Summary
Denna procedur visar hur du isolera från den vuxna musen hjärnan mitokondrierna-associerade ER membran eller MAMS och glykosfingolipid-berikade microdomain fraktioner från MAMS och mitokondriella preparat.
Abstract
Intracellulära organeller är mycket dynamiska strukturer med varierande form och sammansättning, som utsätts för cellspecifika inre och yttre signaler. Deras membran är ofta intill varandra vid definierade kontakt ställen som blir nav för utbyte av signalmolekyler och komponenter membran 1,2,3,4. De inter-organellar membran mikroområden som bildas mellan det endoplasmatiska nätverket (ER) och mitokondrier vid öppnandet av IP3-känsliga Ca 2 +-kanal är kända som mitokondrier tillhörande-ER membran eller MAMS 4,5,6. Proteinet / lipidkompositionen och biokemiska egenskaperna hos dessa platser membran kontakt har studerats utförligt särskilt i förhållande till deras roll vid reglering intracellulär Ca2 + 4,5,6. ER tjänar som den primära förråd av intracellulär Ca 2 +, och i denna egenskap reglerar en myriad av cellulära processer nedströms av Ca 2 +-signalering, inkluding post-translationell proteinveckning och protein maturation7. Mitokondrier, å andra sidan, upprätthålla Ca 2 + homeostas, genom att buffra cytosolisk Ca 2 + koncentrationen därigenom förhindra initieringen av apoptotiska vägar nedströms av Ca 2 + obalans 4,8. Den dynamiska natur MAMS gör dem idealiska platser att dissekera grundläggande cellulära mekanismer, däribland Ca 2 + signalering och reglering av mitokondriell Ca 2 + koncentrationen, lipid biosyntes och transport, energi metabolism och cellöverlevnad 4,9,10,11,12. Flera protokoll har beskrivits för reningen av dessa mikrodomäner från levervävnad och odlade celler 13,14.
Med tidigare publicerade metoder i beaktande, har vi anpassat ett protokoll för isolering av mitokondrier och MAMS från vuxen mus hjärnan. Detta förfarande har vi lagt till en extra reningssteg, nämligen en Triton X100 extraktion, vilket enables isolering av glykosfingolipid berikade microdomain (GEM) bråkdel av MAMS. Dessa beredningar GEM delar flera proteinkomponenter med caveolae och lipidaggregat, härledda från plasmamembranet eller andra intracellulära membran, och föreslås att fungera som samla poäng för klustring av receptorproteiner och för protein-proteininteraktioner 4,15.
Protocol
Följande protokoll är avsett för isolering och rening av MAMS och ädelstenar från mushjärna
Lösningar som krävs för isolering av mitokondrier, MAMS och pärlor
Fraktionering för att erhålla rå mitokondriell förberedelser:
Lösning A: 0,32 M sackaros, 1 mM NaHCOa 3, 1 mM MgClj 2, 0,5 mM CaCla 2 + Proteashämmare (tillsätt färsk, efter behov)
Lösning B: 0,32 M sackaros, 1 mM NaHCOa 3 + Proteashämmare (lägg färska, som behövs)
MAMS Isolering:
Isoleringsmedium: 250 mM mannitol, 5 mM HEPES, pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA
Gradient buffert: 225 mM mannitol, 25 mM HEPES, pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (slutlig koncentration)
GEMS Isolering:
innehåll "> GEM extraktionsbuffert: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 + Proteashämmare (lägg färska, som behövs)GEM solubilisera buffert: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + Proteashämmare (lägg färska, som behövs).
1. Första steget subcellulär fraktionering: Borttagning av kärnor, olyserade celler och cellavfall
- Avliva musen i CO 2 kammare.
- Omedelbart ta bort hjärnan, halvera, placera i 2 ml rör på is och väg.
Obs: Håll hjärnhalvorna separat under hela proceduren. Följande gäller för behandling av en enda hjärna halv.
- Placera halv hjärna i en pre-kylt 2 ml glas Dounce vävnad kvarn innehållande 1 ml kall Lösning A. Homogenisera med 15 totalt slag av en stor spel mortelstöt.
- Överför till en 15 ml Falcon-rör, på is, och utspäddHomogenat upp till 10 volymer w / v, exempelvis 0,225 g till 2,25 ml.
- Centrifugera provet vid 1.400 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Ta försiktigt bort supernatanten och överföring till en 30-ml rundbottnad glas centrifugrör, på is. Se till att inte störa pelleten.
- Resuspendera pelleten i samma 10 volymer av lösning A. Homogenisera i samma kvarn, med 3-6 slag av en liten frigång mortelstöt, 1 ml åt gången.
- Överför till en färsk 15 ml Falcon-rör och centrifugera vid 710 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Detta resulterar i en pellet av kärnor och cellrester.
- Ta försiktigt bort supernatanten och poolen med supernatanten sparades i steg 1,6.
2. Andra steget: Rå Mitokondrier Isolering
- Centrifugera supernatanter vid 13.800 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till en Ultra Clear Beckman centrifugrör, på is
- Återsuspendera pelleten i 10 volymer Lösning A. Homogenisera i samma kvarn, med 3-6 slag av en liten frigång mortelstöt, 1 ml åt gången.
- Centrifugera som steg 2,1.
- Upprepa steg 2,2-2,4.
- Den resulterande pelleten är en anrikad mitokondriella fraktionen. Pool supernatanterna (cytosol och ER), täck med parafilm och hålla på is.
- Resuspendera pelleten med 6 slag av en liten frigång mortelstöt, i 4,8 ml / g (g är hänvisas till den ursprungliga hjärnans vikt) av lösning B, i en färsk homogenisator.
- Använda glas Pasteur-pipetter, förbereda en diskontinuerlig sackarosgradient i en Ultra-Clear Beckman centrifugrör, tillsätta därefter till botten av röret enligt följande, försiktigt, säkerställer inga bubblor bildas:
Resupended Pellet (0,32 M sackaros)
3 ml 850 mM sackaros (i 1 mM NaHCOs 3)
3 ml 1 M sackaros (i 1 mM NaHCOs 3)
3 ml 1,2 M sackaros (i 1 mM NaHCOs3) - Centrifugera vid 82.500 xg under 2 h vid 4 ° C. Den resulterande separation vid slutet av gradienten kommer att producera tre band och en pellet: 1) myelin och andra föroreningar membran (0,32 M - 0,85 M gränssnitt), 2) ER, Golgi, plasmamembran (0,85 M - 1 M-gränssnitt); 3) synaptosomer (1 M - 1,2 M gränssnitt), 4) rå mitokondrier (pellet) som används för de efterföljande reningssteg
3. Isolering av mitokondrier-associerade ER-membranet, MAMS
- Resuspendera nyligen isolerade råa mitokondrier från en hjärna halv, i 2 ml isoleringsmedium innehållande nyligen tillsatta proteasinhibitorer.
- Förbered en 30% Percoll gradient med Gradient buffert 8 ml per halv hjärna, och placera i en Ultra Clear Beckman centrifugrör.
* Obs! Lutning buffert mer koncentrerad (1,43 gånger) för att uppnå rätt slutkoncentration efter diluting Percoll till 30%.
- Lager mitokondriell upphängning på toppen av beredda lutning långsamt för att undvika bubblor.
- Centrifugera vid 95.000 x g under 30 minuter, 4 ° C.
- Ta den tunga fraktionen (undre bandet) Först med ett glas pasteurpipett och överför till en ny rundbottnad glasrör, på is.
- Ta den lätta fraktionen (övre band) andra med en annan glas pasteurpipett och överför till en separat ny rundbottnad glasrör, på is.
- Späd båda fraktionerna uppsamlade i steg 3,5 med 10 ml isoleringsmedium och centrifugera vid 6.300 xg i 10 min vid 4 ° C.
- Kasta supernatanten från den tunga fraktionen som erhållits i steg 3,6, resuspendera pelleten med ytterligare 10 ml isoleringsmedium och centrifugera igen, som steg 3,6. Den resulterande pelleten blir den rena mitokondriella fraktionen.
- Överför supernatanten från Light Fracning som erhållits i steg 3,6 till en Ultra-Clear Beckman centrifugrör, på is. Kasta pelleten.
- Tillsätt tillräcklig isoleringsmedium till supematanten erhållen i steg 3,8 för att fylla röret och centrifugera vid 100.000 xg under 1 h, 4 ° C. Den resulterande pelleten blir MAMS fraktionen. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten.
Obs: I detta steg kan du också centrifugera vid 100.000 xg under 1 timme, 4 ° C supernatanten sparas vid steg 2,6. Pelleten blir ER fraktionen och supernatanten den cytosoliska fraktionen.
4. Utvinning av glykosfingolipid-berikade mikroområden, ädelstenar
- Lyse rena mitokondrier och / eller MAM fraktioner i 500 ^-1 ml extraktionsbuffert i 20 min på is.
- Centrifugera lysaten vid 15.300 x g under 2 minuter vid 4 ° C.
- Samla supernatanterna (Triton X-100 lösliga material) och re-centrifugera pelletsunder 2 min för att avlägsna kvarvarande lösligt material. (Triton X-100 extraherades Mitokondrier och / eller Triton X-100 extraherade MAMS).
- Solubilisera pellets i solubilisering buffert. Detta solubiliserade material representerar GEM fraktionerna och kan användas för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baserat på vår erfarenhet med att använda detta protokoll vi tryggt kan rekommendera det för isolering och rening av MAMS, ädelstenar och mitokondriella fraktioner från mus hjärna. Det förfarande som anges är mycket reproducerbar och konsekvent. I figur 1 visar vi en representativ bild av hur ren mitokondrier och MAMS skikt på en Percoll-gradient (steg 3,4). En definierad, mjölkaktig band innehållande renat mitokondrier (Mito-P) segregerar vid botten av röret ultracentrifugen, medan MAM fraktionen utgör en diffus och brett band ovanför mitokondrierna. Efter noggrann återvinning av de enskilda banden gradienten, de renade fraktionerna återsuspenderades i en lysbuffert, separerades på SDS-polyakrylamidgeler och blottades på PVDF-membran. Blöts sonderades sedan med ett batteri av antikroppar för specifika proteinmarkörer som förvissa renheten hos fraktionerna och deras protein sammansättning. Figur 2A visar fördelningen av cytosOlic, ER och mitokondriella markörer i de isolerade MAMS och mitokondriella fraktioner. Rena mitokondrier beredningar bör sakna både ER och cytosoliska markörer. Den nära beröring mellan ER och mitokondriemembranen på MAM kontakt platserna förklarar förekomsten av calreticulin (ER markör) och Tom-20 (mitokondrier markör) i dessa renade preparat. Det är också möjligt att använda MAMS specifika markörer FACL4 och PACS2, liksom andra markörer berikade inom dessa områden, såsom IP3R-1 och GRP75 4. De MAMS kan vidare extraheras med Triton X-100 för att erhålla pärlor. Dessa mikroområden, vilka innehåller komponenter av lipidaggregat och / eller caveolae är caveolin-1 positiv såsom visas i figur 2B.
Figur 1. Visar en bild av skiktning av mitokondriella-associerade ER-membranet (MAMS) och den renamitokondriella fraktioner (Mito-P).
Figur 2. A) visar western blöts körs för att kontrollera renhet och distribution av cytosoliska, ER och mitokondriella markörer i cytosoliska (CYTO) -, ER-, rena mitokondriella fraktioner (Mito-p) -. Samt MAM-fraktioner B) Western blotting av renade glykosfingolipid berikade mikroområden (GEMS) och Triton X-100 extraherade (Triton Extr. MAMS) fraktioner isolerade från MAMS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De områden av kontakt mellan intracellulära membran eller mellan organeller och plasmamembranet av celler representerar dynamiska signalering plattformar för grundläggande cellulära processer. Den exakta karakteriseringen av deras funktion och sammansättning under både fysiologiska och patologiska tillstånd kräver tillförlitliga och reproducerbara reningsprotokoll. De metoder som beskrivs här har särskilt optimerats av vårt labb för isolering och rening av MAMS och deras motsvarande pärlor från vuxen mushjärna. Detta protokoll har genomförts framgångsrikt för identifiering av de molekylära effektorerna som anger dessa mikroområden och ligger till grund för den apoptotiska vägen nedströms Ca 2 + obalans som leder till neuronal celldöd i en neurodegenerativ metabolisk sjukdom hos barn 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har några intressekonflikter att förklara.
Acknowledgments
Vi erkänner bidrag Renata Sano i utformningen den första protokollet. Ad'A. håller Juvelerare Till barn (JFC) Utrustad professur i genetik och genterapi. Detta arbete har finansierats delvis av NIH bidrag GM60905, DK52025 och CA021764, och de amerikanska libanesiska syriska associerade välgörenhetsorganisationer (ALSAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9" | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
References
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
- Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
- Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
- Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
- Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
- d'Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
- Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
- Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
- Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
- Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).
