Summary
הליך זה מדגים כיצד לבודד מהמוח המבוגר עכבר קרומי המיטוכונדריה או MAMs הקשורים ER וmicrodomain המועשרים glycosphingolipid השברים מMAMs ותכשירי המיטוכונדריה.
Abstract
האברונים תאיים הם מבנים דינמיים מאוד עם צורות שונות ובהרכב, שכפופים לרמזים פנימיים וחיצוניים של תאים ספציפיים. הקרומים שלהם לעתים קרובות באתרי juxtaposed מגע מוגדר, אשר הופכים לרכזות חילופי מולקולות איתות ורכיבי קרום 1,2,3,4. את microdomains הקרום בין organellar שנוצרו בין reticulum endoplasmic (ER) ואת המיטוכונדריה בפתיחת Ca IP3 הרגיש 2 + ערוץ ידוע כמו קרומים קשורים-ER מיטוכונדריה או MAMs 4,5,6. רכב חלבונים / שומנים והתכונות הביוכימיות של אתרי מגע קרום אלה נחקרו רבים בעיקר בהקשר לתפקידם בוויסות התאי Ca 2 + 4,5,6. ER משמש כחנות העיקרית של Ca 2 + התאי, ובמסגרת זו מווסתת מספר עצום של תהליכים תאיים במורד זרם של Ca 2 + איתות, כוללuding מתקפל וחלבון maturation7 חלבון שלאחר translational. המיטוכונדריה, לעומת זאת, לשמור על Ca 2 + הומאוסטזיס, על ידי אגירת cytosolic Ca 2 + ריכוז ובכך למנוע את החניכה של מסלולים אפופטוטיים במורד הזרם של Ca 2 + איזון 4,8. האופי הדינמי של MAMs הופך אותם אידיאליים אתרים לנתח מנגנונים תאיים בסיסיים, כולל Ca 2 + איתות ובקרה של המיטוכונדריה Ca 2 + ריכוז, ביוסינתזה שומנים ותחבורה, חילוף חומרים של אנרגיה ותא הישרדות 4,9,10,11,12. כמה פרוטוקולים שתארו לטיהור microdomains אלה מרקמת כבד ותאים בתרבית 13,14.
לוקח שיטות שפורסמו בעבר בחשבון, יש לנו מותאם פרוטוקול לבידוד של המיטוכונדריה וMAMs ממוח העכבר הבוגר. להליך זה יש לנו הוספתי שלב נוסף טיהור, כלומר מיצוי x100 טריטון, שדוארnables הבידוד של שבריר glycosphingolipid המועשר microdomain (GEM) של MAMs. הכנות GEM אלה חולקים מספר מרכיבי חלבון עם רפסודות caveolae ושומנים בדם, הנגזרות מקרום הפלזמה או קרומים תאיים אחרים, והציעו לשמש איסוף נקודות עבור האשכולות של חלבוני הקולטן ולאינטראקציות בין חלבונים 4,15.
Protocol
הפרוטוקול הבא מיועד לבידוד והטיהור של MAMs ופנינים ממוח העכבר
פתרונות הנדרשים לבידוד, MAMs ופניני מיטוכונדריה
חלוקה להשיג הכנת המיטוכונדריה גולמית:
פתרון: סוכרוז 0.32 מ ', 1 המ"מ 3 NaHCO, 1 המ"מ MgCl 2, 0.5 מ"מ CaCl 2 + מעכבים פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך)
פתרון ב ': סוכרוז 0.32 מ', 1 המ"מ NaHCO 3 + מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך)
בידוד MAMs:
בידוד בינוני: 250 המ"מ מניטול, pH 5 המ"מ HEPES 7.4, 0.5 המ"מ EGTA, 0.1% BSA
מאגר השיפוע: 225 המ"מ מניטול, pH 25 המ"מ HEPES 7.5, 1 המ"מ EGTA, 0.1% BSA (ריכוז סופי)
בידוד פנינים:
תוכן "> הצפת חילוץ GEM: 25 HEPES mM pH 7.5, 0.15 מ 'NaCl, 1% Triton X-100 + מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך)מאגר GEM Solubilising: 50 mM טריס-HCl, 8.8 pH, 5 המ"מ EDTA, 1% SDS + מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך).
1. היפוך חלוק ראשון שלב subcellular: הסרה של גרעינים, תאי Unlysed ופסולת ניידת
- להרדים את העכבר בתא 2 CO.
- מייד להסיר מוח, לחצות, להניח ב2 צינורות מ"ל על קרח ולשקול.
שים לב: שמור על חצי מוח נפרד לאורך כל ההליך. להלן חל על הטיפול בחצי מוח אחד.
- מוח מניח מחצית במטחנה מראש מצוננת 2 מיליליטר זכוכית Dounce רקמות המכילה א פתרון 1 מ"ל הקר הומוגני עם 15 משייכות כוללות של עלי פינוי גדול.
- העברה לצינור 15 מ"ל בז, על קרח, ולדללhomogenates עד 10 כרכים w / v, למשל 0.225 גרם לרמה של 2.25 מ"ל.
- צנטריפוגה מדגם ב 1400 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C.
- הסר בזהירות את supernatant והעברה לצינור צנטריפוגה זכוכית עגולה עם תחתית 30 מ"ל, על קרח. הקפד לא להפריע לגלולה.
- Resuspend הגלולה באותן 10 כרכים של פתרון. הומוגני באותה המטחנה, עם 3-6 משייכות של עלי סיקול קטן, 1 מ"ל בכל פעם.
- העברה לצינור טרי 15 מ"ל בז וצנטריפוגה XG ב 710 עבור 10 דקות ב 4 ° C. התוצאה היא גלולה של גרעינים ופסולת של תאים.
- הסר בזהירות את supernatant וברכה עם supernatant שמר בשלב 1.6.
2. שלב שנייה: בידוד המיטוכונדריה גולמי
- צנטריפוגה supernatants ב13800 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C.
- העברת supernatant לצינור צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear, על קרח
- Resuspend גלול ב 10 כרכי פתרון. הומוגני באותה המטחנה, עם 3-6 משייכות של עלי סיקול קטן, 1 מ"ל בכל פעם.
- צנטריפוגה כצעד 2.1.
- חזור על שלבים 2.2-2.4.
- הגלולה המתקבלת היא שבריר המיטוכונדריה מועשרת. ברכה את supernatants (cytosol ומיון), מכסה בparafilm ולשמור על קרח.
- Resuspend הגלולה עם 6 משייכות של עלי סיקול קטן, ב4.8 המ"ל / גרם (ז נקרא משקל המוח המקורי) של הפתרון של B, בhomogeniser טרי.
- שימוש pipettes הזכוכית פסטר, להכין Gradient סוכרוז רציף בצינורות צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear, והוסיף מאוחר יותר לחלק התחתון של הצינור כדלקמן, בזהירות, להבטיח ללא בועות נוצרות:
Resupended הגלולה (0.32 סוכרוז M)
3 המ"ל סוכרוז 850 מ"מ (במ"מ 3 NaHCO 1)
3 סוכרוז מ"ל 1 M (במ"מ 3 NaHCO 1)
3 1.2 המ"ל סוכרוז M (במ"מ NaHCO 13) - צנטריפוגה ב XG 82500 ל2 שעות ב 4 ° C. הפרדת התוצאה בסוף השיפוע תהיה לייצר שלוש להקות וגלולות: 1) המיאלין ומזהמים אחרים בממברנה (0.32 מ - 0.85 ממשק M), 2) ER, Golgi, קרום פלזמה (0.85 מ '- 1 ז ממשק); 3) synaptosomes (1 מ - 1.2 מ 'ממשק): 4) גולמי המיטוכונדריה (גלולה) המשמש לטיהור הצעדים הבאים
3. בידוד של ממברנה ER-המיטוכונדריה משויכת, MAMs
- Resuspend גולמי מיטוכונדריה המבודדת טרי מהחצי מוח אחד, בבידוד בינוני מ"ל 2 המכילים מעכבי פרוטאז הוסיפו טרי.
- הכן 30% שיפוע עם Percoll מיליליטר Gradient המאגר 8 לכל חצי מהמוח, ומקום בTube צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear.
* הערה: ודא חיץ שיפוע מרוכז יותר (1.43 ימים) כדי להשיג ריכוז סופי נכון אחרי דiluting Percoll עד 30%.
- השעית המיטוכונדריה שכבה על גבי שיפוע מוכן לאט, כדי למנוע בועות.
- צנטריפוגה ב XG 95000 למשך 30 דקות, 4 ° C.
- הסר את הבר הכבד (רצועה תחתונה) הראשון עם זכוכית פיפטה פסטר ולהעביר לצינור זכוכית עגולה בתחתית טרי, על קרח.
- הסר את בר האור (רצועה העליונה) השני עם זכוכית פיפטה פסטר אחר ולהעביר לשפופרת זכוכית נפרדת טריה ישבן עגול, על קרח.
- למהול שני השברים שנאספו בשלב 3.5 עם 10 מ"ל בינוני בידוד וצנטריפוגה XG ב 6300 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
- השליכו את supernatant מהבר הכבד הושג בשלב 3.6, resuspend הגלולה עם בידוד בינוני עוד 10 מ"ל וסרכזת שוב, כצעד 3.6. הגלולה שתתקבל תהיה חלק המיטוכונדרי הטהור.
- העברת supernatant מfrac האורtion הושג בשלב 3.6 ל Tube צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear, על קרח. השלך את הגלולה.
- הוסף בינוני בידוד מספיק כדי supernatant הושג בשלב 3.8 למלא את הצינורית וצנטריפוגה XG ב 100.000 ל1 שעות, 4 ° C. הגלולה שתתקבל תהיה שבריר MAMs. מוציא בזהירות ולהשליך supernatant.
הערה: בשלב זה, ייתכן שגם חובצה ב -100,000 XG ל1 שעות, 4 ° C supernatant הציל בשלב 2.6. הגלולה תהיה שבריר ER וsupernatant שבריר cytosolic.
4. הפקת Glycosphingolipid מועשר-Microdomains, אובניים החן
- Lyse שברי מיטוכונדריה ו / או MAM טהורים ב500 מ"ל μl-1 של הצפת חילוץ עבור 20 דקות על קרח.
- צנטריפוגה lysates ב15300 XG עבור 2 דקות ב 4 ° C.
- איסוף supernatants (X-100 חומרי טריטון מסיסים) וגלולות מחדש צנטריפוגותעבור 2 דקות שנותר כדי להסיר חומרים מסיסים. (טריטון X-100 חולץ המיטוכונדריה ו / או טריטון X-100 MAMs חולץ).
- Solubilize כדורים בSolubilising מאגר. חומרי solubilized זה מייצג את שברי GEM ויכולים לשמש לניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהתבסס על הניסיון שלנו בשימוש בפרוטוקול זה אנו יכולים בבטחה ממליצים עליו לבידוד והטיהור של MAMs, אובניים חן ופיצולי המיטוכונדריה ממוח עכבר. ההליך כפי שמתואר הוא שחזור ומתואם היטב. באיור 1 אנו מראים תמונה מייצגת של דרך שכבת המיטוכונדריה וMAMs הטהורה בשיפוע Percoll (שלב 3.4). להקה מוגדרת, חלבית המכילה מטוהרת מבדלת מיטוכונדריה (מיטו-P) בתחתית של תחתית ultracentrifuge, תוך שבריר MAM מפצה להקה מפוזרת ורחבה מעל למיטוכונדריה. לאחר התאוששות זהירה של להקות השיפוע הבודדות, את השברים המטוהרים הם resuspended בחיץ תמוגה, מופרדים על ג'לי polyacrylamide SDS וימחו על קרומי PVDF. כתמים מכן חקרו עם סוללה של נוגדנים לסמני חלבון ספציפיים שיוודאו הטוהר של השברים והרכב החלבון שלהם. איור 2A מציג את התפלגות cytosolic, ER ומיטוכונדריה סמנים בMAMs המבודד ופיצולי המיטוכונדריה. הכנות מיטוכונדריה טהורות צריכות להיות נטולות שני סמני ER וcytosolic. הפרד ההדוק בין חדר המיון וקרומי המיטוכונדריה באתרי קשר MAM מסביר את נוכחותו של calreticulin (ER סמן) וטום-20 (סמן מיטוכונדריה) בהכנות מטוהרות אלו. כמו כן ניתן להשתמש MAMs סמנים ספציפיים FACL4 וPACS2, כמו גם סמנים אחרים מועשרים בתחומים אלה, כגון IP3R-1 וGRP75 4. את MAMs ניתן לחלץ נוסף עם טריטון X-100 כדי להשיג את אובניים החן. microdomains הללו מכילים מרכיבים של רפסודות שומנים בדם ו / או caveolae הוא caveolin-1 חיובי כפי שמוצג באיור 2 ב.
איור 1. מציג תמונה של השכבות של ER קרום המיטוכונדריה-המשויך (MAMs) והטהורשברי המיטוכונדריה (מיטו-P).
איור 2. ) מראה כתמים מערביים לרוץ לבדוק את הטוהר וההפצה של cytosolic, ER וסמנים המיטוכונדרי בcytosolic (cyto) -, ER-, שברים טהורים המיטוכונדריה (מיטו-p) -. ואמא-B שברים) כתמים מערביים מטוהר microdomains glycosphingolipid המועשר (אובניים חן) וטריטון X-100 (טריטון extr. MAMs) שברים חולצו בודד מMAMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האתרים של מגע בין קרומים תאיים או בין האברונים וקרום הפלזמה של תאים מייצגים פלטפורמות איתות דינמיות לתהליכים תאיים בסיסיים. האפיון המדויק של התפקוד ובהרכב שלהם תחת שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים דורש פרוטוקולי טיהור אמינות ושחזור. השיטות, כמפורט כאן כבר מותאמות במיוחד על ידי המעבדה שלנו לבידוד והטיהור של MAMs והפנינים המקבילות שלהם ממוח העכבר הבוגר. פרוטוקול זה יושם בהצלחה לזיהוי המולקולרי והשפיע המציין microdomains אלה, ומונחים ביסוד מורד המסלול אפופטוטיים של Ca 2 + חוסר איזון שמוביל למוות של תאים עצביים במחלה מטבולית ניווניות בילדים 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אף אחד מהמחברים יש ניגודי עניינים שיכריזו.
Acknowledgments
אנו מכירים בתרומה של הרנטה סנו בהריון הפרוטוקול הראשוני. Ad'A. מחזיק את התכשיטים לילדים (JFC) ניחן קתדרה לגנטיקה וריפוי גנטי. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענקי NIH GM60905, DK52025 וCA021764, ואת הצדקה האמריקנית הלבנונית הסורית, המזוהית (ALSAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
- Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
- Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
- Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
- Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
- d'Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
- Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
- Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
- Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
- Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).
