Summary
Хромосомы могут быть выделены из живых клеток, таких как лимфоциты или фибробластами кожи, и из организмов, включая человека или мышей. Эти препараты хромосом могут быть дополнительно использованы для рутинного G-диапазонов и молекулярных цитогенетических процедур, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), сравнительной геномной гибридизации (CGH) и спектральной кариотипирование (SKY).
Abstract
Хромосомный анализ (цитогенетический) широко используется для обнаружения хромосомной нестабильности. При последующей G-диапазонов и молекулярных методов, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), этот анализ имеет мощную способность анализировать отдельные ячейки для аберраций, которые включают доходы или потери части генома и перестроек с участием одного или нескольких хромосом. У людей, хромосомные отклонения происходят в примерно 1 на 160 живорожденных 1,2, 60-80% всех выкидышей 3,4, 10% мертворождений 2,5, 13% людей с врожденным пороком сердца 6, 3-6% случаев бесплодия 2, и у многих пациентов с задержкой развития и врожденных дефектов 7. Цитогенетический анализ злокачественности обычно используется исследователями и врачами, как наблюдения клоновых хромосомных аномалий, как было показано, чтобы иметь как диагностическую, так и прогностическую значимость 8,9.60; изоляция Хромосома имеет неоценимое значение для генной терапии и стволовых клеток исследования организмов, включая приматов и грызунов 10-13.
Хромосомы, могут быть выделены из клеток живых тканей, в том числе лимфоцитов крови, фибробласты кожи, amniocytes, плаценты, костный мозг, и образцов опухоли. Хромосомы проанализированы на стадии метафазы митоза, когда они больше всего конденсируется и, следовательно, более четко видны. Первым шагом в технике изоляции хромосома включает разрушение шпинделя волокон путем инкубации с Colcemid, чтобы предотвратить клетки от переходить к следующей стадии анафазе. Затем клетки обрабатывали гипотонического раствора и сохраняется в набухшем состоянии с фиксатором Карнуа. Затем клетки сбрасываются на слайдах и затем может быть использован для различных процедур. G-полосы включает обработку трипсином с последующим окрашиванием Гимза создать характерный светлых и темных полос. То же прocedure изолировать хромосом могут быть использованы для подготовки клеток для процедур, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), сравнительной геномной гибридизации (CGH) и спектральной кариотипирование (небо) 14,15.
Introduction
Хромосомный анализ представляет собой обычный метод используется во всем мире для диагностики хромосомной нестабильности и перестройки, приводящие к генетическим нарушениям и злокачественностью 1,2,8,9. Кроме того, более высокое разрешение для диагностики и исследования конституционных и рак приобрела генетических аномалий может быть достигнуто с помощью комбинации классических цитогенетических процедур и молекулярных цитогенетических методик, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), сравнительной геномной гибридизации (CGH) , и спектральный кариотипирование (SKY) 14,15. В последнее время эти методы были использованы для оценки хромосомной нестабильности, связанной с исследований стволовых клеток. Кариотипической аномалии, такие как анеуплоидия долгосрочных культивируемых эмбриональных клеток (ES) и взрослых стволовых клеток различных организмов, сообщили нескольких лабораториях. Последние данные подтверждают, что некоторые клеточные линии по своей природе более склонны хромосом instabiLITY независимо от условий культивирования. По этой причине, при установлении и / или поддержания человека, мыши или резус линий стволовых клеток, хромосомный анализ рекомендуется как часть процесса контроля качества. Многие доклады описывают все больший интерес к использованию обычных и молекулярной цитогенетики для мониторинга хромосомной стабильности стволовых клеток и злокачественных клеток или различных организмов в культуре 10-13. Эти протоколы чаще используется негенетических лабораторий для экспресс-оценки хромосомной их культивируемых клеток 13. Мы представляем наши основные процедуры по подготовке хромосом из различных типов клеток, которые могут быть применены для клинических и исследовательских целей и клеток, полученных из различных организмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Хромосома Заготовка прилипшие клетки
- Стандартный протокол
- Рост клеток в соответствии с конкретными условиями культивирования клеток. Когда клетки достигли логарифмическую фазу (80% слияния), добавить 10 мкл / мл Colcemid к клеточной культуральной колбе. Минимум 2 х 10 6 клеток рекомендуется.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора в течение 45 мин. С помощью стерильной пипетки перенос носитель из клеток в 15 мл коническую пробирку. Отложите.
- Осторожно промыть клетки путем добавления 2 мл HBSS буфера в колбу. Вихревой буфер, а затем удалить с помощью пипетки. Откажитесь.
- Добавить 1 мл трипсина, гарантируя, что она охватывает всю поверхность колбы. Только оставьте клетки в трипсином в течение примерно 2 мин. После того, как большинство клеток были отключены, пипетки СМИ в конической трубе обратно на клетках.
- Передача клеточной суспензии в 10 мл аликвотах в 15 мл конические пробирки.Центрифуга при 200 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок.
- Добавьте 10 мл 0,075 М KCl, который был предварительно нагретой до 37 ° С к оставшемуся осадку в конической трубе. Вихревой трубы на средней скорости смешать KCl и клетки.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 10 мин. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 25 ° С. Удалите супернатант (приблизительно до 0,5 мл останков) и ресуспендируют осадок.
- Осторожно добавить 5 мл Fixative свежего Карнуа (3:1 соотношение метанола: ледяной уксусной кислоты) в клетках во время встряхивания. Затем добавить 5 мл больше фиксатора без встряхивания в течение в общей сложности 10 мл.
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют клетки. Добавить 5 мл фиксатора в каждую пробирку.
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют клетки. Добавить 5 мл фиксатора в каждую пробирку. Клетки теперь могут быть сохранены в 4 ° С в течение до одного года.
- Модификация протокола: Хромосомные harvestiнг лимфобластоидных клеточных линий
- Рост клеток в соответствии с конкретными условиями культивирования клеток. (Использование фляжка необходимости на сумму клетки культурность). Когда клетки достигли логарифмической фазе (около 2 дней после клетки сплит), добавить 10 мкл / мл Colcemid к клеточной культуральной колбе.
- Модификация протокола: Хромосома заготовка из цельной крови
Фитогемагглютинин (PHA), лектин получают из красной фасоли, является мощным митогеном для человеческих Т-клеток 16. 72 часа после добавления РНА к культуре, около 45% клеток в S фазе. Это представляет собой пик митотической активности, и является оптимальным точка, в которой собрать для исследований хромосом. Другие, такие как митогены Лаконос (1-10 мкг / мл) могут быть использованы при анализе В-клеток 17,18.- Соберите по крайней мере, 1 мл цельной крови в зеленой трубки гепарина лучших натрия. Используйте течение 3 дней после сбора. Магазин крови на РТ ООНсезам готов к использованию.
- Аликвоты 0,25 мл цельной крови в 10 мл RPMI полной среды, содержащей L-глутамин (20% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% Fungizone и 1% PHA). Культура при 37 ° С с 5% CO 2.
- Модификация протокола: Хромосома заготовка из костного мозга
Цитогенетический анализ на костном мозге полезно во многих злокачественных гематологических расстройств, как наблюдение хромосоме аномального клона могут быть диагностики для определенного типа лейкоза. Хромосомные исследования также используются для оценки прогрессирования заболевания, такие как начало доменной кризиса и реакции на лечение. Так как клетки костного мозга активно деления, не митоген стимуляция не требуется 9,19. Для острых лейкозов 24 и 48 час культуры также настроить.- Соберите по крайней мере, 1 мл костного мозга в зеленой трубки гепарина лучших натрия. 0,25 мл аликвоты из костного мозга в 10 мл RPMI полной среды, содержащей L-глутамин (20% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% Fungizone). Культура при 37 ° С с 5% CO 2.
2. Презентация Подготовка и твердых Окрашивание
Быстрое оценка одного представительного слайде будет предоставлять информацию о качестве урожая, прежде чем продолжить дальнейшие процедуры, такие как G-диапазонов, рыба, ГРЭС, или SKY. Некоторые лаборатории предпочитают твердого пятна клетки для быстрого сбора и оценки хромосом. Кроме того, контрастный микроскоп фаза может быть использован для анализа. Слайды лучше подготовлен, когда влажность около 50% и температура окружающей среды (20-25 ° С).
- Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 5 мин при 25 ° С. Удалите супернатант до всего 0,3-0,5 мл останков.
- После осторожного ресуспендированием Пелле, пипетки три капли клеточной суспензии с расстояния около 2 в на слайд, которая наклонена под углом примерно 45 ° и дать суспензиикатиться по слайду. Добавить одну большую каплю Fixative свежего Карнуа к слайду.
- Высушите заднюю часть слайда на бумажное полотенце, а затем сесть слайд, чтобы высохнуть в течение не менее 10 мин. Слайд должен быть полностью сухим.
- Подготовьте свежий Giemsa красящим раствором (3:01 Отношение Gurr накопителем и Гимза). Поместите слайды на окрашивание стойке. Покройте всю слайд в красящим раствором Гимза. Пусть слайды остаются в окрашивающим раствором в течение 5 мин. Промыть слайды с дистиллированной водой, процедить и дайте высохнуть на воздухе.
- Добавьте 4 капли предметный столик Permount и покровное стекло к слайду. Убедитесь, что нет пузырьков под покровное. Избыток предметный столик Permount могут быть удалены с бумажным полотенцем.
- Анализ клеток с оптическим микроскопом при 10-кратном и 100-кратном увеличении. Если метафазы клеток в изобилии и хорошо распространение, остальные слайды могут быть использованы для других экспериментальных процедур.
3. G-кольцевание, используя трипсин и Гимза (GTG)
<р> Трипсин является протеолитический фермент, который денатурирует эухроматиновые гистоны в регионах ДНК с высшим транскрипции вытекающими. После окрашивания Гимза, эти регионы будут отображаться как светлых полос. Высоко конденсированного хроматина практически без транскрипционной активности (гетерохроматина) будет иметь большую часть своих гистонов защищенных от трипсина и поэтому будет пятно темно последующим окрашиванием Гимза. Важно изначально G-группа один слайд контролировать условия и корректировать сроки трипсина если это необходимо для последующих слайдах.- Добавить следующие решения до 4 Коплин банки.
Jar # 1 = 30 мл 1x ССРХ и 4 мл 10x трипсина (0,5%)
Jar # 2 = 50 мл 1x ССРХ
Jar # 3 = 45 мл 1х HBSS и 5 мл фетальной бычьей сыворотки
Jar # 4 = 50 мл 1x ССРХ - Погрузитесь каждого слайда в банке # 1 в течение 5 сек, быстрое полоскание в банке # 2, оставить каждый слайд в банке # 3, по крайней мере 30 секунд, быстрое полоскание в банке # 4 затем позволить слайды высохнуть.
- Подготовка Фресч Гимза окрашивания Решение (3:1 отношение Gurr накопителем и Гимза). Поместите слайды на окрашивание стойке. Покройте всю слайд в красящим раствором Гимза. Пусть слайды остаются в окрашивающим раствором в течение 5 мин.
- Промыть слайдов в дистиллированной воде в том же порядке, что они были окрашенных. Разрешить слайды сохнуть в течение приблизительно 10 мин. Слайд должен быть полностью сухим.
- Добавьте 4 капли предметный столик Permount и покровное стекло к слайду. Убедитесь, что нет пузырьков под покровное. Избыток предметный столик Permount могут быть удалены с бумажным полотенцем.
- Анализ клеток с оптическим микроскопом при 10-кратном и 100-кратном увеличении. Отрегулируйте трипсина сроки остальных слайдов по результатам первого слайда.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Высокое качество метафазных имеют важное значение для хромосомного анализа. Успешный тест дает хромосомы, которые хорошо распространяются и о подходящей морфологии хромосом. Правильно G-полосчатые хромосомы содержат характерную светлые и темные набора полос.
Рисунок 1. Успешная хромосомные распространение, в которой хромосомы средней длины, хорошо распространяется и легко различимы друг от друга, и достаточный контраст между светлыми и темными полосами. Хорошая морфология хромосом позволяет для идентификации отдельных хромосом и оценки для любых перестановок индикативных нестабильности хромосом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы использовали существующую процедуру для изоляции хромосом из клеток различных организмов, в том числе различные типы клеток, полученных из человеческих, макак-резус, крыс и мышей 11,20-22. Стандартный протокол обеспечен, но некоторые ключевые этапы и переменные, возможно, должны быть приспособлены для этих различных типов клеток. Несколько конкретных шагов имеют решающее значение как в подготовке хромосомной и G-полосы, чтобы обеспечить наилучшее качество результатов. Одна из переменных, которые могут повлиять на анализ является время инкубации Colcemid. Недостаточное время в Colcemid дает меньше спреды метафазных и дольше, перекрывающиеся хромосомы. Более длительные времена инкубации в Colcemid приведет к более коротким и более толстых хромосом, которые трудно анализировать. Другой важной переменной является молярность гипотонического раствора. Раствор хлорида калия 0,075 М увеличится клетки достаточно, чтобы дать надлежащую хромосому распространения, без лизиса клеток. При добавлениираствор в Карнуа Фиксирующий, первые 5 мл должны быть добавлены к осадку при перемешивании. Это гарантирует, что все дополнительные белки удаляются перед хранением образцов или подготовки слайдов. Если в случае, когда клетки не смешивается достаточно хорошо, желтый белок крышка образует в верхней части гранул, что может вызвать осложнения во время последующих процедур.
Правильная подготовка слайд имеет важное значение. В то время как падение Ресуспендированный осадок клеток на слайды, убедитесь, что слайд наклонена примерно 45 углом ° и есть достаточное расстояние (не менее 2 дюймов) от капельницы к слайду, так что хромосомы может правильно разогнать на слайд для анализа . Наводнение слайд с фиксатором сразу после падения клетки на слайде также поможет хромосомы распространяться. Температура и влажность, которые влияют как быстро суспензию клеток высыхает на слайде, и другие факторы, которые влияют на хромосому распространения. Они могут быть контролируется подготовке слайдов в среде с приблизительно 50% влажности и температуре около 20-25 ° C, и / или путем размещения слайдов на слайде теплой для ускорения сушки. Для G-кольцевание, основным фактором, который влияет на качество хромосом является время экспозиции трипсина. С больше трипсина воздействия, хромосомы могут появиться рассеянный и опухшие. С другой стороны, недостаточно короткая трипсина Инкубационный даст хромосомы с неразличимых групп и низкой контрастностью. Трипсин Инкубационный сроки зависят от изменения в зависимости от каждой конкретной клеточной линии и условий уборки. Таким образом, представитель G-диапазонов слайд должен быть первым готов оценить условия трипсина перед окрашиванием остальные слайды. Используется эмбриональная бычья сыворотка, чтобы инактивировать активность трипсина до окрашивания. Мы предлагаем протокол с помощью Giemsa (GTG), но пятно Райта могут быть использованы вместо Гимзе для GTW полосы и дает аналогичные результаты.
т "> Эта процедура является относительно недорогим и эффективным для выполнения. G-полосы может быть использован для диагностики хромосомные аномалии, такие как транслокации, делеции и анеуплоидии, которые обычно видели в злокачественных опухолей, генетических нарушений, и стволовые клетки культивировали в пробирке 10,11 , 13. Это обеспечивает необходимую визуализацию конституции хромосом и глобальной оценки всего генома в несколько ячеек. Он широко используется в клинических и научно-исследовательских лабораторий по всему миру для диагностики, прогноза и терапевтического оценки раковых клеток 10. пренатальной и Образцы послеродовые ткани регулярно оцениваться для идентификации численных и структурных аномалий, которые вызывают генетические расстройства, такие как синдром Дауна. Стволовые клетки могут быть быстро оценены на наличие хромосомной нестабильности. Тем не менее, разрешение G-полосы ограничивается для идентификации микроделеции или сложные хромосомные аномалии, как видно в METASTatic злокачественные новообразования.Поэтому, когда процедура хромосома G-полосы дополняется процедур, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), сравнительной геномной гибридизации (CGH) и спектральной кариотипирование (SKY), уровень обнаружения хромосомных аномалий резко 23 увеличивается. По этой причине, использование настоящего протокола в сочетании с этих других молекулярных цитогенетических процедур все чаще используется различными лабораториями для оценки хромосомной нестабильности как в клинических и научных исследований установки 13-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Работа описано в этой рукописи стало возможным благодаря финансированию Фонда Патрик Ф. Тейлора.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
References
- Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
- Nussbuam, R., et al. Genetics in Medicine: 7th Edition. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).
- Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).
- Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).
- Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).
- Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115 (23), 3015 (2007).
- Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21. PubMed Health. , (2010).
- Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).
- Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).
- Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).
- Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).
- Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).
- Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).
- Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
- Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).
- Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).
- Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , ACT. Houston, TX. (1997).
- Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).
- Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).
- Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).
- Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).
- McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).
