Summary
Questa procedura illustra come isolare dal cervello di topo adulto i mitocondri associate membrane ER o MAMS e glicosfingolipidi-arricchiti frazioni microdomini di MAMs e preparati mitocondriali.
Abstract
Organelli intracellulari sono strutture altamente dinamiche con diversa forma e composizione, che sono sottoposti a stimoli intrinseci ed estrinseci delle cellule-specifiche. Le loro membrane sono spesso giustapposti a siti di contatto definiti, che diventano centri per lo scambio di molecole di segnalazione e dei componenti della membrana 1,2,3,4. Le inter-organelli microdomini di membrana che si formano tra il reticolo endoplasmatico (ER) ei mitocondri all'apertura del IP3-sensibili Ca 2 + sono noti canali come i mitocondri associato-ER membrane o MAMS 4,5,6. La proteina / lipide composizione e le proprietà biochimiche di questi siti di contatto di membrana sono stati ampiamente studiati in particolare in relazione al loro ruolo nella regolazione intracellulare Ca 2 + 4,5,6. La ER serve come fonte principale di Ca 2 + intracellulare, e in questa capacità regola una miriade di processi cellulari a valle di Ca 2 + segnalazione, including post-traduzionale folding delle proteine e proteine maturation7. Mitocondri, invece, mantenere l'omeostasi Ca 2 +, tamponando citosolico Ca 2 + concentrazione impedendo così l'apertura di percorsi apoptotici a valle di Ca 2 + squilibrio 4,8. La natura dinamica delle MAMs li rende luoghi ideali di base per analizzare i meccanismi cellulari, tra cui Ca 2 + di segnalazione e regolazione di mitocondriale Ca 2 + sopravvivenza concentrazione, la biosintesi dei lipidi e dei trasporti, il metabolismo energetico cellulare e 4,9,10,11,12. Diversi protocolli sono stati descritti per la purificazione di questi microdomini di tessuto epatico e cellule coltivate 13,14.
Assunzione di metodi precedentemente pubblicati in considerazione, abbiamo adattato un protocollo per l'isolamento dei mitocondri e MAMs dal cervello di topo adulto. Per questa procedura, abbiamo aggiunto un ulteriore passaggio di purificazione, cioè un estrazione Triton X100, che enables l'isolamento del glicosfingolipide arricchito microdomini (GEM), frazione dei MAMs. Queste preparazioni GEM condividere componenti proteiche diverse con zattere caveolae e lipidi, derivati dalla membrana plasmatica o altre membrane intracellulari, e si propone di funzionare come la raccolta punti per il raggruppamento delle proteine recettori e per interazioni proteina-proteina 4,15.
Protocol
Il seguente protocollo è stato progettato per l'isolamento e la purificazione di MAMs e gemme da cervello di topo
Soluzioni richiesto per l'isolamento di mitocondri, MAMs e gemme
Frazionamento per ottenere greggio preparazione mitocondriale:
Soluzione A: 0,32 M saccarosio, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl 2 + inibitori delle proteasi (aggiungere fresco, se necessario)
Soluzione B: 0.32 M saccarosio, 1 mM NaHCO3 + inibitori della proteasi (aggiungere fresco, se necessario)
MAMs Isolamento:
Isolation Medio: 250 mM Mannitolo, 5 mM HEPES pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA
Gradiente Buffer: 225 mM mannitolo, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (concentrazione finale)
GEM di isolamento:
contenuto "> GEM tampone di estrazione: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 + inibitori delle proteasi (aggiungere fresco, se necessario)GEM Buffer solubilizzante: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + Inibitori della proteasi (aggiungere fresco, se necessario).
1. Passo Frazionamento subcellulare Primo: Celle rimozione dei Nuclei, non lisate e detriti cellulari
- Eutanasia mouse nella camera di CO 2.
- Rimuovere immediatamente il cervello, dimezzare, mettere in 2 ml provette in ghiaccio e pesare.
Nota: Tenere le metà del cervello separato durante tutta la procedura. Quanto segue si applica al trattamento di un mezzo unico cervello.
- Luogo cervello metà in pre-refrigerati 2 smerigliatrice di vetro tessuto Dounce ml contenente 1 ml di soluzione fredda A. Omogeneizzare con 15 colpi totali di un pestello spazio di grandi dimensioni.
- Trasferire in una provetta da 15 ml falcon, su ghiaccio, e diluireomogenati fino a 10 volumi w / v, ad esempio 0,225 g di 2,25 ml.
- Centrifugare campione a 1400 xg per 10 min a 4 ° C.
- Rimuovere con attenzione il supernatante e trasferirlo in una 30 ml a fondo rotondo tubo di vetro, sul ghiaccio. Fare attenzione a non disturbare il pellet.
- Risospendere il precipitato in stessi 10 volumi di soluzione A. Omogeneizzare nel macinacaffè stesso, con 3-6 colpi di un pestello piccolo gioco, 1 ml per volta.
- Trasferire in una nuova provetta 15 ml falcon e centrifugare a 710 xg per 10 min a 4 ° C. Ciò si traduce in un pellet di nuclei e detriti cellulari.
- Rimuovere con attenzione il surnatante e piscina con il surnatante salvato nel passaggio 1.6.
2. Secondo passo: Crude Isolamento mitocondri
- Centrifugare supernatanti a 13800 xg per 10 min a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman, su ghiaccio
- Risospendere il pellet in 10 volumi di soluzione A. Omogeneizzare nel macinacaffè stesso, con 3-6 colpi di un pestello piccolo gioco, 1 ml per volta.
- Centrifugare come punto 2.1.
- Ripetere i passaggi 2,2-2,4.
- Il pellet risultante è una frazione arricchita mitocondriale. I supernatanti (citosol e ER), coprire con parafilm e tenere in ghiaccio.
- Risospendere il pellet con 6 colpi di un pestello piccolo gioco, in 4,8 ml / g (g è riferito al peso del cervello originale) di soluzione B, in un omogeneizzatore fresco.
- Usando pipette Pasteur in vetro, preparare un gradiente discontinuo di saccarosio in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman, aggiungendo successivamente al fondo della provetta come segue, con attenzione, assicurando bolle si formano:
Resupended pellet (0,32 M saccarosio)
3 ml 850 mM saccarosio (in 1 mM NaHCO3)
3 ml 1 M Saccarosio (in 1 mM NaHCO 3)
3 ml di 1,2 M saccarosio (in 1 mM NaHCO3) - Centrifugare a 82500 xg per 2 ore a 4 ° C. La separazione risultante alla fine del gradiente produrrà tre bande e un pellet: 1) mielina e altri contaminanti membrana (0,32 M - 0,85 M di interfaccia), 2) ER, Golgi, membrane plasmatiche (0,85 M - 1 M di interfaccia); 3) sinaptosomi (1 M - 1,2 M di interfaccia), 4) grezzo mitocondri (pellet) che viene utilizzato per le successive fasi di purificazione
3. Isolamento dei mitocondri associata a membrana ER, MAMs
- Risospendere il greggio appena mitocondri isolati da una metà del cervello, in 2 ml di terreno di isolamento contenenti inibitori della proteasi appena aggiunti.
- Preparazione di un gradiente Percoll 30% con il tampone di gradiente da 8 ml per metà del cervello, e il luogo in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman.
* Nota: Assicurarsi tampone gradiente più concentrato (1,43 volte) per ottenere corretta concentrazione finale dopo diluting Percoll al 30%.
- Sospensione livello mitocondriale in cima gradiente preparato lentamente per evitare eventuali bolle.
- Centrifugare a 95.000 xg per 30 min a 4 ° C.
- Rimuovere la frazione pesante (fascia inferiore) prima con una pipetta Pasteur di vetro e versare in un nuovo fondo rotondo tubo di vetro, su ghiaccio.
- Rimuovere la frazione leggera (banda superiore) con un altro SECONDO Pasteur pipetta di vetro e versare in un separato fresco a fondo rotondo tubo di vetro, su ghiaccio.
- Diluire entrambe frazioni raccolte nel passaggio 3,5 con 10 ml di mezzo di isolamento e centrifugare a 6300 xg per 10 min a 4 ° C.
- Scartare il sopranatante della frazione pesante ottenuta nella fase 3.6, risospendere il pellet con un altro supporto 10 ml Isolamento e centrifugare nuovamente, come passo 3,6. Il pellet risultante sarà la frazione pura mitocondriale.
- Trasferire il surnatante dal Frac Lucezione ottenuta nello stadio da 3,6 a un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman, sul ghiaccio. Eliminare il pellet.
- Aggiungere mezzo di isolamento al supernatante ottenuto nel passaggio 3,8 per riempire il tubo e centrifugare a 100.000 xg per 1 ora, 4 ° C. Il pellet risultante sarà la frazione MAMs. Rimuovere con attenzione ed eliminare il surnatante.
Nota: A questo punto, si può anche centrifugare a 100.000 xg per 1 ora, 4 ° C, il surnatante salvato nella fase 2.6. Il pellet sarà la frazione ER e supernatante la frazione citosolica.
4. Estrazione di glicosfingolipidi-microdomini arricchiti, GEM
- Lyse puri frazioni mitocondri e / o MAM in 500 pl-1 ml di tampone di estrazione per 20 min in ghiaccio.
- Centrifugare a 15300 lisati xg per 2 minuti a 4 ° C.
- Raccogliere surnatanti (Triton X-100 materiale solubile) e ri-centrifuga pelletsper 2 minuti per rimuovere restante materiale solubile. (Triton X-100 mitocondri estratti e / o Triton X-100 MAMs estratti).
- Solubilizzare pellet in solubilizzanti tampone. Questo materiale solubilizzato rappresenta le frazioni GEM e può essere utilizzato per ulteriori analisi.
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Representative Results
Sulla base della nostra esperienza con l'utilizzo di questo protocollo possiamo tranquillamente lo consiglio per l'isolamento e la purificazione di MAMs, gemme e frazioni mitocondriali di cervello di topo. La procedura indicata è altamente riproducibile e coerente. In figura 1 si mostra una immagine rappresentativa dello strato modo puro mitocondri e MAMs su un gradiente Percoll (passo 3.4). A definito, banda lattiginoso contenente purificata mitocondri (Mito-P) segrega al fondo del tubo ultracentrifuga, mentre la frazione MAM costituisce una banda diffusa e larga sopra i mitocondri. Dopo attento recupero delle bande gradiente singoli, le frazioni purificate vengono risospese in un tampone di lisi, separati su gel di poliacrilammide SDS e trasferite su membrane di PVDF. Blot vengono sondati con una batteria di anticorpi specifici per proteine marker che accertare la purezza delle frazioni e la loro composizione proteica. Figura 2A mostra la distribuzione di Cytosmarcatori Olic, ER e mitocondriale nei MAMs isolate e frazioni mitocondriali. Pure i preparativi mitocondri dovrebbe essere privo di entrambi i marker di ER e citosoliche. La stretta apposizione tra ER e delle membrane mitocondriali nei siti di contatto di MAM spiega la presenza di calreticulina (ER marker) e Tom-20 (indicatore di mitocondri) in queste preparazioni purificate. È anche possibile utilizzare MAMs marcatori specifici FACL4 e PACS2, nonché altri marcatori arricchite all'interno di questi domini, come IP3R-1 e GRP75 4. Le MAMs possono essere ulteriormente estratto con Triton X-100 per ottenere le gemme. Questi microdomini, che contengono componenti di zattere lipidiche e / o caveolae sono caveolina-1 positive come mostrato nella figura 2B.
Figura 1. Mostra una foto della stratificazione del mitocondriale associata alla membrana ER (MAMs) e il purofrazioni mitocondriali (mito-p).
Figura 2. A) Spettacoli Western blot eseguito per verificare la purezza e la distribuzione di citosolica, ER e marcatori mitocondriali in citosolico (cito) -, ER-, pure frazioni mitocondriali (mito-p) -. E MAM-frazioni B) Western blot della purificato glicosfingolipidi microdomini arricchiti (GEM) e Triton X-100 (estratti Triton extr. MAMs) frazioni isolate da MAMs.
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Discussion
I siti di contatto tra membrane intracellulari o tra organelli e la membrana plasmatica di cellule rappresentano dinamiche piattaforme di segnalazione per processi cellulari di base. La caratterizzazione accurata della loro funzione e la composizione sia in condizioni fisiologiche e patologiche richiede protocolli di purificazione affidabili e riproducibili. I metodi qui descritti sono stati specificamente ottimizzate dal nostro laboratorio per l'isolamento e la purificazione dei MAMs e loro gemme corrispondenti del cervello di topo adulto. Questo protocollo è stato applicato con successo per l'identificazione degli effettori molecolari che specificano questi microdomini, e alla base valle via apoptotica di Ca 2 + squilibrio che porta alla morte delle cellule neuronali in una malattia neurodegenerativa metabolica nei bambini 4.
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Disclosures
Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Riconosciamo il contributo di Renata Sano nel concepire il protocollo iniziale. Ad'A. detiene le Jewelers per i bambini (JFC) Dotato Cattedra di Genetica e terapia genica. Questo lavoro è stato finanziato in parte da sovvenzioni NIH GM60905, DK52025 e CA021764, e gli americani libanesi Charities siriane associati (ALSAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
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