Summary
Cerebral perfusion overvågning har vist sig at forbedre nøjagtigheden af iskæmisk slagtilfælde modeller. Tekniske vanskeligheder ofte begrænser anvendelsen af dette vigtige værktøj for cerebrovaskulær forskning. I denne video, er et optimeret system vist at opnå en enkelt eller multi-site hæmodynamisk monitorering ved intraluminal mellem-cerebral arterieokklusion hos rotter.
Abstract
Den translationel potentiale præklinisk slagtilfælde forskning afhænger af nøjagtigheden af eksperimentel modellering. Cerebral perfusion overvågning i dyremodeller af akut iskæmisk slagtilfælde tillader at bekræfte vellykket arterieokklusion og omfatter subarachnoid blødning. Cerebral perfusion overvågning kan også bruges til at studere intrakraniel sikkerhedsstillelse omsætning, der er ved at opstå som en magtfuld faktor for udfaldet af slagtilfælde og en eventuel terapeutisk mål. Trods en anerkendt rolle Laser Doppler perfusion overvågning som en del af de nuværende retningslinjer for eksperimentel cerebral iskæmi, findes en række tekniske vanskeligheder, der begrænser dens udbredelse. En af de store problemer er at opnå en sikker og langvarig fastgørelse af en dyb-penetration Laser Doppler probe til dyret kraniet. I denne video viser vi vores forbedrede system for cerebral perfusion overvågning under transient mellem-cerebral arterieokklusion ved intraluminal filament i rotten. Vi udviklede in-house en enkel metode til at opnå en skræddersyet holder til to-fiber (deep-penetration) Laser Doppler-prober, som muliggør multi-site overvågning hvis nødvendigt. En kontinuerlig og langvarig overvågning af cerebral perfusion let kunne opnås over den intakte kranium.
Introduction
Translationel forskning i hæmodynamiske faktorer, der påvirker slagtilfælde patofysiologi og behandling skal gennemføres, da dette vigtige spørgsmål ofte er paradoksalt nok overset af basale undersøgelser 1.
Cerebral perfusion overvågning er et vigtigt, men underudnyttet, værktøj til præcis iskæmisk slagtilfælde modellering 2. Bortset fra bekræftelse af arteriel tillukning af blodkar og udelukkelse af subarachnoid blødning 3 kan kontinuerlig cerebral perfusion overvågning giver nyttige data om graden og sammenhængen mellem perfusion underskud, den funktionelle status af intrakranielle kollaterale kar og den hæmodynamiske effekt af nye behandlingsformer.
En nylig undersøgelse fra vores gruppe viser, at multi-site hæmodynamisk monitorering kan anvendes til at vurdere intrakraniel sikkerhedsstillelse omsætning og kan forudsige infarktstørrelse og funktionel underskud 4. Disse eksperimentelle resultater er consistent med kliniske undersøgelser, som viste, at den funktionelle ydeevne cerebral sikkerhedsstillelse omsætning er forudsigende for det kliniske resultat hos iskæmiske patienter med slagtilfælde 5, 6. Af denne grund er cerebrale soeskende blevet anbefalet som et potentielt terapeutiske mål i den akutte fase af iskæmisk slagtilfælde 7.
Laser-Doppler (LD) instrumenter er den mest almindelige værktøj, der anvendes til at måle cerebral perfusion i eksperimentel iskæmisk slagtilfælde og deres brug anbefales af de seneste retningslinjer for dette tema 8. LD instrumenter foranstaltning mikrovaskuløs perfusion i et lille cortical volumen, dybden af det optagede signal er afhængig af bredden af fiber separation, med dobbelte fiber LD prober muliggør en dybere indtrængen i forhold til enkeltfiber-LD prober 9. Blodgennemstrømningen værdier er udtrykt som arbitrære perfusion enheder (PU), som angiver relative og ikke absolutte cerebral blodstrøm. Kalibrering af PU er normalt udføres using motilitet standarder, i overensstemmelse med producentens instruktioner. LD flowmetri tillader en kontinuerlig dynamisk overvågning og generering af kvantitative data inden for samme session.
Blandt de tekniske problemer, der i øjeblikket begrænser anvendelsen af LD, er et stort problem at opnå en sikker og langvarig fastgørelse af en dyb-penetration Laser Doppler probe til dyret kraniet. Dette er vigtigt for langvarig overvågning og hvis flere prober anvendes til forskellige cerebrale arterielle områder, som vi udfører i vores laboratorium.
Især er forlænget kirurgisk tid, der kræves, hvis prober fastgjort til kraniet med burr huller eller craniale skruer, hvorimod dårlig signal og usikker fastgørelse opstår, hvis en enkelt fiber (lav penetration) LD prober fastgjort til kraniet ved simpel kirurgisk lim. Twin fiber (dyb-penetration) LD sonder giver en højere og mere ensartet signal, men de er større end en enkelt fiber sonder og kan ikke være påvedhæftet til kraniet ved kirurgisk lim alene.
I denne video viser vi vores forbedrede system for cerebral perfusion overvågning under transient mellem-cerebral arterieokklusion ved intraluminal filament i rotten. Vi beskriver en simpel metode til opnåelse af en effektiv, specialfremstillede, lave omkostninger holder til en enkelt eller flere dobbelt-fiber (deep-penetration) LD prober, der skal anvendes til langvarig overvågning af cerebral perfusion over den intakte kraniet.
Den kirurgiske procedure til transient MCAO i rotter kan ses i video-artikel af Uluç og medarbejdere 10 og er ikke vist i denne video.
Protocol
1. Sådan gør probeholderen (Single site eller Multi-site)
- De nødvendige materialer er naturgummi, små plastrør og et metal stilet. Probeholderen kan tilpasses til størrelsen af dyret, antallet og størrelsen af de laser-doppler-prober, og den cerebrale vaskulære område, der skal overvåges.
- Skær naturgummi af den nødvendige størrelse (ca. 10 mm x 10 mm for en 300 g rotte).
- Markere placeringen af proben (erne) og bregma på naturgummi, overensstemmelse med de ønskede stereotaksisk koordinater for mellem-cerebral arterieokklusion, er den typiske koordinater for den iskæmiske kerne forventes på bregma -1 mm, 5 mm lateralt i forhold til midterlinjen, for en perifer iskæmisk borderzone territorium, kan de forventede koordinater være bregma +2 mm, 2 mm lateral med midterlinjen.
- Markere meget tydeligt positionen af bregma med et X, er dette den skelsættende til fastgørelse af probeholderen til kraniet. </ Li>
- Sæt stiletten i en lille plastikrør (dens størrelse skal svare til størrelsen af sonden).
- Sæt stiletten i naturgummi det sted, hvor sonden skal placeres, skubbe stiletten i gummiet, indtil plastrøret er blevet indsat i gummiet også.
- Tilbagetrække stiletten.
- Hvis flere sonder er behov for, så gentag trin 1,5-1,7 for andre sonder positioner.
- Valgfri for flere sonder: wrap et bånd rundt plastrørene at sikre en bedre stabilisering af sonderne.
- Valgfrit: udføre kemiske sterilisering af flere sonder indehavere for fremtidige anvendelser.
2. Presurgical Forberedelse
- MCAO slagtilfælde model er normalt udføres som en overlevelse kirurgi. I dette tilfælde, som vist i vores video (overlevelsestid 24 timer efter kirurgi), kirurgen bruger en aseptisk teknik med steriliserede instrumenter og forbrugsvarer.
- Bedøve rotte med isofluran (3% induction fase, 1,5% vedligeholdelse).
- Placere rotten i bugleje på operationsbordet.
- Forsigtigt barbere hovedet af rotten.
- Påfør en antiseptisk løsning på et stykke gaze og desinficere huden.
- Administrere Lidocaine 2% 5 mg / kg subkutant i kranie område.
3. Probe Positionering og Sikring Over Intakt Skull
- Lav en højre paramedian hudindskæring (til højre MCAO) og dissekere det subkutane væv at nå den kranielle fascia (Galea aponeurotica).
- Foretag en højre paramedian incision i kranie fascia og udføre stump dissektion for at nå kraniet, udarbejde et kraniet område, der er stort nok til anvendelsen af probeholderen.
- Bemærk venligst: ikke behov for boring eller knogle udtynding.
- Påfør Merbromin løsning til at desinficere og tørre kraniet overflade.
- Brug en hårtørrer (indstillet til kold luft) for at fremskynde tørring af kraniet overflade. På dette tidspunkt er de kraniel suturer og bregma klart synlig.
- Tilpas probeholderen ved at skære kanterne med steril saks.
- Påfør en lille mængde kirurgisk lim (cyanoacrylat, veterinær-godkendt) til overfladen under probeholderen, omhyggeligt undgår den ringere åbning af plastrørene (bemærk: hvis en betydelig mængde af lim forbliver mellem den optiske overflade af sonden og kraniet, kan dette frembringe en lav-signal og kan beskadige probe efter flere anvendelser).
- Påfør probeholderen til kraniet overflade, omhyggeligt matcher bregma med X vartegn. Tryk forsigtigt sonden holder.
- Brug en hårtørrer (indstillet til kold luft) for at fremskynde tørring af kirurgiske lim.
- Fastgør probeholderen ved at binde en kirurgisk tråd omkring probeholderen og hovedet af dyret; være omhyggelig med at placere kirurgiske tråd over mandibula, undgå submandibulære region og the hals.
- Valgfrit: fill plastrøret (er) af proben holder med en optisk gel (f.eks en fælles ultralyd eller elektrokardiografi gel), hvilket forøger kvaliteten af LD-signalet.
- Anbring probe (r) i probeholderen og kontrollere den faktiske læsning af LD gennemstrømningsmåleren. Brug LD flowmåleren ifølge producentens instruktioner.
- Fastgør sonden (s) binde dem rundt hoved af dyret; være omhyggelig med at placere kirurgiske tråd over mandibula, undgå submandibulære region og halsen.
4. Cerebral Perfusion Overvågning under MCAO
- Placere rotten i liggende stilling, sørger for at undgå tractional kræfter på proben (erne) eller probeholderen.
- Start cerebral perfusion overvågning under MCAO.
5. Fjernelse af proben (erne) og probeholderen
- Skær suturerne omkring proben (erne), probeholderen og hovedet af dyret.
- Forsigtigt sløve dissekere kranie bløde væv og hud omkring naturgummi base af probeholderen.
- Fjern probeholderen.
- Påfør en antiseptisk løsning på kraniet overflade.
- Suturere den kraniale hud.
6. Postoperativ Care
- Administrere 2,5 ml saltvandsopløsning subkutant for at undgå dehydrering og holde dyret varmt anvender en varmepude efter stop gasformig anæstesi.
- For overlevelse kirurgi: give forebyggende analgesi med Ketoprofen 4 mg / kg subkutant og gentage den samme dosis på 12 timer postoperativt
- Under vores forsøgsbetingelser blev eutanasi foretaget ved 24 timer efter operation ved CO2 inhalation.
Representative Results
Transient MCAO (60 min) blev induceret ved at indsætte en siliconebelagt filament i den ydre carotidarterie. Filamentet blev derefter skubbet gennem den afsluttende ende af den indre carotidarterie til oprindelsen af MCA, under LD overvågning. Fælles carotidarterie og pterygopalatin arterie blev transient okkluderet under den kirurgiske indføring af filamentet. En skematisk fremstilling af den kirurgiske procedure er vist i figur 1A.
Den kraniale koordinater for at placere de to LD prober blev valgt ifølge den underliggende arterielle område. Indledende forsøg med gelatine-ink perfusion (Figur 1B) viste, at den iskæmiske kerne forventes i det centrale MCA territorium (bregma -1 mm, 5 mm fra midterlinien, Probe 1), mens sikkerhedsstillelse flow ventes i borderzone område mellem kortikale grene af mellemledere og forreste cerebrale arterier (bregma +2 mm, 2 mm fra midterlinien, Probe 2).
Cerebrale hæmodynamik blev studeret ved anvendelse af multi-site laser-doppler prober under hele den kirurgiske procedure, altså før, under og efter MCAO (figur 2). Cerebral perfusion underskud under MCAO var mindre og udviste en højere grad af variabilitet i Sonde 2 sammenlignet med Probe 1, hvilket antyder inter-individuelle forskelle i den funktionelle ydeevne intrakranielle kollateraler under iskæmiske betingelser. The multi-site Laser Doppler overvågning også muligt at studere de cerebrale hæmodynamiske ændringer under okklusion af proximale extra-kraniale cerebrale arterier (fælles carotidarterie, arteria carotis interna, pterygopalatin arterie).
Udfald af slagtilfælde blev vurderet 24 timer efter reperfusion ved at infarktvolumen, beregnet på 19 på hinanden følgende sektioner farves med cresylviolet (fig. 3), og Garcia funktionel neuroscore 11. Immunhistokemi for specifikke markører assodelse med iskæmisk hjerneskade blev udført, for at opnå et topografisk fordeling af neuronalt tab (mikrotubulus associeret protein 2, MAP2) og iskæmisk penumbra (varmechokprotein-70, Hsp70) i forhold til multi-site hæmodynamisk monitorering af intrakraniel omsætning (figur 4).
Figur 1. Cerebral perfusion overvågning under intraluminal MCAO hos rotter. A. Skematisk fremstilling af den kirurgiske procedure for transient MCAO. Et siliconebelagt filament blev anvendt til at okkludere oprindelsen af MCA, efter at være indført i den ydre carotidarterie og skubbes gennem den indre carotidarterie. Proximale cervikale arterier blev enten ligeret (ydre carotidarterie) eller transient okkluderet (pterygopalatin arterie og fælles carotidarterie) under procedure. B. Et repræsentativt hjerne vises efter gelatine-ink farvning. Transcardiac perfusion af gelatine-blæk opløsning blev udført 60 min efter påbegyndelsen af iskæmi uden reperfusion. Den normalt perfunderet hjerne blev farvet af gelatine-blæk og viste sig som grå-farvet med sorte farvede skibe, mens den iskæmiske (ikke-perfunderede) område forblev ufarvet (pink-farvet). Kraniale koordinater for at placere de to LD prober er vist. Probe 1 = -1 mm fra bregma, 5 mm fra midterlinien, Probe 2 = 2 mm fra bregma, 2 mm fra midterlinjen.
Figur 2. Cerebral hæmodynamiske optagelser med multi-site Laser Doppler prober. En typisk hæmodynamiske mønster, der tyder på funktionelt aktive intrakranielle soeskende under iskæmiske tilstande er vist. I dette dyr, viste LD tracings en lilleis perfusion underskud i Probe 2-kanals, sammenlignet med probe 1 kanal, både under CCA okklusion og MCA-okklusion. MCA-O = mellem-cerebral arterieokklusion. CCA-O = fælles carotidarterie okklusion. PU = perfusion enheder.
Figur 3. Repræsentative hjernesnit til beregning af infarktvolumen Histologiske coronale snit (50 um, n = 19 med 250 um interval; bregma 2,5 mm til -3,0 mm). Fikseres i 4% paraformaldehyd og farvet med cresylviolet 0,1%. Infarktvolumen beregnes ved hjælp ImageJ billedbehandling software, korrigeret for inter-hemisfæriske asymmetrier på grund af cerebral ødem, og udtrykkes i mm 3. Klik her for at se større figur
Figur 4. Immunfarvning af molekylære markører for neurontab og penumbra Repræsentative konsekutive hjernesnit er vist, som blev farvet med cresylviolet 0,1% (A) eller immunfarvet med markører for neuronalt tab (mikrotubulus associeret protein 2, MAP2, B). Og iskæmisk penumbraen (varme shock protein-70, Hsp70, C).
Discussion
Vi udviklet internt en enkel og billig for en sikker fastgørelse af en eller flere dobbelt-fibre (dyb indtrængen) LD prober til intakte kraniet af rotter under MCAO procedure. Omend tilsyneladende et trivielt problem, er at opnå en pålidelig fastgørelse af LD probe til kraniet faktisk et stort problem i denne eksperimentelle omgivelser, da det er en forudsætning for en glat signaldetektering og en vellykket overvågning af cerebral perfusion.
Invasive procedurer, såsom burr huller og knogleskruer, som regel forlænge den kirurgiske tid og indføre mere eksperimenterende variabler i relation til kraniotomi, og dette kan afholde forskere og afholder dem fra at bruge LD-overvågning. På den anden side giver anvendelsen af en enkelt fiber (lav dækningsgrad) prober, der er tyndere og forholdsvis lettere at være limet direkte på kraniet overfladen, ringe kvalitet signal og kan ikke anvendes pålideligt med voksne rotter uden at bore eller udtynding kraniet.
Vi anvendte enkle og billige materialer, såsom naturgummi, plastrør og et metal stilet. En specialfremstillet probeholderen kan fremstilles i få minutter og tilpasses de eksperimentelle betingelser. Disse probe indehavere kan rumme en eller flere dyb-penetration LD prober, for klassisk single site overvågning på den iskæmiske kerne eller for multiple-site overvågning i forskellige arterielle områder i den samme halvkugle eller på tværs af de to hjernehalvdele. Mange probe holdere kunne fremstilles, kemisk steriliseret og opbevaret til fremtidig anvendelse. Veterinær-godkendt kirurgisk lim (cyanoacrilate), fremskyndet af kold luft, der bruges til at fastgøre probeholderen til den intakte overflade af rotte kraniet, overensstemmelse med de ønskede kraniale koordinater. Endelig er proben set-up yderligere på plads ved fælles suturer.
Den samlede tid for denne LD probe set-up, efter at mestre denne teknik, er omkring 10 min.
Som vist in videoen, vi rutinemæssigt overvåge cerebral perfusion i den centrale MCA område (LD probe 1: iskæmisk kerne) og i det perifere MCA område (LD probe 2: hovedsagelig en penumbral område). I vores nylige undersøgelse viste vi, at variabiliteten af blodgennemstrømning ændringer i LD probe 2 (gennemsnit 52% ± 16% SD, sammenlignet med basislinien) er højere end LD probe 1 (gennemsnit 31% ± 6% SD, sammenlignet med baseline) og kan anvendes til at forudsige udfaldet af slagtilfælde 4.
Vi kan give nogle fejlfinding råd til forskere, der ønsker at bruge vores in-house udviklede system. Ved begyndelsen af eksperimentet, være omhyggelig med at tørre godt kraniet overflade (med Merbromin og kold luft) før montering af probeholderen at forhindre for tidlig adskillelse. Øvrigt være sikker på at anvende limen på naturgummi, undgå kontakt med den åbne ende af plastrøret, og den optiske overflade af LD probe, for at undgå dårlige signal og mulig skade på sonden. Når binde suturen omkring hovedet af dyret, være omhyggelig for at undgå luftvejsobstruktion (dette forhindres ved at anbringe suturen i den mandibulært knogletab). Efter placering og fastgørelse af prober, skal du passe på ikke at trækkraft sonde kabler, når dreje dyret i rygleje for livmoderhalskræft kirurgi, dette trin normalt kræver to personer, én person at holde dyret, og en anden person med sonden kabler og forsigtigt placere dem til den ønskede position. Endelig er eventuel blodkontaminering af twin-fiber LD sonde nemt styres efter rengøring anvisningerne fra producenten.
Vores optimerede system for cerebral perfusion overvågning, som vist i denne video, kan give en lettere, hurtigere og mere pålideligt alternativ til sonden set-up-systemer, der i øjeblikket sælges af kommercielle virksomheder på dette område. Desuden mener vi, at anvendelse af dette system af andre forskere kan forøge study af cerebrale hæmodynamik i den eksperimentelle stroke felt, hvilket fører til udvikling af en ny generation af cerebrale sikkerhedsstillelse terapeutika.
Disclosures
Finansieringen til produktion af denne video-artikel blev leveret af Moor Instruments Ltd (Axminster, Devon, UK), der producerer Laser Doppler instrumenter, der fremgår vores eksperimentel undersøgelse.
Den eksperimentelle protokol blev godkendt af Udvalget for Animal Care fra University of Milano Bicocca i overensstemmelse med de nationale retningslinjer for anvendelse af forsøgsdyr (DL 116/1992) og Den Europæiske Unions direktiv om dyreforsøg (2010/63/EU ), under projekt licens (n. 219/2011-B) fra det italienske sundhedsministerium.
Acknowledgments
Vi takker fru Caroline Robertson til voice-over og fru Elena Pirovano for hendes hjælp i videoproduktion. Denne undersøgelse blev støttet af universitetet i Milano Bicocca, "Fondo di Ateneo 2011".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MoorVMS-LDF 2-channel Laser Doppler Monitor |  Moor Instruments |
||
| VP12 probe | Moor Instruments |
||
| Reagent/Material | |||
| Doccol silicon-coated filament size 4-0, diameter with coating 0.39mm | Doccol Corporation | 403956PK10 | |
| Natural rubber, e.g. common pacifiers for newborns | Multiple suppliers | ||
| Metal stylet, e.g. from spinal needle 18 GA x 90 mm | Multiple suppliers | ||
| Plastic tubes, e.g. from vein set for infusion 25 GA x 20 mm | Multiple suppliers | ||
| Nonabsorbable suture, coated, braided silk | Multiple suppliers | ||
| Cyanoacrylate surgical glue | Multiple suppliers | ||
| Isoflurane (100% v/v) for veterinary use | Multiple suppliers | ||
References
- Sutherland, B. A., Papadakis, M., Chen, R. L., Buchan, A. M. Cerebral blood flow alteration in neuroprotection following cerebral ischemia. J. Physiol. 589, 4105-4114 (2011).
- Prinz, V., Endres, M. Chapter 3 Modeling focal cerebral ischemia in rodents: Introduction and overview. Rodent models of stroke. Dirnagl, U. , Human Press. (2010).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
- Riva, M., Pappadà, G. B., et al. Hemodynamic monitoring of intracranial collateral flow predicts tissue and functional outcome in experimental ischemic stroke. Exp. Neurol. 233, 815-820 (2012).
- Menon, B. K., Smith, E. E., et al. Regional leptomeningeal score on CT angiography predicts clinical and imaging outcomes in patients with acute anterior circulation occlusions. Am. J. Neuroradiol. 32, 1640-1645 (2011).
- Bang, O. Y., et al. Collateral flow predicts response to endovascular therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 42, 693-699 (2011).
- Shuaib, A., Butcher, K., Mohammad, A. A., Saqqur, M., Liebeskind, D. S. Collateral blood vessels in acute ischaemic stroke: a potential therapeutic target. Lancet Neurol. 10, 909-921 (2011).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Shepherd, A. P., Öberg, P. A. Laser-Doppler Blood Flowmetry. , Kluwer Academic Publishers. (1990).
- Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
- Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation. Stroke. 26, 627-634 (1995).
