Summary
Monitorización de la perfusión cerebral se ha demostrado para mejorar la precisión en modelos de ictus isquémicos. Las dificultades técnicas a menudo limitan el uso de esta herramienta esencial para la investigación cerebrovascular. En este vídeo, un sistema optimizado se muestra para obtener una monitorización hemodinámica única o multi-sitio durante la oclusión intraluminal de la arteria cerebral en ratas.
Abstract
El potencial de traslación de la investigación preclínica carrera depende de la precisión de los modelos experimentales. Monitorización de la perfusión cerebral en modelos animales de accidente cerebrovascular isquémico agudo permite confirmar la oclusión arterial éxito y no incluyen hemorragia subaracnoidea. Monitorización de la perfusión cerebral también puede ser usado para estudiar la circulación colateral intracraneal, que está surgiendo como un poderoso factor de pronóstico del accidente cerebrovascular y un posible objetivo terapéutico. A pesar de un reconocido papel de supervisión Laser Doppler perfusión en el marco de las directrices actuales para la isquemia cerebral experimental, una serie de dificultades técnicas existentes que limitan su uso generalizado. Uno de los principales problemas es la obtención de una fijación segura y prolongada de una profunda penetración de la sonda de láser Doppler en el cráneo animal. En este video, mostramos nuestro sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral durante la oclusión transitoria de la arteria cerebral media por filamento intraluminal en la rata. Hemos desarrollado in-casa de un método simple para obtener un soporte hecho a medida para doble fibra (profundidad de penetración) láser sondas Doppler, que permiten multi-sitio de monitoreo si es necesario. Una vigilancia continua y prolongada de la perfusión cerebral puede ser fácilmente obtenido en el cráneo intacto.
Introduction
Investigación traslacional sobre los factores hemodinámicos que afectan a la fisiopatología y el tratamiento trazo debe aplicarse, ya que esta cuestión importante es a menudo descuidado paradójicamente por estudios de investigación básica 1.
Monitorización de la perfusión cerebral es una herramienta esencial, pero infrautilizado, para modelar con precisión el accidente cerebrovascular isquémico 2. Aparte de la confirmación de la oclusión del vaso arterial y la exclusión de la hemorragia subaracnoidea 3, la supervisión continua de perfusión cerebral puede proporcionar datos útiles sobre el grado y la consistencia de déficit de perfusión, el estado funcional de los vasos colaterales intracraneales y el efecto hemodinámico de nuevos enfoques terapéuticos.
Un estudio reciente de nuestro grupo indican que el control hemodinámico multi-sitio puede ser utilizada para evaluar la circulación colateral intracraneal y puede predecir el tamaño del infarto y déficit funcional 4. Estos resultados experimentales son consistent con estudios clínicos que demostraron que el rendimiento funcional de la circulación colateral cerebral es predictivo de la evolución clínica en pacientes con ictus isquémico 5, 6. Por esta razón, los colaterales cerebrales se han recomendado como una potencial diana terapéutica en la fase aguda del accidente cerebrovascular isquémico 7.
Laser-Doppler (LD) Los instrumentos son la herramienta más utilizada para medir la perfusión cerebral en el ictus isquémico experimental y su uso está recomendado por las guías recientes sobre el tema 8. LD instrumentos miden la perfusión microvascular en un pequeño volumen cortical, la profundidad de la señal grabada ser dependiente de la anchura de separación de las fibras, con dos sondas de fibra LD permitiendo una penetración más profunda en comparación con las sondas de fibra única LD 9. Los valores de flujo de sangre se expresan como unidades arbitrarias de perfusión (PU) que indican relativa en lugar de absoluta flujo sanguíneo cerebral. Calibración de PU se realiza generalmente usinnormas g motilidad, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. LD flujometría permite un monitoreo continuo dinámico y la generación de datos cuantitativos dentro de la misma sesión.
Entre los problemas técnicos que actualmente limitan el uso de LD, una cuestión importante es la obtención de un apego seguro y prolongado de una profunda penetración de la sonda láser Doppler en el cráneo animal. Esto es esencial para el control prolongado y si se utilizan varias sondas para diferentes territorios arteriales cerebrales, ya que estamos llevando a cabo en nuestro laboratorio.
En particular, el tiempo quirúrgico prolongado es necesaria si las sondas están unidas al cráneo utilizando orificios de trepanación o tornillos craneales, mientras que la señal pobre y la unión no segura se produce si sola fibra (baja penetración) LD sondas están unidas al cráneo mediante cola quirúrgica simple. Gemelas de fibra (de penetración profunda) sondas LD proporcionar una señal mayor y más consistente, pero son más grandes que las sondas de fibra individuales, no puede ser entached en el cráneo con pegamento quirúrgico solamente.
En este video, mostramos nuestro sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral durante la oclusión transitoria de la arteria cerebral media por filamento intraluminal en la rata. Se describe un método simple para obtener una eficiente, personalizado titular hecho, de bajo costo para un solo o múltiples de doble fibra (profundidad de penetración) sondas de LD, que se utilizará para el seguimiento prolongado de la perfusión cerebral durante el cráneo intacto.
El procedimiento quirúrgico para MCAO transitoria en la rata podría ser visto en el video-artículo de Uluc y compañeros de trabajo 10 y no se muestra en este vídeo.
Protocol
1. Cómo hacer que el soporte giratorio (de un solo sitio o varios centros)
- Los materiales necesarios son el caucho natural, pequeños tubos de plástico y un estilete de metal. El soporte de la sonda puede ser personalizado para el tamaño del animal, el número y tamaño de las sondas láser Doppler, y el territorio vascular cerebral que necesita ser monitorizado.
- Cortar el caucho natural del tamaño necesario (aproximadamente 10 mm x 10 mm para una rata de 300 g).
- Marcar las posiciones de la sonda (s) y el bregma en el caucho natural, de acuerdo con las coordenadas estereotáxicas deseados; para la oclusión de la arteria cerebral media, las coordenadas típico para el núcleo isquémico se espera a bregma -1 mm, 5 mm lateral a la línea media; para un territorio isquémico borderzone periférica, las coordenadas pueden ser esperados en bregma +2 mm, 2 mm lateral a la línea media.
- Marcar muy claramente la posición del bregma con una X, éste es el punto de referencia para fijar el soporte de la sonda en el cráneo. </ Li>
- Insertar el estilete dentro de un pequeño tubo de plástico (su tamaño debe coincidir con el tamaño de la sonda).
- Insertar el estilete en el caucho natural en el punto donde la sonda tiene que ser colocado; empujar el estilete en el caucho hasta que el tubo de plástico ha sido insertado en el caucho también.
- Retire el estilete.
- Si se necesitan varias sondas, repita los pasos 1.5-1.7 para las posiciones sonda.
- Opcional para múltiples sondas: envolver una cinta alrededor de los tubos de plástico para garantizar una mejor estabilización de las sondas.
- Opcional: realizar la esterilización química de los titulares de varias sondas para usos futuros.
2. Preparación prequirúrgica
- MCAO modelo de carrera se realiza generalmente como una cirugía de supervivencia. En este caso, como se muestra en nuestro vídeo (tiempo de supervivencia 24 horas después de la cirugía), el cirujano utiliza una técnica aséptica con instrumentos esterilizados y suministros.
- Se anestesia la rata con isoflurano (3% induction fase, 1,5% de mantenimiento).
- Coloque el ratón en la posición en decúbito prono sobre la mesa de operaciones.
- Suavemente afeitar la cabeza de la rata.
- Aplique una solución antiséptica para una gasa y desinfectar la piel.
- Administrar lidocaína 2% 5 mg / kg por vía subcutánea en la zona craneal.
3. Sonda de posicionamiento y sujeción sobre el cráneo intacto
- Haga una incisión paramediana derecha de la piel (por derecho MCAO) y disecar el tejido subcutáneo para alcanzar la fascia craneal (galea aponeurótica).
- Hacer una incisión paramediana derecha en la fascia craneal y realizar una disección roma para alcanzar el hueso del cráneo; preparar un área de hueso del cráneo, que es lo suficientemente grande para la aplicación del soporte de la sonda.
- Atención: no hay necesidad de perforar o adelgazamiento de los huesos.
- Aplique la solución Merbromina para desinfectar y secar la superficie del cráneo.
- Use un secador de pelo (fijada en el aire frío) para acelerar el secado de la superficie del cráneo. En este punto, las suturas craneales y el bregma son claramente visibles.
- Personalice el soporte de la sonda cortando los bordes con unas tijeras estériles.
- Aplique una pequeña cantidad de pegamento quirúrgico (cianoacrilato, veterinario aprobado) a la superficie por debajo del soporte de la sonda, evitando cuidadosamente la abertura inferior de los tubos de plástico (tenga en cuenta: si una cantidad significativa de restos de pegamento entre la superficie óptica de la sonda y el cráneo, esto puede producir una señal de bajo y puede dañar la sonda después de múltiples usos).
- Aplicar el soporte de la sonda a la superficie del cráneo, el bregma cuidadosamente a juego con el punto de referencia X. Aplique una leve presión sobre el soporte de la sonda.
- Use un secador de pelo (fijada en el aire frío) para acelerar el secado del pegamento quirúrgico.
- Fijar el soporte de la sonda mediante la vinculación de un hilo quirúrgico alrededor del soporte de la sonda y la cabeza del animal; tener cuidado de colocar el hilo quirúrgico sobre la mandíbula, evitando la región submandibular y the cuello.
- Opcional: llenar el tubo de plástico (s) del soporte de la sonda con un gel óptico (por ejemplo, un ultrasonido común o gel electrocardiografía), lo que aumentará la calidad de la señal LD.
- Coloque la sonda (s) en el soporte de la sonda y verificar la lectura real del medidor de caudal LD. Utilice el medidor de caudal LD según las instrucciones del fabricante.
- Asegure la sonda (s) atándolos alrededor de la cabeza del animal; tener cuidado de colocar el hilo quirúrgico sobre la mandíbula, evitando la región submandibular y el cuello.
4. Monitoreo perfusión cerebral durante la MCAO
- Coloque el ratón en la posición supina, evitando cuidadosamente las fuerzas traccionales en la sonda (s) o titular de la sonda.
- Empiece monitorización de la perfusión cerebral durante MCAO.
5. Extracción de la sonda (s) y de la Sonda Holder
- Cortar las suturas alrededor de la sonda (s), el soporte de la sonda y la cabeza del animal.
- Suavemente contundente disección de los tejidos blandos del cráneo y la piel alrededor de la base de goma natural del soporte de la sonda.
- Retire el soporte de la sonda.
- Aplicar una solución antiséptica para la superficie del cráneo.
- Sutura de la piel del cráneo.
6. Cuidados postoperatorios
- Administrar 2,5 ml de solución salina por vía subcutánea para prevenir la deshidratación y mantener caliente el animal usando una compresa caliente después de dejar de anestesia gaseosa.
- Para la cirugía de la supervivencia: proporcionar analgesia preventiva con Ketoprofeno 4 mg / kg por vía subcutánea y repetir la misma dosis a las 12 h post-operativamente
- Bajo nuestras condiciones experimentales, la eutanasia se realizó a las 24 horas después de la cirugía por inhalación de CO 2.
Representative Results
Transitoria MCAO (60 min) fue inducida mediante la inserción de un filamento recubierto de silicona en la arteria carótida externa. El filamento se empuja entonces a través del extremo terminal de la arteria carótida interna hasta el origen de la MCA, con monitorización LD. Arteria carótida común y la arteria ocluida fueron pterygopalatin transitoriamente durante la inserción quirúrgica del filamento. Una representación esquemática del procedimiento quirúrgico se muestra en la Figura 1A.
Las coordenadas craneal para posicionar las dos sondas LD fueron elegidos en función del territorio arterial subyacente. Los experimentos preliminares con gelatina-tinta de perfusión (Figura 1B) mostró que el núcleo isquémico se espera en el territorio central MCA (bregma -1 mm, 5 mm de la línea media; Sonda 1), mientras que el flujo colateral que se espera en el territorio borderzone entre la ramas corticales de las arterias cerebrales medias y anterior (bregma +2 mm, 2 mm desde la línea media; Probe 2).
Hemodinámica cerebral se estudió usando multi-sitio de sondas Doppler láser durante todo el período del procedimiento quirúrgico, es decir, antes, durante y después de MCAO (Figura 2). El déficit de perfusión cerebral durante la MCAO era más pequeña y mostró un alto grado de variabilidad en la sonda 2 en comparación con la sonda 1, lo que sugiere diferencias interindividuales en el rendimiento funcional de colaterales intracraneales durante la isquemia. El sitio multi-láser Doppler de seguimiento también permite estudiar las alteraciones hemodinámicas cerebrales durante la oclusión proximal de extra-craneales arterias cerebrales (arteria carótida común, la arteria carótida interna, arteria pterygopalatin).
Pronóstico del accidente cerebrovascular se evaluó 24 horas después de la reperfusión por el volumen del infarto, calculado en 19 secciones consecutivas teñidas con violeta de cresilo (Figura 3), y García funcional neuroscore 11. La inmunohistoquímica para marcadores específicos asociados con la lesión cerebral isquémica se realizó, con el fin de obtener una distribución topográfica de la pérdida neuronal (proteína asociada a microtúbulos 2, MAP2) y penumbra isquémica (proteína de choque térmico-70, Hsp70) en relación con el control hemodinámico multi-sitio de la circulación intracraneal (Figura 4).
Figura 1. Monitorización de la perfusión cerebral durante la MCAO intraluminal en la rata. A. Representación esquemática del procedimiento quirúrgico para MCAO transitoria. Un filamento revestido de silicona se usó para ocluir el origen de la MCA, después de ser introducido en la arteria carótida externa y se empujó a través de la arteria carótida interna. Proximal arterias cervicales se ligaron bien (arteria carótida externa) o transitoriamente ocluida (arteria pterygopalatin y la arteria carótida común) durante el procedimientomiento. B. Un cerebro representativo se muestra después de gelatina de tinta manche. Perfusión transcardiaca de gelatina tinta solución se realizaron 60 min después de la aparición de la isquemia, sin reperfusión. El cerebro normalmente perfundidos se tiñó por gelatina tinta y apareció como de color gris con negro vasos teñidos, mientras que el área isquémica (no perfundido) permanecieron sin teñir (color rosa). Craneales coordenadas para posicionar las dos sondas de LD se muestran. Sonda 1 = -1 mm desde el bregma, 5 mm de la línea media; Probe 2 = 2 mm desde el bregma, 2 mm de la línea media.
Figura 2. Hemodinámicas cerebrales utilizando grabaciones multi-sitio de sondas de láser Doppler. Un patrón hemodinámico típico que sugiere colaterales intracraneales funcionalmente activos bajo condiciones de isquemia se muestra. En este animal, los trazados de LD mostró una pequeñaer déficit de perfusión en la sonda de 2 canales, en comparación con la sonda 1 canal, tanto durante la CCA oclusión y oclusión MCA. MCA-O = oclusión de arteria cerebral media. CCA-O = oclusión arteria carótida común. Unidad = unidades de la perfusión.
Figura 3. Representante secciones cerebrales para el cálculo del volumen de infarto histológicos secciones coronales (50 micras; n = 19 con intervalo de 250 micras; bregma 2,5 mm a -3,0 mm). Se fijan en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con violeta de cresilo 0,1%. Volumen del infarto se calcula utilizando ImageJ software de procesamiento de imagen, corregido para inter-hemisféricos asimetrías debido a un edema cerebral, y se expresa en mm 3. Haga clic aquí para ampliar la cifra
Figura 4. La inmunotinción de los marcadores moleculares de la pérdida neuronal y la penumbra representativos secciones del cerebro se muestran consecutivos, que se tiñeron con violeta de cresilo 0,1% (A) o inmunotiñeron con los marcadores de la pérdida neuronal (proteína asociada a microtúbulos 2, MAP2, B). Y penumbra isquémica (calor proteína de choque-70, Hsp70, C).
Discussion
Hemos desarrollado internamente un sistema simple y de bajo costo para una fijación segura de una o varias sondas de doble fibra LD (penetración profunda) en el cráneo intacto de ratas durante el procedimiento MCAO. Aunque al parecer un problema trivial, la obtención de una fijación fiable de la sonda de LD al cráneo es realmente un problema importante en esta configuración experimental, ya que es el requisito previo para una detección de señal suave y un control exitoso de la perfusión cerebral.
Los procedimientos invasivos, tales como trepanaciones y tornillos para huesos, por lo general prolongar el tiempo quirúrgico e introducir más variables experimentales relacionados con la craneotomía, y esto puede desalentar a los investigadores y los que se abstengan de utilizar el seguimiento LD. Por otro lado, el uso de una sola fibra (baja penetración) sondas, que son más delgados y más fácil relativamente a ser pegado directamente a la superficie del cráneo, da de baja calidad de la señal y no puede utilizarse de forma fiable con ratas adultas sin la perforación o adelgazamiento del cráneo.
Se utilizaron materiales simples y de bajo costo, tales como caucho natural, tubos de plástico y un estilete de metal. Un soporte de sonda de medida se puede producir en unos pocos minutos y adaptado a las condiciones experimentales. Estos titulares de la sonda puede alojar uno o más de profundidad de penetración sondas LD, para el control clásico único sitio en el núcleo isquémico o para múltiples sitios de monitoreo en diferentes territorios arteriales en el mismo hemisferio o en los dos hemisferios. Muchos titulares de la sonda podría ser producido, esterilizar químicamente, y se almacena para uso futuro. Veterinario aprobado por pegamento quirúrgico (cianoacrilato), acelerado por aire frío, se utiliza para unir el soporte de la sonda a la superficie intacta de la calavera de rata, de acuerdo con las coordenadas deseadas craneales. Finalmente, la sonda puesta a punto se ve asegurada en su lugar por medio de suturas comunes.
El tiempo total de esta sonda LD puesta en marcha, después de dominar esta técnica, es de aproximadamente 10 min.
Como he mostradon este vídeo, de manera rutinaria controlar la perfusión cerebral en el territorio central MCA (LD sonda 1: núcleo isquémico) y en el periférico territorio MCA (LD sonda 2: principalmente una zona de penumbra). En nuestro estudio reciente mostró que la variabilidad de los cambios de flujo sanguíneo en LD sonda 2 (media 52% ± 16% SD, en comparación con la línea de base) es mayor en comparación con LD sonda 1 (media 31% ± 6% SD, en comparación con la línea de base) y puede ser usado para predecir 4 pronóstico del accidente cerebrovascular.
Podemos proporcionar algunos consejos de solución de problemas para los investigadores que deseen utilizar nuestro propio sistema desarrollado. Al comienzo del experimento, tener cuidado para secar muy bien la superficie del cráneo (con Merbromina y el aire frío) antes de fijar el soporte de la sonda para evitar el desprendimiento prematuro. Además, asegúrese de aplicar la cola sobre el caucho natural, evitando el contacto con el extremo abierto del tubo de plástico y la superficie óptica de la sonda de LD, para evitar que la señal pobre y el daño potencial a la sonda. Al atar la sutura alrededor de la cabeza del animal, tenga cuidado para evitar la obstrucción de las vías respiratorias (esto se evita mediante la colocación de la sutura en el hueso mandibular). Después de colocar y asegurar las sondas, tenga cuidado de no cables de las sondas de tracción al girar el animal en decúbito supino para la cirugía cervical, este paso suele requerir dos personas, una persona que tiene el animal y una segunda persona que sostiene los cables de las sondas y suavemente colocando a la posición deseada. Finalmente, eventual contaminación de la sangre de la sonda de doble fibra de LD se maneja fácilmente siguiendo las instrucciones de limpieza proporcionadas por el fabricante.
Nuestro sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral, como se muestra en este video, podría ser una alternativa más fácil, más rápido y más fiable a la sonda puesta a punto de sistemas que se venden actualmente por empresas comerciales en este campo. Además, creemos que el uso de este sistema por otros investigadores pueden mejorar el espárragoy de la hemodinámica cerebral en el accidente cerebrovascular experimental campo, que conducen al desarrollo de una nueva generación de agentes terapéuticos colaterales cerebrales.
Disclosures
El financiamiento para la producción de este video-artículo fue proporcionado por Moor Instruments Ltd (Axminster, Devon, Reino Unido), que produce los instrumentos de láser Doppler muestra en nuestro estudio experimental.
El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Milano Bicocca, de acuerdo con las directrices nacionales sobre el uso de animales de laboratorio (DL 116/1992) y la Directiva de la Unión Europea para los experimentos con animales (2010/63/UE ), bajo licencia de proyecto (n. 219/2011-B) del Ministerio de Sanidad italiano.
Acknowledgments
Damos las gracias a la Sra. Caroline Robertson por la voz en off y la señora Elena Pirovano por su ayuda en la producción de video. Este estudio fue apoyado por la Universidad de Milano Bicocca, "Fondo di Ateneo 2011".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MoorVMS-LDF 2-channel Laser Doppler Monitor |  Moor Instruments |
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| VP12 probe | Moor Instruments |
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| Reagent/Material | |||
| Doccol silicon-coated filament size 4-0, diameter with coating 0.39mm | Doccol Corporation | 403956PK10 | |
| Natural rubber, e.g. common pacifiers for newborns | Multiple suppliers | ||
| Metal stylet, e.g. from spinal needle 18 GA x 90 mm | Multiple suppliers | ||
| Plastic tubes, e.g. from vein set for infusion 25 GA x 20 mm | Multiple suppliers | ||
| Nonabsorbable suture, coated, braided silk | Multiple suppliers | ||
| Cyanoacrylate surgical glue | Multiple suppliers | ||
| Isoflurane (100% v/v) for veterinary use | Multiple suppliers | ||
References
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