Summary
Denne prosedyren illustrerer hvordan å isolere fra den voksne mus hjernen mitokondriene-tilknyttede ER membraner eller Mams og glykosphingolipid-beriket microdomain fraksjoner fra mams og mitokondrie preparater.
Abstract
Intracellulære organeller er høydynamiske strukturer med varierende form og sammensetning, som blir utsatt for celle-spesifikke indre og ytre signaler. Sine membraner er ofte sidestilt ved definerte kontakt områder, som blir nav for utveksling av signalmolekyler og membran komponenter 1,2,3,4. Mellomkrigstiden organellar membran microdomains som dannes mellom det endoplasmatiske retikulum (ER) og mitokondriene ved åpningen av IP3-sensitive Ca 2 +-kanaler er kjent som mitokondrier tilhørende-ER membraner eller Mams 4,5,6. Proteinet / lipid sammensetning og biokjemiske egenskaper av disse membran kontakt nettstedene har blitt grundig studert spesielt i forhold til sin rolle i å regulere intracellulære Ca 2 + 4,5,6. ER fungerer som den primære butikken av intracellulær Ca 2 +, og i denne egenskap regulerer en myriade av cellulære prosesser nedstrøms Ca 2 + signalering, inkl.uding posttranslasjonelle proteinfolding og protein maturation7. Mitokondrier, derimot, vedlikeholde Ca 2 + homeostase, ved bufring cytosoliske Ca 2 + konsentrasjon dermed hindre initiering av apoptotiske reaksjonsveier nedstrøms av Ca 2 + ubalanse 4,8. Den dynamiske natur Mams gjør dem ideelle steder å dissekere grunnleggende cellulære mekanismene, inkludert Ca 2 + signalering og regulering av mitokondriell Ca 2 + konsentrasjon, lipid biosyntese og transport, energi metabolisme og celle overlevelse 4,9,10,11,12. Flere protokoller er blitt beskrevet for rensing av disse microdomains fra levervev og dyrkede celler 13,14.
Tar tidligere publiserte metoder i betraktning, har vi tilpasset en protokoll for isolering av mitokondrier og mams fra den voksne mus hjernen. Denne prosedyren har vi lagt til en ekstra rensetrinn, nemlig en Triton X100 utvinning, som enables isolasjon av glykosphingolipid beriket microdomain (GEM) brøkdel av Mams. Disse GEM preparater dele flere proteinkomponenter med caveolae og lipid flåter, avledet fra plasmamembranen eller andre intracellulære membraner, og er foreslått å fungere som samle poeng for gruppering av reseptor proteiner og for protein-protein interaksjoner 4,15.
Protocol
Følgende protokoll er beregnet for isolering og rensing av mams og perler fra mus hjernen
Løsninger som kreves for Isolering av mitokondrier, mams og perler
Fraksjonering å få rå mitokondrie forberedelse:
Løsning A: 0,32 M sukrose, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl 2 + proteasehemmere (legge friske, som nødvendig)
Løsning B: 0,32 M Sukrose, 1 mm NaHCO 3 + proteasehemmere (legg frisk, etter behov)
Mams Isolasjon:
Isolation Medium: 250 mM mannitol, 5 mM HEPES pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA
Gradient Buffer: 225 mM mannitol, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (sluttkonsentrasjon)
GEMS Isolasjon:
innhold "> GEM Utvinning Buffer: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 + proteaseinhibitorer (legg frisk, som nødvendig)GEM Solubilising Buffer: 50 mM Tris-HCl, 8,8 pH, 5 mM EDTA, 1% SDS + proteasehemmere (legg friske, som nødvendig).
1. First Step subcellulære Fraksjonering: Fjerning av Nuclei, lyserte celler og mobilnettet rusk
- Avlive mus i CO 2 kammer.
- Umiddelbart fjerne hjernen, halvere, plassere i 2 ml rør på is og veier.
Merk: Hold hjernen halvdeler separat gjennom hele prosedyren. Følgende gjelder behandlingen av en enkelt hjerne halvparten.
- Sted halvparten hjernen i en pre-kjølt 2 ml glass Dounce vev jeksel inneholder 1 ml kaldt Solution A. homogenisere med 15 totalt slag av en stor klaring støter.
- Overføre til en 15 ml falk rør, på is, og fortynnhomogenater opptil 10 volumer v / v, f.eks 0.225 g til 2,25 ml.
- Sentrifuger prøven ved 1400 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Forsiktig fjerne supernatanten og overføring til en 30 ml rundbunnet glass sentrifugerør, på is. Pass på å ikke forstyrre pelleten.
- Resuspender pelleten i de samme 10 volumer av Løsning A. Homogenize i samme jeksel, med 3-6 slag av en liten klaring støter 1 ml om gangen.
- Overføring til en frisk 15 ml falcon tube og sentrifuger ved 710 xg i 10 min ved 4 ° C. Dette resulterer i en pellet av kjerner og cellerester.
- Fjern forsiktig supernatanten og basseng med supernatanten lagret i trinn 1.6.
2. Second Step: Crude Mitokondrier Isolation
- Sentrifuger supernatanter ved 13.800 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten til et Ultra-Clear Beckman sentrifugerør, på is
- Gjensuspender pellet i 10 volumer Løsning A. Homogenize i samme jeksel, med 3-6 slag av en liten klaring støter 1 ml om gangen.
- Sentrifuger som steg 2,1.
- Gjenta trinn 02.02 til 02.04.
- Den resulterende pelleten er en anriket mitokondrie fraksjonen. Pool supernatantene (cytosol og ER), dekk med parafilm og holde på is.
- Resuspender pelleten med 6 slag av en liten klaring støter i 4,8 ml / g (g er referert til den opprinnelige hjernen vekt) Oppløsning B, i en fersk homogenisator.
- Bruke glass Pasteur pipetter, forberede en diskontinuerlig sukrosegradient i en Ultra-Clear Beckman sentrifugerør, legger deretter til bunnen av røret som følger, nøye, sikrer ingen bobler dannet:
Resupended Pellet (0,32 M sukrose)
3 ml 850 mM sukrose (i 1 mM NaHCO 3)
3 ml 1 M Sukrose (i 1 mM NaHCO 3)
3 ml 1,2 M Sukrose (i 1 mM NaHCO3) - Sentrifuger ved 82.500 xg i 2 timer ved 4 ° C. Den resulterende separasjon ved slutten av gradienten vil produsere tre band og en pellet: 1) myelin og andre membran forurensninger (0,32 M - 0,85 M-grensesnitt), 2) ER, Golgi, plasmamembraner (0,85 M - 1 M-grensesnitt); 3) synaptosomer (1 M - 1,2 M-grensesnitt), 4) urene mitokondrier (pellets) som er brukt for de etterfølgende rensetrinn
3. Isolering av Mitokondrier-assosiert ER membran, mams
- Resuspender ferskt isolert urene mitokondrier fra en hjerne halvparten, i 2 ml medium inneholdende Isolation nystekte lagt proteasehemmere.
- Forbered en 30% Percoll gradient med Gradient Buffer 8 ml per halv hjerne, og plasser i en Ultra-Clear Beckman sentrifugerør.
* Merk: Kontroller gradient buffer mer konsentrert (1,43 ganger) for å oppnå riktig sluttkonsentrasjon etter diluting Percoll til 30%.
- Lag mitokondrie suspensjon på toppen av forberedt gradient sakte for å unngå eventuelle bobler.
- Sentrifuger ved 95.000 xg i 30 min, 4 ° C.
- Fjern den tunge fraksjonen (nedre band) FIRST med et glass Pasteur pipette og overfør til en frisk rundbunnet glassrør på is.
- Fjern den lette fraksjonen (øvre band) SECOND med en annen glass Pasteur pipette og overfør til en separat frisk rundbunnet glassrør på is.
- Fortynn begge fraksjoner samlet i trinn 3.5 med 10 ml Isolation Medium og sentrifuger ved 6300 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Kast supernatanten fra den tunge fraksjonen oppnådd i trinn 3.6, resuspender pelleten med en annen 10 ml Isolation Medium sentrifuger igjen, som trinn 3.6. Den resulterende pellet blir det rene mitokondrie fraksjonen.
- Overfør supernatanten fra Lyset Fracsjon oppnådd i trinn 3.6 til en Ultra-Clear Beckman sentrifugerør, på is. Kast pellet.
- Legge tilstrekkelig Isolation Middels til supernatanten oppnådd i trinn 3.8 til fylle røret og sentrifuger ved 100.000 xg i 1 time, 4 ° C. Den resulterende pellet blir mams fraksjonen. Fjern forsiktig og kast supernatanten.
Merk: På dette trinnet kan du også sentrifuger på 100.000 xg for 1 time, 4 ° C supernatanten lagret i trinn 2.6. Pelleten blir ER fraksjonen og supernatant den cytosoliske fraksjon.
4. Utvinning av glykosphingolipid-beriket Microdomains, edelstener
- Lyse rene mitokondrier og / eller MAM fraksjoner i 500 ul-1 ml Extraction Buffer i 20 min på isen.
- Sentrifuger lysater ved 15.300 xg i 2 min ved 4 ° C.
- Samle supernatanter (Triton X-100 løselig materiale) og re-sentrifuger pelletsi 2 min for å fjerne gjenværende oppløselige materiale. (Triton X-100 ekstrahert mitokondrier og / eller Triton X-100 utpakkede mams).
- Oppløse pellets i Solubilising Buffer. Dette solubilisert materiale representerer GEM fraksjoner og kan brukes for videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Basert på vår erfaring med å bruke denne protokollen kan vi trygt anbefale det for isolering og rensing av Mams, edelstener og mitokondrie fraksjoner fra mus hjernen. Prosedyren som beskrevet er svært reproduserbare og konsekvent. I figur 1 viser vi en representativt bilde av måten rene mitokondrier og mams lag på en Percoll gradient (trinn 3.4). En definert, melkeaktig bandet inneholdende renset mitokondrier (Mito-P) segregerer ved bunnen av ultrasentrifuge røret, mens MAM fraksjonen utgjør en diffus og bredt bånd over mitochondria. Etter nøye utvinning av de enkelte gradient band, blir de rensede fraksjoner resuspendert i en lyseringsbuffer, separert på SDS polyakrylamidgeler og blottet på PVDF membraner. Blots blir deretter analysert med et batteri av antistoffer for spesifikke protein markører som vil fastslå renheten av fraksjonene og deres protein sammensetning. Figur 2A viser fordelingen av cytosOlic, ER og mitokondriell markører i de isolerte mams og mitokondrie fraksjoner. Rene mitokondrier preparater bør være blottet for både ER og cytosoliske markører. Den nære apposition mellom ER og mitokondrienes membraner på MAM kontakt områder forklarer tilstedeværelsen av calreticulin (ER markør) og Tom-20 (mitokondriene markør) i disse rensede forberedelsene. Det er også mulig å bruke mams spesifikke markører FACL4 og PACS2, samt andre markører beriket innenfor disse domener, for eksempel IP3R-1 og GRP75 4. De Mams kan bli ytterligere ekstrahert med Triton X-100 for å få gems. Disse microdomains, som inneholder komponenter av lipid flåter og / eller caveolae er caveolin-1 positiv som vist i figur 2B.
Figur 1. Viser et bilde av lagdelingen av mitokondrie-assosiert ER membran (mams) og den renemitokondrie fraksjoner (Mito-p).
Figur 2. A) viser vestlige blotter kjøre for å sjekke renhet og fordelingen av cytosoliske, ER og mitokondrie markører i cytosoliske (cyto) -, ER-, rene mitokondrie fraksjoner (Mito-p) -. Og MAM-fraksjoner B) Western blot av renset glykosphingolipid beriket microdomains (skatter) og Triton X-100 ekstrahert (Triton extr. Mams) fraksjoner isolert fra mams.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nettstedene til kontakt mellom intracellulære membraner eller mellom organeller og plasma membran av celler representerer dynamiske signaliserer plattformer for grunnleggende cellulære prosesser. Den nøyaktige karakterisering av deres funksjon og sammensetning under både fysiologiske og patologiske tilstander krever pålitelige og reproduserbare rensing protokoller. Metodene beskrevet her har blitt spesielt optimalisert ved vårt laboratorium for isolering og rensing av Mams og tilhørende perler fra den voksne mus hjernen. Denne protokollen har blitt implementert for identifikasjon av de molekylære effektorer som angir disse microdomains, og ligger til grunn for de apoptotiske sti nedstrøms Ca 2 + ubalanse fører til neuronal celle død i en nevrodegenerativ metabolsk sykdom hos barn 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har noen interessekonflikter å fortolle.
Acknowledgments
Vi erkjenner bidrag av Renata Sano i conceiving den første protokollen. Ad'A. holder Jewelers For barn (JFC) utrustet stolen i genetikk og Gene Therapy. Dette arbeidet ble finansiert delvis av NIH tilskudd GM60905, DK52025 og CA021764, og de amerikanske libanesiske syriske Associated velferdsorganisasjoner (ALSAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
- Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
- Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
- Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
- Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
- d'Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
- Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
- Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
- Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
- Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).
