Summary
Los cromosomas se pueden aislar de las células vivas, tales como linfocitos o fibroblastos de la piel, y a partir de organismos, incluyendo seres humanos o ratones. Estas preparaciones cromosómicas se pueden utilizar más de rutina bandeo G y procedimientos citogenéticos moleculares como la hibridación fluorescente in situ (FISH), la hibridación genómica comparada (CGH) y cariotipo espectral (SKY).
Abstract
Cromosoma (citogenética) análisis se utiliza ampliamente para la detección de la inestabilidad cromosómica. Cuando se sigue por bandeo G y las técnicas moleculares como la hibridación in situ fluorescente (FISH), este ensayo tiene la extraordinaria capacidad de analizar las células individuales de las aberraciones que implican ganancias o pérdidas de partes del genoma y reordenamientos que afecte a uno o más cromosomas. En los seres humanos, las anomalías cromosómicas ocurren en aproximadamente 1 de cada 160 nacidos vivos a 1,2, el 60-80% de todos los abortos involuntarios 3,4, 10% de los mortinatos 2,5, 13% de los individuos con enfermedad cardíaca congénita 6, 3-6% de los casos de infertilidad 2, y en muchos pacientes con retraso en el desarrollo y defectos de nacimiento 7. El análisis citogenético de malignidad se utiliza de forma rutinaria por los investigadores y los clínicos, ya que se ha demostrado que las observaciones de anomalías cromosómicas clonales tener tanto significado diagnóstico y pronóstico 8,9.60, el aislamiento del cromosoma tiene un valor incalculable para la terapia génica y la investigación con células madre de organismos incluyendo primates no humanos y roedores 10-13.
Los cromosomas se pueden aislar a partir de células de tejidos vivos, incluyendo linfocitos de sangre, fibroblastos de la piel, amniocitos, placenta, médula ósea, y las muestras de tumor. Los cromosomas son analizados en la etapa de metafase de la mitosis, cuando más se condensan y por lo tanto más claramente visible. El primer paso de la técnica cromosoma aislamiento implica la interrupción de las fibras del huso por incubación con Colcemid, para evitar que las células de proceder a la etapa de la anafase posterior. Las células se trataron luego con una solución hipotónica y se conservan en su estado hinchado con fijador de Carnoy. Las células son luego caer sobre portaobjetos y luego se pueden utilizar para una variedad de procedimientos. Bandeo G consiste en el tratamiento de tripsina seguido de tinción con Giemsa para crear la luz característica y bandas oscuras. Lo mismo procedure para aislar cromosomas se puede utilizar para la preparación de células para los procedimientos tales como la hibridación in situ fluorescente (FISH), hibridación genómica comparativa (CGH), y cariotipo espectral (SKY) 14,15.
Introduction
El análisis cromosómico es una técnica convencional utilizada en todo el mundo para el diagnóstico de la inestabilidad cromosómica y reordenamientos que conducen a trastornos genéticos y 1,2,8,9 malignidad. Además, una resolución más alta para el diagnóstico y la investigación de anomalías genéticas constitucionales y el cáncer adquirida se puede lograr con la combinación de los procedimientos citogenéticos clásicos y metodologías de citogenética molecular, tales como hibridación in situ fluorescente (FISH), hibridación genómica comparativa (CGH) y cariotipo espectral (SKY) 14,15. Más recientemente, estas técnicas se han utilizado para la evaluación de la inestabilidad cromosómica asociada con la investigación de células madre. Anomalías del cariotipo como aneuploidía de células a largo plazo cultivadas embrionarias (ES) y las células madre adultas de diversos organismos han sido reportados por varios laboratorios. Evidencia reciente apoya que algunas líneas celulares son inherentemente más inclinados al cromosoma instabilidad, independientemente de las condiciones de cultivo. Por esta razón, cuando el establecimiento y / o mantenimiento de líneas de células madre rhesus humanos, de ratón, o bien, se recomienda el análisis de cromosomas, como parte del proceso de control de calidad. Muchos informes describen el creciente interés en el uso de la citogenética de rutina y moleculares para vigilar la estabilidad cromosómica de las células madre y células malignas o varios organismos en cultivo 10-13. Estos protocolos son cada vez más utilizados por los laboratorios no genéticos para la evaluación cromosómica rápida de sus células cultivadas 13. Presentamos nuestros procedimientos básicos para la preparación de cromosomas de diversos tipos de células, que se pueden aplicar para ambos propósitos y células clínicos y de investigación derivadas de diversos organismos.
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Protocol
1. Cromosoma La recolección de células adherentes
- Protocolo Estándar
- Se cultivan las células de acuerdo a condiciones específicas de cultivo celular. Cuando las células han alcanzado la fase logarítmica (80% de confluencia), añadir 10 l / ml de Colcemid al matraz de cultivo de células. Se recomienda un mínimo de 2 x 10 6 células.
- Se incuban las células a 37 º C en un incubador de CO2 al 5% durante 45 min. Usando una pipeta estéril, transferir los medios de las células en un tubo cónico de 15 ml. Ponga a un lado.
- Lave suavemente las células mediante la adición de 2 ml de HBSS Buffer en el matraz. Amortiguar remolino y luego retire con una pipeta. Descartar.
- Añadir 1 ml de tripsina, asegurándose de que cubre toda la superficie del matraz. Sólo dejar las células en tripsina durante aproximadamente 2 min. Una vez que la mayoría de las células se han separado, pipetear los medios de comunicación en el tubo cónico de nuevo en las células.
- Transferir la suspensión celular en alícuotas de 10 ml en tubos de 15 ml cónicos.Centrifugar a 200 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado.
- Añadir 10 ml de 0,075 M de KCl que ha sido precalentada a 37 º C al sedimento que queda en el tubo cónico. Tubo Vortex a velocidad media para mezclar KCl y células.
- Se incuban las células a 37 ° C durante 10 min. Centrifugar a 200 xg durante 5 min a 25 ° C. Aspirar el sobrenadante (hasta unos 0,5 ml restos) y pellet se resuspende.
- Añadir cuidadosamente 5 ml de fijador fresco de Carnoy (3:1 de metanol: ácido acético glacial) a las células, mientras que vórtex. Añadir a continuación 5 ml más de fijador sin agitación durante un total de 10 ml.
- Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Retire las células sobrenadante y volver a suspender. Añadir 5 ml de fijador a cada tubo.
- Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Retire las células sobrenadante y volver a suspender. Añadir 5 ml de fijador a cada tubo. Las células se pueden almacenar en 4 ° C durante hasta un año.
- Modificación al protocolo: harvesti cromosómicasng de líneas celulares linfoblastoides
- Se cultivan las células de acuerdo a condiciones específicas de cultivo celular. (Use matraz apropiado para la cantidad de células que se cultiva). Cuando las células han alcanzado la fase logarítmica (aproximadamente 2 días después de que las células se dividen), añadir 10 l / ml de Colcemid al matraz de cultivo de células.
- Modificación al protocolo: Cromosoma recolección de la sangre entera
Fitohemaglutinina (PHA), una lectina derivada del frijol rojo, es un mitógeno potente para las células T humanas 16. 72 h después de la adición de PHA a la cultura, aproximadamente el 45% de las células están en la fase S. Esto representa el pico de actividad mitótica, y es el punto óptimo para la cosecha de estudios cromosómicos. Otros mitógenos tales como hierba carmín (1-10 g / ml) se pueden utilizar en el análisis de células B 17,18.- Recoge al menos 1 ml de sangre completa en un tubo de heparina sódica superior verde. Utilice dentro de 3 días después de la recogida. Sangre tienda a temperatura ambiente sinhasta listo para usar.
- Alícuota de 0,25 ml de sangre completa en 10 ml de medio RPMI completo que contiene L-glutamina (suero bovino fetal al 20%, 1% penicilina / estreptomicina, 1% de fungizona, y 1% de PHA). Cultivo a 37 ° C con 5% de CO 2.
- Modificación al protocolo: Cromosoma recolección de la médula ósea
El análisis citogenético de la médula ósea es útil en muchos trastornos hematológicas malignas como la observación de un clon cromosómicamente anormal puede ser diagnóstico para un tipo específico de leucemia. También se utilizan estudios cromosómicos para evaluar la progresión de la enfermedad, tales como la aparición de crisis blástica y respuesta al tratamiento. Dado que las células de la médula ósea se están dividiendo activamente, sin estimulación por mitógenos es necesario 9,19. Para las leucemias agudas culturas 24 y 48 h también se establezcan.- Recoge al menos 1 ml de médula ósea en un tubo con heparina de sodio superior verde. Alícuota de 0,25 ml de médula ósea en 10 ml de medio RPMI completo que contiene L-glutamina (20% de suero fetal bovino, 1% penicilina / estreptomicina, 1% de fungizona). Cultivo a 37 ° C con 5% de CO 2.
2. Slide Preparación y tinción sólida
Una evaluación rápida de una diapositiva representante le proporcionará información sobre la calidad de la cosecha antes de continuar con otros procedimientos tales como bandas G, FISH, CGH, o SKY. Algunos laboratorios prefieren tinción sólida de las células para la recolección rápida y evaluación cromosoma. Alternativamente, un microscopio de contraste de fase puede ser utilizado para este análisis. Los portaobjetos se preparan mejor cuando la humedad es de aproximadamente 50% y la temperatura ambiente (20-25 ° C).
- Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min a 25 ° C. Eliminar el sobrenadante hasta que sólo 0,3-0,5 ml restos.
- Después de resuspender suavemente el sedimento, de pipeta tres gotas de la suspensión de células a partir de una distancia de aproximadamente 2 en sobre un portaobjetos que está inclinado en un ángulo de aproximadamente 45 ° y permitir que la suspensiónrodar a través de la diapositiva. Añada una gran gota de fijador de Carnoy fresco a la diapositiva.
- Seque la parte posterior de la diapositiva en una toalla de papel y luego sentarse la diapositiva a secar durante al menos 10 min. La diapositiva debe estar completamente seco.
- Prepare fresco tinción Giemsa solución (3:1 proporción de Gurr Buffer y Giemsa). Colocar los portaobjetos en una rejilla de tinción. Cubra toda la diapositiva en la solución de tinción Giemsa. Deje que las diapositivas permanecen en la solución de tinción durante 5 min. Enjuagar los portaobjetos con agua destilada, dejar escurrir y dejar secar al aire.
- Añadir 4 gotas de Permount y una hoja de cubierta de la diapositiva. Asegúrese de que no hay burbujas bajo el cubreobjetos. El exceso Permount se puede quitar con una toalla de papel.
- Analice las células con un microscopio de luz con una lupa de 10X y 100X. Si las células en metafase son abundantes y bien propagación, las diapositivas restantes pueden utilizarse para otros procedimientos experimentales.
3. G-Banding utilizando tripsina y Giemsa (GTG)
<p> La tripsina es una enzima proteolítica que desnaturaliza las histonas euchromatic en regiones de ADN con una mayor actividad transcripcional resultante. Después de la tinción de Giemsa, estas regiones aparecen como bandas de luz. Cromatina altamente condensado con poca o ninguna actividad transcripcional (heterocromatina) tendrá una gran parte de sus histonas protegidas de la tripsina y por lo tanto se mancha oscura después de la tinción de Giemsa. Es esencial inicialmente G-banda una diapositiva a supervisar las condiciones y ajuste la sincronización de la tripsina en caso de necesidad para las diapositivas siguientes.- Añadir las siguientes soluciones para 4 jarras Coplin.
Tarro # 1 = 30 ml de HBSS 1X y 4 ml de 10x tripsina (0,5%)
Jar # 2 = 50 ml de 1x HBSS
Tarro # 3 = 45 ml de HBSS 1X y 5 ml de suero fetal bovino
Jar # 4 = 50 ml de 1x HBSS - Sumerja cada diapositiva de Jar # 1 durante 5 segundos, enjuague rápido en Jar # 2, deje cada diapositiva de Jar # 3 durante al menos 30 segundos, enjuague rápido en Jar # 4 luego permitir que se sequen.
- Preparar fresh Giemsa tinción Solución (relación 3:1 de Gurr Buffer y Giemsa). Colocar los portaobjetos en una rejilla de tinción. Cubra toda la diapositiva en la solución de tinción Giemsa. Deje que las diapositivas permanecen en la solución de tinción durante 5 min.
- Enjuagar los portaobjetos en agua destilada en el mismo orden en que estaban manchadas. Deje que los portaobjetos se sequen durante unos 10 min. La diapositiva debe estar completamente seco.
- Añadir 4 gotas de Permount y una hoja de cubierta de la diapositiva. Asegúrese de que no hay burbujas bajo el cubreobjetos. El exceso Permount se puede quitar con una toalla de papel.
- Analice las células con un microscopio de luz con una lupa de 10X y 100X. Ajuste de temporización tripsina de el resto de las diapositivas en base a los resultados de la primera diapositiva.
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Representative Results
Metafase para untar de alta calidad son esenciales para el análisis cromosómico. Un ensayo exitoso produce cromosomas que están bien repartidas y de la morfología cromosómica adecuada. Cromosomas correctamente bandas-G contienen la luz característica y los patrones de bandas oscuras.
Figura 1. Una extensión de cromosomas éxito en el que los cromosomas son de longitud media, bien distribuidas y fácilmente discernible entre sí, y suficiente contraste entre bandas claras y oscuras. Buena morfología cromosómica permite la identificación de los cromosomas y la evaluación individuales para cualquier reordenamientos indicativos de la inestabilidad cromosómica.
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Discussion
Hemos utilizado el presente procedimiento para el cromosoma aislamiento a partir de células de diversos organismos, incluyendo diversos tipos de células obtenidos a partir de humano, macacos Rhesus, ratas, y ratones 11,20-22. Se proporciona el protocolo estándar, pero ciertos pasos clave y variables puede ser necesario ajustar para estos diversos tipos de células. Varios pasos específicos son cruciales tanto en la preparación cromosómica y bandas G para asegurar la mejor calidad posible de los resultados. Una de las variables que pueden afectar el ensayo es el tiempo de incubación Colcemid. Tiempo insuficiente en Colcemid produce un menor número de spreads metafase, los cromosomas más largos y solapados. Tiempos de incubación más largos en Colcemid se traducirá en cromosomas más cortos y más gruesos que son difíciles de analizar. Otra variable importante es la molaridad de la solución hipotónica. Una solución de cloruro de potasio 0,075 M se hinchará las células sólo lo suficiente para producir el cromosoma adecuada difusión, sin lisar las células. Mientras que la adiciónsolución fijadora del Carnoy, hay que añadir los primeros 5 ml al sedimento mientras se mezcla. Esto asegura que todas las proteínas adicionales se eliminan antes de almacenar las muestras o la preparación de diapositivas. Si en el caso de que las células no se mezclan lo suficientemente bien, se formará un tapón de proteína amarilla en la parte superior de la pastilla, que puede causar complicaciones durante los procedimientos posteriores.
La preparación adecuada de la diapositiva es esencial. Mientras que dejar caer el sedimento celular resuspendido en diapositivas, asegúrese de que la tapa está inclinada a aproximadamente 45 ° de ángulo y hay suficiente distancia (por lo menos 2 pulgadas) desde el gotero a la diapositiva para que los cromosomas se dispersan adecuadamente en la diapositiva para el análisis . Inundar el portaobjetos con fijador inmediatamente después de dejar caer las células a la diapositiva también ayudará a difundir los cromosomas. La temperatura y la humedad, lo que afecta a la rapidez con la suspensión de células se seca en la diapositiva, hay otros factores que afectan el cromosoma se propague. Estos pueden ser controlado mediante la preparación de diapositivas en un ambiente con aproximadamente 50% de humedad y una temperatura de aproximadamente 20-25 ° C, y / o mediante la colocación de diapositivas en un calentador de portaobjetos para un secado más rápido. Para bandas G, el principal factor que afecta a la calidad de los cromosomas es el tiempo de exposición de la tripsina. Con una exposición a tripsina ya, los cromosomas pueden aparecer difusa e hinchada. A la inversa, una incubación de tripsina inadecuadamente corto producirá cromosomas con bandas indistinguibles y poco contraste. El momento de la incubación con tripsina está sujeto a cambio dependiendo de cada línea celular específica y las condiciones de cosecha. Por lo tanto, una diapositiva de bandas-G representante debe ser primero preparado para evaluar las condiciones de la tripsina antes de la tinción el resto de las diapositivas. El suero bovino fetal se utiliza para inactivar la actividad de la tripsina antes de la tinción. Proporcionamos el protocolo utilizando Giemsa (GTG), pero la tinción de Wright se pueden usar en lugar de Giemsa para las bandas GTW y produce resultados similares.
t "> Este procedimiento es relativamente barato y eficaz para llevar a cabo. bandeo G se puede utilizar para diagnosticar anomalías cromosómicas tales como translocaciones, deleciones, y aneuploidía que se observan con frecuencia en tumores malignos, trastornos genéticos, y las células cultivadas in vitro 10,11 vástago , 13. Esto proporciona la visualización indispensable de la constitución cromosómica y la evaluación global de la totalidad del genoma de varias celdas. Es de uso general en los laboratorios clínicos y de investigación de todo el mundo para el diagnóstico, pronóstico y evaluación terapéutica de las células cancerosas 10. prenatales y muestras de tejido postnatales son evaluados de manera rutinaria para la identificación de anomalías numéricas y estructurales que causan los trastornos genéticos, como el síndrome de Down. Las células madre pueden ser evaluados rápidamente para determinar la presencia de inestabilidad cromosómica. Sin embargo, la resolución de bandeo G se limita a la identificación de microdeleciones o anomalías cromosómicas complejas como visto en metástasismalignidades tatic.Por lo tanto, cuando el cromosoma rutina bandeo G se complementa con procedimientos como la hibridación in situ fluorescente (FISH), la hibridación genómica comparada (CGH) y cariotipo espectral (SKY), las tasas de detección de anomalías cromosómicas aumentan dramáticamente 23. Por esta razón, la utilización del presente protocolo en combinación con estos otros procedimientos de citogenética molecular es cada vez más utilizado por los diferentes laboratorios para la evaluación de la inestabilidad cromosómica tanto en la clínica y la investigación estableciendo 13-15.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Trabajo descrito en este manuscrito fue posible gracias al financiamiento de la Fundación Patrick F. Taylor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
References
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