Summary
Monitoraggio perfusione cerebrale è stata dimostrata per migliorare l'accuratezza in modelli ictus ischemico. Le difficoltà tecniche spesso limitano l'uso di questo strumento essenziale per la ricerca cerebrovascolare. In questo video, un sistema ottimizzato viene mostrato per ottenere un monitoraggio singolo o multi-sito emodinamico durante intraluminale occlusione dell'arteria cerebrale media nel ratto.
Abstract
Il potenziale traslazionale di pre-clinica corsa dipende dalla precisione di modellazione sperimentale. Monitoraggio della perfusione cerebrale in modelli animali di ictus ischemico acuto permette di confermare il successo occlusione arteriosa ed escludere emorragia subaracnoidea. Monitoraggio della perfusione cerebrale può essere utilizzato anche per studiare la circolazione intracranica collaterale, che sta emergendo come fattori determinanti per la corsa e il risultato possibile bersaglio terapeutico. Nonostante un ruolo riconosciuto di monitoraggio laser Doppler perfusione nel quadro delle attuali linee guida per l'ischemia cerebrale sperimentale, una serie di difficoltà tecniche idonee che ne limitano l'uso diffuso. Uno dei problemi principali è l'ottenimento di un attaccamento sicuro e prolungato di una profonda penetrazione del laser Doppler sonda al cranio animale. In questo video, dimostriamo il nostro sistema ottimizzato per il monitoraggio della perfusione cerebrale durante transitoria occlusione dell'arteria cerebrale media di filamento intraluminale nel ratto. Abbiamo sviluppato in-casa di un metodo semplice per ottenere un supporto su misura per doppia fibra (deep-penetrazione) sonde laser Doppler, che consentono multi-sito di monitoraggio, se necessario. Un monitoraggio continuo e prolungato di perfusione cerebrale potrebbe essere facilmente ottenuta nel cranio intatto.
Introduction
Ricerca traslazionale sui fattori che influenzano emodinamici fisiopatologia e la terapia ictus deve essere attuata, in quanto questa importante questione è spesso paradossalmente trascurato dagli studi di ricerca di base 1.
Monitoraggio perfusione cerebrale è uno strumento essenziale, ma sottoutilizzata, per una precisa modellazione ictus ischemico 2. A parte la conferma di occlusione vaso arterioso e l'esclusione di emorragia subaracnoidea 3, il monitoraggio continuo della perfusione cerebrale può fornire dati utili circa il grado e la consistenza del deficit di perfusione, lo stato funzionale dei vasi collaterali intracranici e l'effetto emodinamico di nuovi approcci terapeutici.
Un recente studio condotto dal nostro gruppo indicano che il multi-sito di monitoraggio emodinamico possono essere utilizzati per valutare la circolazione intracranica garanzia e in grado di prevedere dimensioni dell'infarto e deficit funzionale 4. Questi risultati sperimentali sono consistent con studi clinici che hanno dimostrato che le prestazioni funzionali della circolazione collaterale cerebrale è predittivo di outcome clinico nei pazienti con ictus ischemico 5, 6. Per questo motivo, collaterali cerebrali sono stati proposti come potenziale bersaglio terapeutico nella fase acuta di ictus ischemico 7.
Laser-Doppler (LD) gli strumenti sono lo strumento più utilizzato per misurare la perfusione cerebrale in experimental ictus ischemico e il loro utilizzo è raccomandato dalle linee guida più recenti su questo tema 8. LD perfusione microvascolare strumenti misurano in un piccolo volume corticale, la profondità del segnale registrato dipendere dalla larghezza di separazione delle fibre, con sonde gemelle fibra LD permettono una penetrazione più profonda rispetto alle sonde singole fibre LD 9. Valori di flusso del sangue sono espressi come unità arbitrarie perfusione (PU) che indicano relativo piuttosto che assoluto del flusso sanguigno cerebrale. Taratura di PU è di solito eseguita usinnorme motilità g, secondo le istruzioni del produttore. LD flowmetry permette un continuo monitoraggio dinamico e generazione dei dati quantitativi all'interno della stessa sessione.
Tra i problemi tecnici che attualmente limitano l'uso di LD, una questione importante è l'ottenimento di un attaccamento sicuro e prolungato di una profonda penetrazione del laser Doppler sonda al cranio animale. Ciò è essenziale per il monitoraggio prolungato e se sonde multiple sono utilizzate per diversi territori arteriosi cerebrali, come si sta eseguendo nel nostro laboratorio.
In particolare, prolungato tempo chirurgico è necessario se le sonde sono collegate al cranio con fori bave o viti cranici, mentre poco segnale attaccamento unsecure verifica se fibra singola (bassa penetrazione) LD sonde sono attaccati al cranio dalla semplice colla chirurgica. Twin fibra (profonda penetrazione) sonde LD fornire un segnale più alto e più coerente, ma sono più grandi di sonde a singola fibra e non può esserestaccati al cranio con colla chirurgica solo.
In questo video, dimostriamo il nostro sistema ottimizzato per il monitoraggio della perfusione cerebrale durante transitoria occlusione dell'arteria cerebrale media di filamento intraluminale nel ratto. Descriviamo un metodo semplice per ottenere un efficiente, misura, titolare basso costo per singolo o multiplo twin-fibra (deep-penetrazione) sonde LD, da utilizzare per il monitoraggio prolungato di perfusione cerebrale sul cranio intatto.
La procedura chirurgica per MCAO transitoria nel ratto potrebbe essere visto nel video-articolo di Uluc e collaboratori 10 e non viene mostrato in questo video.
Protocol
1. Come fare il titolare sonda (sito singolo o multi-sito)
- I materiali richiesti sono gomma naturale, piccoli tubi di plastica e un mandrino metallico. Il supporto sonda può essere personalizzato per la dimensione dell'animale, il numero e la dimensione delle sonde laser Doppler, e il territorio vascolare cerebrale che deve essere monitorato.
- Tagliare la gomma naturale della dimensione necessaria (circa 10 mm x 10 mm per un topo 300 g).
- Contrassegnare le posizioni della sonda (s) e il bregma sulla gomma naturale, secondo le coordinate desiderate stereotassiche; per occlusione dell'arteria cerebrale, le coordinate tipico per il nucleo ischemico sono attesi bregma -1 mm, 5 mm lateralmente alla linea mediana, per un territorio periferico borderzone ischemica, le coordinate possono essere previsti due millimetri al bregma, 2 mm lateralmente alla linea mediana.
- Contrassegnare chiaramente la posizione del bregma con una X, questo è il punto di riferimento per il fissaggio del supporto sonda al cranio. </ Li>
- Inserire il mandrino in un tubo di plastica (la sua dimensione deve corrispondere alle dimensioni della sonda).
- Inserire il mandrino nella gomma naturale nel punto in cui la sonda deve essere posizionata, spingere il mandrino nella gomma finché il tubo di plastica è stata inserita nella gomma troppo.
- Estrarre il mandrino.
- Se le sonde sono necessari più, ripetere i passaggi 1,5-1,7 per le posizioni delle altre sonde.
- Opzionale per sonde multiple: avvolgere un nastro intorno ai tubi di plastica per garantire una migliore stabilizzazione delle sonde.
- Facoltativo: eseguire la sterilizzazione chimica del porta sonde diverse per usi futuri.
2. Preparazione prechirurgica
- MCAO modello di corsa è di solito eseguita da un intervento chirurgico di sopravvivenza. In questo caso, come mostrato nel nostro video (tempo di sopravvivenza 24 ore post-chirurgico), il chirurgo utilizza una tecnica asettica con strumenti sterilizzati e forniture.
- Anestetizzare il ratto con isoflurano (3% induction fase, 1,5% di manutenzione).
- Posizionare il ratto in posizione prona sul tavolo operatorio.
- Delicatamente radersi la testa del ratto.
- Applicare una soluzione antisettica per una garza e disinfettare la pelle.
- Somministrare lidocaina 2% 5 mg / kg per via sottocutanea nella zona cranica.
3. Sonda di posizionamento e fissaggio sul cranio intatto
- Girare a destra incisione cutanea paramediana (per il diritto MCAO) e sezionare il tessuto sottocutaneo per raggiungere la fascia cranica (galea aponeurotica).
- Fai una incisione paramediana destra nella fascia cranica ed eseguire smussa per raggiungere l'osso del cranio, preparare una zona ossea del cranio, che è abbastanza grande per l'applicazione del portasonda.
- Si prega di notare: c'è bisogno di perforazione o assottigliamento delle ossa.
- Applicare la soluzione Merbromina per disinfettare e asciugare la superficie del cranio.
- Utilizzare un asciugacapelli (impostato per aria fredda) per accelerare l'asciugatura della superficie del cranio. A questo punto, le suture craniche e del bregma sono chiaramente visibili.
- Personalizzare il supporto sonda tagliando i bordi con le forbici sterili.
- Applicare una piccola quantità di colla chirurgica (cianoacrilato, veterinaria approvato) alla superficie sottostante portasonda, evitando accuratamente l'apertura inferiore dei tubi di plastica (nota: se una notevole quantità di colla rimane tra la superficie ottica della sonda e il cranio, questo può produrre un segnale basso e può danneggiare la sonda dopo usi multipli).
- Applicare il supporto sonda alla superficie del cranio, la compatibilità del bregma con la X il punto di riferimento. Applicare una leggera pressione sul supporto della sonda.
- Utilizzare un asciugacapelli (impostato per aria fredda) per accelerare l'asciugatura della colla chirurgica.
- Fissare il supporto della sonda legando un filo chirurgico intorno al supporto sonda e la testa dell'animale, abbiate cura di posizionare il filo chirurgico sulla mandibola, evitando la regione sottomandibolare e THe collo.
- Opzionale: riempire il tubo di plastica (s) del portasonda con un gel ottico (ad esempio, un comune o gel ultrasuoni elettrocardiografia); questo aumenta la qualità del segnale LD.
- Posizionare la sonda (s) nel porta-sonda e verificare la lettura effettiva del misuratore LD. Utilizzare il flussometro LD secondo le istruzioni del produttore.
- Fissare la sonda (s) legare intorno testa dell'animale, abbiate cura di posizionare il filo chirurgico sulla mandibola, evitando la regione sottomandibolare e il collo.
4. Perfusione di monitoraggio cerebrale durante MCAO
- Posizionare il ratto in posizione supina, evitando accuratamente forze trazionali sulla sonda (s) o porta sonda.
- Avviare il monitoraggio cerebrale durante la perfusione MCAO.
5. Rimozione della sonda (s) e Porta sonda
- Tagliare le suture attorno al (s) sonda, porta sonde e la testa dell'animale.
- Delicatamente smussato sezionare tessuti molli del cranio e la pelle intorno alla base in gomma naturale del portasonda.
- Rimuovere il supporto della sonda.
- Applicare una soluzione antisettica per la superficie del cranio.
- Suturare la pelle del cranio.
6. Assistenza post-operatoria
- Somministrare 2,5 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea per prevenire la disidratazione e mantenere il caldo animale con un cuscinetto riscaldante dopo l'arresto anestesia gassosa.
- Per la chirurgia sopravvivenza: fornire preemptive analgesia con ketoprofene 4 mg / kg per via sottocutanea e ripetere la stessa dose a 12 ore dopo l'intervento
- Nelle nostre condizioni sperimentali, eutanasia è stata eseguita a 24 ore post-chirurgico da CO 2 inalazione.
Representative Results
Transitoria MCAO (60 min) è stata indotta inserendo un siliconato filamento nella carotide esterna. Il filamento è stato poi spinto attraverso l'estremità terminale della carotide interna fino all'origine della MCA, sotto monitoraggio LD. Arteria carotide comune e arteria pterygopalatin state transitoriamente occluse durante l'inserimento chirurgico del filamento. Una rappresentazione schematica della procedura chirurgica è mostrato nella Figura 1A.
Le coordinate cranica per il posizionamento dei due sonde LD sono stati scelti in funzione del territorio sottostante arteriosa. Esperimenti preliminari con gelatina inchiostro perfusione (Figura 1B), hanno mostrato che il nucleo ischemico è atteso nel territorio MCA centrale (bregma -1 mm, 5 mm dalla linea mediana; Probe 1), mentre il flusso collaterale è atteso nel territorio borderzone tra l' rami corticali delle arterie cerebrali medie e anteriore (bregma 2 millimetri, 2 mm dalla linea mediana; sonda 2).
Emodinamica cerebrale è stata studiata utilizzando multi-sito sonde laser Doppler durante l'intero periodo della procedura chirurgica, ossia prima, durante e dopo MCAO (Figura 2). Il deficit di perfusione cerebrale durante MCAO era più piccola e ha mostrato un alto grado di variabilità nella sonda 2 rispetto alla sonda 1, suggerendo differenze inter-individuali nelle prestazioni funzionali di collaterali intracranici in condizioni ischemiche. Il multi-sito di monitoraggio laser Doppler permette inoltre di studiare i cambiamenti emodinamici cerebrali durante l'occlusione delle arterie cerebrali prossimali extra-cranici (arteria carotide comune, carotide interna, arteria pterygopalatin).
Esito ictus è stata valutata 24 ore dopo la riperfusione in volume dell'infarto, calcolato su 19 sezioni consecutive colorate con violetto cresolo (Figura 3), e Garcia funzionale neuroscore 11. Immunoistochimica per specifici marcatori di associato con lesione cerebrale ischemico è stata eseguita, in modo da ottenere una distribuzione topografica di perdita neuronale (proteina associata ai microtubuli 2, MAP2) e penombra ischemica (heat shock protein-70, Hsp70) in relazione al multi-sito di monitoraggio emodinamico di circolazione intracranica (Figura 4).
Figura 1. Perfusione cerebrale durante il monitoraggio MCAO intraluminale nel ratto. A. Rappresentazione schematica della procedura chirurgica per MCAO transitoria. A siliconata filamento è stato utilizzato per occludere l'origine del MCA, dopo essere stato introdotto nella carotide esterna e spinto attraverso l'arteria carotide interna. Prossimali arterie cervicali erano o ligati (carotide esterna) o temporaneamente occluso (arteria pterygopalatin e arteria carotide comune) durante la proceduraDure. B. Un cervello rappresentante viene visualizzato dopo gelatina-ink colorazione. Perfusione transcardiaca di gelatina-inchiostro soluzione sono stati eseguiti 60 min dopo l'insorgenza di ischemia, senza riperfusione. Il cervello normalmente perfuso è stata colorata da gelatina-ink ed è apparso come di colore grigio con il nero vasi colorati, mentre l'area ischemica (non-perfuso) sono rimasti senza macchia (di colore rosa). Coordinate craniche per il posizionamento delle due sonde LD sono mostrati. Sonda 1 = -1 mm dal bregma, a 5 mm dalla linea mediana; sonda 2 = +2 mm dal bregma, 2 mm dalla linea mediana.
Figura 2. Emodinamiche cerebrali registrazioni utilizzando multi-sito Laser sonde Doppler. Un modello emodinamico tipico che suggerisce collaterali intracranici funzionalmente attivi in condizioni di ischemia è mostrato. In questo animale, tracciati LD mostrava una piccolaperfusione deficit er in Probe 2 canali, rispetto a sonda 1 canale, sia in fase di occlusione CCA e MCA occlusione. MCA-O = occlusione dell'arteria cerebrale media. CCA-O = comune occlusione dell'arteria carotide. UC = unità di perfusione.
Figura 3. Sezioni cerebrali rappresentative per il calcolo del volume dell'infarto istologiche sezioni coronali (50 pm; n = 19 con intervallo di 250 micron; bregma 2,5 millimetri a -3,0 mm). Sono fissati in paraformaldeide al 4% e colorate con violetto cresolo 0,1%. Volume dell'infarto è calcolato utilizzando il software di elaborazione immagini ImageJ, corretto per asimmetrie a causa di edema cerebrale inter-emisferiche, ed espressa in mm 3. Clicca qui per ingrandire la figura
Figura 4. Immunocolorazione di marcatori molecolari di perdita neuronale e penombra rappresentativi sezioni cerebrali consecutivi sono presenti, che sono state colorate con violetto cresolo 0,1% (A) o immunostained con marcatori di perdita neuronale (proteina associata ai microtubuli 2, MAP2, B). E penombra ischemica (calore shock protein-70, Hsp70, C).
Discussion
Abbiamo sviluppato in-house un sistema semplice ed economico per un attaccamento sicuro di una o più sonde a doppia fibra (penetrazione) LD al cranio intatto dei ratti durante la procedura MCAO. Seppur apparentemente un problema banale, ottenendo un fissaggio affidabile della sonda LD al cranio è in realtà una questione importante in questo modello sperimentale, in quanto è il presupposto per un segnale di rilevamento regolare e un monitoraggio efficace di perfusione cerebrale.
Procedure invasive, come i fori bave e le viti ossee, di solito prolungare il tempo chirurgico e introdurre variabili più sperimentali relativi alla craniotomia, e questo può scoraggiare i ricercatori ed evitare loro di utilizzare il monitoraggio LD. D'altra parte, l'uso di singola fibra (bassa penetrazione) sonde, che sono più sottili e relativamente facile da incollare direttamente alla superficie del cranio, dà bassa qualità del segnale e non può essere utilizzato in modo affidabile con ratti adulti senza forare o diradamento cranio.
Abbiamo usato materiali semplici e di basso costo, come la gomma naturale, tubi di plastica e un mandrino metallico. Una misura porta sonda può essere prodotta in pochi minuti e adattato alle condizioni sperimentali. Questi porta sonde in grado di ospitare uno o più profonda penetrazione sonde LD, per il monitoraggio classico singolo sito sul core ischemico o per più siti di monitoraggio in diversi territori arteriosi nello stesso emisfero o tra i due emisferi. Porta sonde molti potrebbe essere prodotta, chimicamente sterilizzato, e conservati per uso futuro. Veterinaria approvato colla chirurgica (cyanoacrilate), accelerati da aria fredda, è utilizzato per fissare il supporto sonda intatta la superficie del cranio ratto, secondo le coordinate craniche desiderati. Infine, la sonda set-up è ulteriormente fissato in posizione mediante suture comuni.
Il tempo complessivo di questa sonda LD set-up, dopo padroneggiare questa tecnica, è di circa 10 min.
Come ho mostraton questo video, regolarmente monitorare la perfusione cerebrale nel MCA centrale territorio (LD sonda 1: cuore ischemica) e nelle regioni periferiche MCA territorio (LD sonda 2: principalmente una zona penombra). Nel nostro recente studio abbiamo dimostrato che la variabilità delle variazioni del flusso sanguigno in LD sonda 2 (media 52% ± 16% SD, rispetto al basale) è maggiore rispetto al LD sonda 1 (media 31% ± 6% SD, rispetto al basale) e può essere usato per predire 4 tempi outcome.
Possiamo fornire alcuni consigli sulla risoluzione dei problemi per i ricercatori che desiderano utilizzare il nostro in-house sistema sviluppato. All'inizio dell'esperimento, fare attenzione ad asciugare molto bene la superficie del cranio (con Merbromina e aria fredda) prima di collegare il supporto sonda per evitare il distacco prematuro. Inoltre, assicurarsi di applicare la colla sulla gomma naturale, evitando il contatto con l'estremità aperta del tubo di plastica e la superficie ottica della sonda LD, per impedire poco segnale potenziali danni alla sonda. Nel legare la sutura intorno alla testa dell'animale, prestare attenzione per evitare l'ostruzione delle vie aeree (questo è impedito posizionando la sutura sopra l'osso mandibolare). Dopo aver posizionato e garantire le sonde, fare attenzione a non i cavi delle sonde di trazione quando si accende l'animale in posizione supina per la chirurgia del collo dell'utero, questo passaggio richiede di solito due persone, una persona che tiene l'animale e una seconda persona che tiene i cavi delle sonde e delicatamente posizionamento nella posizione desiderata. Infine, l'eventuale contaminazione del sangue del twin-fibra LD sonda è facilmente gestito seguendo le istruzioni fornite dal produttore.
Il nostro sistema ottimizzato per il monitoraggio di perfusione cerebrale, come mostrato in questo video, potrebbe fornire una alternativa più semplice, più rapido e più affidabile per la sonda set-up sistemi attualmente venduti da aziende commerciali in questo campo. Inoltre, si ritiene che l'uso di questo sistema da altri ricercatori possono aumentare il pernoy dell'emodinamica cerebrale nel campo sperimentale corsa, che portano allo sviluppo di una nuova generazione di terapie collaterali cerebrali.
Disclosures
Il finanziamento per la produzione di questo video-articolo è stato fornito da Moor Instruments Ltd (Axminster, Devon, Regno Unito), che produce gli strumenti laser Doppler riportati nel nostro studio sperimentale.
Il protocollo sperimentale è stato approvato dalla commissione per l'Animal Care dell'Università degli Studi di Milano Bicocca, in conformità con le linee guida nazionali per l'uso di animali da laboratorio (DL 116/1992) e la direttiva dell'Unione europea per esperimenti su animali (2010/63/UE ), su licenza del progetto (n. 219/2011-B) da parte del Ministero della Salute italiano.
Acknowledgments
Ringraziamo la signora Caroline Robertson per il voice-over e la signora Elena Pirovano per la sua assistenza nella produzione video. Questo studio è stato sostenuto dall'Università degli Studi di Milano Bicocca, "Fondo di Ateneo 2011".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MoorVMS-LDF 2-channel Laser Doppler Monitor |  Moor Instruments |
||
| VP12 probe | Moor Instruments |
||
| Reagent/Material | |||
| Doccol silicon-coated filament size 4-0, diameter with coating 0.39mm | Doccol Corporation | 403956PK10 | |
| Natural rubber, e.g. common pacifiers for newborns | Multiple suppliers | ||
| Metal stylet, e.g. from spinal needle 18 GA x 90 mm | Multiple suppliers | ||
| Plastic tubes, e.g. from vein set for infusion 25 GA x 20 mm | Multiple suppliers | ||
| Nonabsorbable suture, coated, braided silk | Multiple suppliers | ||
| Cyanoacrylate surgical glue | Multiple suppliers | ||
| Isoflurane (100% v/v) for veterinary use | Multiple suppliers | ||
References
- Sutherland, B. A., Papadakis, M., Chen, R. L., Buchan, A. M. Cerebral blood flow alteration in neuroprotection following cerebral ischemia. J. Physiol. 589, 4105-4114 (2011).
- Prinz, V., Endres, M. Chapter 3 Modeling focal cerebral ischemia in rodents: Introduction and overview. Rodent models of stroke. Dirnagl, U. , Human Press. (2010).
- Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).
- Riva, M., Pappadà, G. B., et al. Hemodynamic monitoring of intracranial collateral flow predicts tissue and functional outcome in experimental ischemic stroke. Exp. Neurol. 233, 815-820 (2012).
- Menon, B. K., Smith, E. E., et al. Regional leptomeningeal score on CT angiography predicts clinical and imaging outcomes in patients with acute anterior circulation occlusions. Am. J. Neuroradiol. 32, 1640-1645 (2011).
- Bang, O. Y., et al. Collateral flow predicts response to endovascular therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 42, 693-699 (2011).
- Shuaib, A., Butcher, K., Mohammad, A. A., Saqqur, M., Liebeskind, D. S. Collateral blood vessels in acute ischaemic stroke: a potential therapeutic target. Lancet Neurol. 10, 909-921 (2011).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. Rodent Stroke Model Guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).
- Shepherd, A. P., Öberg, P. A. Laser-Doppler Blood Flowmetry. , Kluwer Academic Publishers. (1990).
- Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
- Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation. Stroke. 26, 627-634 (1995).
