary

Os cromossomas podem ser isolados a partir de células vivas, tais como linfócitos ou fibroblastos de pele, e a partir de organismos, incluindo seres humanos ou ratinhos. Estas preparações cromossômicas pode ser ainda utilizado para a rotina de bandamento G e procedimentos de citogenética molecular, como a hibridização fluorescente in situ (FISH), hibridização genômica comparativa (CGH), e cariotipagem espectral (SKY).

Abstract

Análise cromossómica (citogenética) é amplamente utilizado para a detecção de instabilidade cromossoma. Quando seguido por G-faixas e técnicas moleculares como a hibridização fluorescente in situ (FISH), este ensaio tem a poderosa capacidade de analisar células individuais para as aberrações que envolvem ganhos ou perdas de partes do genoma e rearranjos envolvendo um ou mais cromossomos. Nos seres humanos, anormalidades cromossômicas ocorrem em cerca de 1 a cada 160 nascidos vivos 1,2, 60-80% de todos os abortos espontâneos 3,4, 10% dos natimortos 2,5, 13% dos indivíduos com doença cardíaca congênita 6, 3-6% dos casos de infertilidade 2, e em muitos pacientes com atraso no desenvolvimento e defeitos de nascimento 7. A análise citogenética de malignidade é rotineiramente utilizado por pesquisadores e clínicos, como observações de anormalidades cromossômicas clonais foram mostrados para ter tanto significado diagnóstico e prognóstico 8,9.60; isolamento cromossomo é de valor inestimável para a terapia gênica e células-tronco de organismos, incluindo primatas não-humanos e roedores 10-13.

Os cromossomas podem ser isolados a partir de células de tecidos vivos, incluindo os linfócitos, fibroblastos da pele, amniócitos, placenta, da medula óssea e espécimes de tumor. Os cromossomas são analisados ​​na fase metafase da mitose, quando elas são mais condensada e, por conseguinte, mais claramente visíveis. O primeiro passo da técnica de isolamento cromossoma envolve o rompimento das fibras do fuso por incubação com Colcemida, para evitar que as células de prosseguir para a fase subsequente anafase. As células são, então, tratada com uma solução hipotónica e conservados no seu estado inchado com fixador de Carnoy. As células são, então, deixada cair sobre as lâminas e pode então ser utilizado para uma variedade de procedimentos. G-bandas envolve o tratamento de tripsina seguida de coloração com Giemsa para criar luz característica e faixas escuras. O mesmo procedure para isolar os cromossomas podem ser utilizados para a preparação de células para os procedimentos, tais como hibridação in situ fluorescente (FISH), a hibridação genómica comparativa (CGH) e cariotipagem espectral (CÉU) 14,15.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Análise cromossômica é uma técnica convencional utilizada em todo o mundo para diagnosticar instabilidade cromossômica e rearranjos que levam a desordens genéticas e malignidade 1,2,8,9. Além disso, uma maior resolução para o diagnóstico e pesquisa de anormalidades genéticas e adquiridas constitucionais-cancro pode ser conseguido com a combinação dos procedimentos citogenéticas clássicas e metodologias citogenética molecular, tais como hibridação in situ fluorescente (FISH), a hibridação genómica comparativa (CGH) e cariotipagem espectral (SKY) 14,15. Mais recentemente, estas técnicas têm sido utilizadas para a avaliação de instabilidade cromossoma associado com células estaminais. Anormalidades cariotípico tais como aneuploidia de células de longo prazo cultivadas embrionárias (ES) e células estaminais adultas de vários organismos têm sido relatados por vários laboratórios. Evidências recentes comprovam que algumas linhas de células são inerentemente mais inclinados ao cromossomo instabidade, independentemente das condições de cultivo. Por esta razão, ao estabelecer e / ou manutenção de linhas de células estaminais Rhesus humano, rato, ou, análise cromossômica é recomendado como parte do processo de controle de qualidade. Muitos relatórios descrevem o aumento do interesse na utilização de rotina e citogenética molecular para monitorar a estabilidade cromossómico de células estaminais e células malignas ou vários organismos em cultura 10-13. Estes protocolos são cada vez mais utilizados por laboratórios não genéticos para avaliação cromossômica rápida de suas células cultivadas 13. Nós apresentamos os procedimentos básicos para a preparação do cromossoma a partir de vários tipos de células, as quais podem ser aplicadas para ambos os fins e as células clínicos e de pesquisa provenientes de vários organismos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Cromossomo colheita de células aderentes

  1. Protocolo padrão
    1. Cultivar células de acordo com as condições específicas de cultivo celular. Quando as células atingiram fase logarítmica (80% de confluência), adicionar 10 ul / ml de Colcemid com o frasco de cultura de célula. Recomenda-se um período mínimo de 2 x 10 6 células.
    2. Incubar as células a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 durante 45 min. Usando uma pipeta estéril, transferir mídia a partir de células em um tubo de 15 ml. Ponha de lado.
    3. Lavar suavemente as células por adição de 2 ml de tampão de HBSS para o balão. Tampão do redemoinho e, em seguida, retire com uma pipeta. Descarte.
    4. Adicionar 1 ml de tripsina, assegurando que cobre toda a superfície do frasco. Apenas deixar as células em tripsina durante cerca de 2 min. Uma vez que a maioria das células têm destacado, pipetar os meios de comunicação do tubo cônico de volta para as células.
    5. Transferência da suspensão de células em 10 ml de partes alíquotas em tubos de 15 mL cónicos.Centrifugar a 200 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet.
    6. Adicionar 10 ml de 0,075 M de KCl, que foi pré-aquecido a 37 ° C e a pelete remanescente no tubo cónico. Tubo Vortex em velocidade média de misturar KCl e células.
    7. Incubar as células a 37 ° C durante 10 min. Centrifugar a 200 xg durante 5 min a 25 ° C. Remover o sobrenadante (até cerca de 0,5 ml restos) e ressuspender pellet.
    8. Adiciona-se cuidadosamente 5 ml de fixador de Carnoy fresco (proporção de 3:1 de metanol: ácido acético glacial) para as células, enquanto a vórtex. Em seguida, adicionar 5 ml de fixador mais sem vortex para um total de 10 ml.
    9. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Remover as células sobrenadante e ressuspender. Adicionar 5 ml de fixador para cada tubo.
    10. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Remover as células sobrenadante e ressuspender. Adicionar 5 ml de fixador para cada tubo. As células podem agora ser armazenados em 4 ° C, durante até um ano.
  2. Modificação de Protocolo: harvesti cromossômicasng de linhas de células linfoblastóides
    1. Cultivar células de acordo com as condições específicas de cultivo celular. (Use o frasco adequado para a quantidade de células em cultura). Quando as células atingiram fase logarítmica (cerca de 2 dias após as células são de divisão), adicionar 10 ul / ml de Colcemid com o frasco de cultura de célula.
  3. Modificação de Protocolo: colheita cromossomo do sangue total
    Fito-hemaglutinina (PHA), uma lectina a partir de derivados do feijão vermelho, é um mitogénio potente para as células T humanas 16. 72 horas após a adição da PHA para a cultura, a cerca de 45% das células estão em fase S. Isto representa o pico de atividade mitótica, e é o ponto ideal em que a colheita para os estudos cromossômicos. Outros mitogenos como pokeweed (1-10 ug / ml) pode ser usado na análise de células B 17,18.
    1. Coletar pelo menos 1 ml de sangue total em um tubo de heparina de sódio topo verde. Use dentro de 3 dias após a colheita. Guarde-o em sangue RT until pronto para usar.
    2. Aliquota de 0,25 mL de sangue total em 10 ml de meio RPMI completo contendo L-glutamina (20% de soro fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de fungizona, e 1% de PHA). Cultura a 37 ° C com 5% de CO 2.
  4. Modificação de Protocolo: colheita cromossomo da medula óssea
    A análise citogenética de medula óssea é útil para muitas doenças hematológicas malignas como a observação de um clone cromossomicamente anormal podem constituir um diagnóstico para um tipo específico de leucemia. Estudos cromossómicas também são utilizados para avaliar a progressão da doença, tais como o aparecimento de crise explosão e resposta ao tratamento. Como as células da medula óssea estão dividindo ativamente, nenhum estímulo mitógeno é necessário 9,19. Para leucemias agudas 24 e 48 culturas de RH também são criados.
    1. Coletar pelo menos 1 ml de medula óssea em um tubo de heparina de sódio topo verde. Aliquota de 0,25 ml de medula óssea em 10 ml de meio RPMI completo contendo L-glutamina (20% de soro fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de fungizona). Cultura a 37 ° C com 5% de CO 2.

2. Deslize Preparação e coloração sólida

Uma avaliação rápida de um slide representante irá fornecer informações sobre a qualidade da colheita, antes de continuar a novos procedimentos, tais como G-bandas, FISH, CGH, ou SKY. Alguns laboratórios preferem mancha sólida das células para a colheita rápida e avaliação cromossômica. Alternativamente, um microscópio de contraste de fase pode ser usado para esta análise. Os slides são mais bem preparados quando a umidade é de aproximadamente 50% ea temperatura ambiente (20-25 ° C).

  1. Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min a 25 ° C. Remover o sobrenadante até que apenas 0,3-0,5 ml restos mortais.
  2. Após ressuspensão da pelota, suavemente as pipetas três gotas da suspensão de células a partir de uma distância de cerca de 2 em sobre uma lâmina que é inclinada num ângulo de cerca de 45 ° e permite que a suspensãorolar em todo o slide. Adicione uma grande queda de Fixação fresco de Carnoy ao slide.
  3. Seque a parte de trás do slide em uma toalha de papel e, em seguida, sentar-se a deslizar para fora para secar por pelo menos 10 min. O slide deve estar completamente seca.
  4. Prepare fresco Giemsa solução corante (3:1 relação de Gurr buffer e Giemsa). Colocar as lâminas em um rack de coloração. Cubra todo o slide na solução de Giemsa. Deixe as lâminas permanecem na solução de coloração, durante 5 min. Lavar as lâminas com água destilada, escorra e deixe secar ao ar.
  5. Adicionar 4 gotas de Permount e uma lamela para o slide. Certifique-se de que não há bolhas sob a lamela. O excesso Permount pode ser removida com uma toalha de papel.
  6. Analise as células com um microscópio de luz em 10X e 100X de ampliação. Se as células em metafase são abundantes e bem distribuídos, os restantes lâminas pode ser utilizado para outros procedimentos experimentais.

3. G-Banding Usando tripsina e Giemsa (GTG)

<p> A tripsina é uma enzima proteolítica que desnatura histonas eucromáticos em regiões de ADN com actividade de transcrição mais elevado resultante. Após a coloração de Giemsa, estas regiões aparece como bandas claras. Cromatina altamente condensada com atividade transcricional pouca ou nenhuma (heterocromatina) terá uma grande parte de seus histonas protegidos da tripsina e, portanto, vai manchar sombriamente após coloração Giemsa. É essencial inicialmente G-banda de um slide para monitorar as condições e ajustar o tempo de tripsina se necessário, para os slides seguintes.

  1. Adicionar as seguintes soluções para 4 frascos Coplin.
    Frasco # 1 = 30 mL de 1x de HBSS e 4 ml de 10x de tripsina (0,5%)
    Jar # 2 = 50 ml de HBSS 1x
    Frasco # 3 = 45 mL de HBSS e 1x 5 ml de soro fetal bovino
    Jar # 4 = 50 ml de HBSS 1x
  2. Mergulhe cada slide no frasco n º 1 por 5 segundos, lavagem rápida no frasco n º 2, deixe cada slide no frasco n º 3, durante pelo menos 30 segundos, lavagem rápida no frasco n º 4, em seguida, deixar as lâminas secar.
  3. Prepare fresh Giemsa solução corante (3:1 relação de Gurr buffer e Giemsa). Colocar as lâminas em um rack de coloração. Cubra todo o slide na solução de Giemsa. Deixe as lâminas permanecem na solução de coloração, durante 5 min.
  4. Lavar as lâminas em água destilada na mesma ordem em que foram coradas. Permitir que as lâminas para secar por cerca de 10 min. O slide deve estar completamente seca.
  5. Adicionar 4 gotas de Permount e uma lamela para o slide. Certifique-se de que não há bolhas sob a lamela. O excesso Permount pode ser removida com uma toalha de papel.
  6. Analise as células com um microscópio de luz em 10X e 100X de ampliação. Ajustar tripsina temporização do resto das lâminas, com base nos resultados da primeira lâmina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metáfase alta qualidade são essenciais para a análise cromossômica. Um ensaio bem sucedido produz cromossomos, que são bem espalhados e da morfologia cromossômica adequado. Cromossomos corretamente G-unido conter a luz característica e padrões de bandas escuras.

Figura 1
Figura 1. Uma propagação cromossômica sucesso, em que os cromossomos são de tamanho médio, bem distribuídos e facilmente discernível um do outro, e um contraste suficiente entre a luz e as faixas escuras. Boa morfologia cromossômica permite a identificação de cromossomos e avaliação individual para quaisquer rearranjos indicativos de instabilidade cromossômica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utilizámos o presente procedimento para o isolamento do cromossoma a partir de células de vários organismos, incluindo diferentes tipos de células obtidas a partir de humanos, macacos Rhesus, ratinhos e ratos, 11,20-22. O protocolo padrão é fornecida, mas certas etapas principais variáveis ​​e podem ter de ser ajustados para estes diversos tipos de células. Vários passos específicos são cruciais tanto na preparação cromossômica e G-faixas para garantir a melhor qualidade possível dos resultados. Uma das variáveis ​​que podem afectar o ensaio é o tempo de incubação Colcemid. Tempo insuficiente em Colcemid produz menos de metáfase e mais longos, os cromossomos se sobrepunham. Tempos de incubação mais longos em Colcemid resultará em cromossomas mais curtas e espessas, que são difíceis de analisar. Outra variável importante é a molaridade da solução hipotónica. Uma solução de cloreto de potássio 0,075 M irá inchar as células apenas o suficiente para se obter cromossoma adequada espalhar, sem lise das células. Ao adicionarsolução fixadora do Carnoy, os primeiros 5 ml deve ser adicionado ao sedimento enquanto se mistura. Isto assegura que todas as proteínas adicionais são removidos antes de armazenar as amostras ou a preparação de lâminas. Se, no caso de que as células não são misturados muito bem uma tampa de proteína amarela irá formar no topo do sedimento, que pode causar complicações durante os procedimentos subsequentes.

Preparação da lâmina adequada é essencial. Enquanto soltando o pellet celular ressuspenso em lâminas, certifique-se que o slide é inclinado a aproximadamente 45 ° de ângulo e não há distância suficiente (pelo menos 2 polegadas) a partir da conta-gotas para o slide para que os cromossomos podem dispersar adequadamente sobre a lâmina para análise . Inundar o slide com fixador imediatamente após soltar as células para o slide também irá ajudar os cromossomos a se espalhar. Temperatura e umidade, o que afeta o quão rápido a suspensão de células seca para o slide, são outros fatores que afetam o cromossomo se espalhando. Estes podem ser controlado pela preparação lâminas num ambiente com cerca de 50% de humidade e uma temperatura de cerca de 20-25 ° C, e / ou colocando as lâminas numa lâmina de aquecedor para a secagem mais rápida. Por G-Banding, o principal fator que afeta a qualidade dos cromossomos são os tempos de exposição tripsina. Com uma exposição maior tripsina, os cromossomos podem aparecer difusa e inchado. Por outro lado, um período de incubação de tripsina inadequadamente curto renderá cromossomos com bandas indistinguíveis e pouco contraste. A incubação momento tripsina está sujeita a mudança dependendo de cada linha celular específico e condições de colheita. Portanto, um slide G-unido representante deve ser o primeiro preparado para avaliar as condições de tripsina antes de manchar o resto dos slides. Soro fetal bovino é utilizado para inactivar a actividade da tripsina antes da coloração. Nós fornecemos o protocolo usando Giemsa (GTG), mas mancha de Wright pode ser usado em vez de Giemsa para bandas GTW e produz resultados semelhantes.

t "> Este procedimento é relativamente barato e eficaz de realizar. G-bandas pode ser usado para diagnosticar anomalias cromossómicas tais como translocações, deleções e aneuploidia que são vulgarmente observadas em malignidades, distúrbios genéticos, e as células estaminais cultivadas in vitro 10,11 de 13. Isso proporciona a visualização indispensável da constituição cromossômica ea avaliação global de todo o genoma em várias células. É comumente utilizada em laboratórios clínicos e de pesquisa em todo o mundo para o diagnóstico, prognóstico e avaliação terapêutica de células cancerígenas 10. pré-natais e amostras de tecidos pós-natais são rotineiramente avaliadas para a identificação de alterações estruturais e numéricas que causam doenças genéticas, tais como a síndrome de Down. células estaminais podem ser avaliadas rapidamente para a presença de instabilidade cromossoma. No entanto, a resolução do G-bandas é limitada para a identificação de microdeletions ou anormalidades cromossômicas complexas como visto em metástasesmalignidades TATIC.

Portanto, quando cromossomo rotina de bandamento G é complementado com procedimentos como a hibridização fluorescente in situ (FISH), hibridização genômica comparativa (CGH), e cariotipagem espectral (SKY), as taxas de detecção de anormalidades cromossômicas são aumentados dramaticamente 23. Por esta razão, a utilização do presente protocolo em combinação com estes outros procedimentos de citogenética molecular é cada vez mais utilizado por diferentes laboratórios para avaliação de instabilidade cromossômica, tanto na clínica e na pesquisa definindo 13-15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Trabalho descrito neste manuscrito foi possível graças ao financiamento da Fundação Patrick F. Taylor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KaryoMAX Colcemid Gibco 15212-012
HBSS Buffer Gibco 24020-117
0.5% Trypsin EDTA 10x Gibco 15400-054
Permount Fisher Scientific SP15-100
Buffer Tablets "GURR" Gibco 10580-013
Geimsa Stain Ricca Chemical Company 3250-16
Centrifuge 5810 Eppendorf
Methanol Caledon Laboratory Chemicals 6700130
Glacial Acetic Acid Krackeler Scientific Inc. 11-9508-05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
  2. Nussbuam, R., et al. Genetics in Medicine: 7th Edition. Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).
  3. Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84, (11), 1103-1107 (2005).
  4. Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81, (12), 896-901 (2010).
  5. Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114, (4), 901-914 (2009).
  6. Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115, (23), 3015 (2007).
  7. Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21. PubMed Health. (2010).
  8. Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. (2003).
  9. Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115, (3), 118-124 (2002).
  10. Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24, (4), 1095-1103 (2006).
  11. Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68, (11), 4229-4238 (2008).
  12. Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20, (12), 1248-1255 (2012).
  13. Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7, (2), 471-477 (2011).
  14. Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
  15. Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6, (10), 782-792 (2005).
  16. Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  17. Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. (2011).
  18. Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. ACT. Houston, TX. (1997).
  19. Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).
  20. Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19, (7), 1139-1151 (2012).
  21. Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4, (4), 177-181 (2005).
  22. Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8, (1), 13-21 (2002).
  23. McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61, (8), 903-908 (2008).
Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).More

Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome Preparation From Cultured Cells. J. Vis. Exp. (83), e50203, doi:10.3791/50203 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter