Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Мышиные Spinotrapezius модели для оценки воздействия артериол Лигирование на микрососудистой функции и ремоделирования

doi: 10.3791/50218 Published: March 3, 2013
* These authors contributed equally

Summary

Мы демонстрируем новые модели артериальной перевязки в мышиных spinotrapezius мышц, в том числе шаг за шагом процедуры и описание необходимых приборов. Мы описываем операции и соответствующие результаты измерений, связанные с ремоделирования сосудов сеть сосудов и функциональной использованием прижизненной и конфокальной микроскопии.

Abstract

Мышиный spinotrapezius представляет собой тонкую, поверхностных скелетных мышц поддержки, которая простирается от T3 до L4 и легко доступны через спинной разрез кожи. Его уникальная анатомия делает spinotrapezius полезны для изучения ишемических повреждений и последующий реконструкции микрососудистых. Здесь мы покажем, артериол модели лигирования в мышиной spinotrapezius мышцу, которая была разработана наша исследовательская группа и ранее опубликованные 1-3. Для некоторых уязвимых линий мышей, таких как Balb / с мышью, эта операция перевязки надежно создает ишемии скелетной мышцы и служит платформой для исследования методов лечения, которые стимулируют реваскуляризации. Методы оценки также показали, в том числе использование прижизненной и конфокальной микроскопии. Spinotrapezius хорошо подходит для таких исследований изображений благодаря своей доступности (поверхностные спинной анатомии) и относительная тонкость (60-200 мкм). Spinotrapezius мышц может быть установлен в фас, облегчаявизуализации цельномышечных микрососудистых сетей без гистологических срезов. Мы описываем использование прижизненной микроскопии приобрести метрики после процедуры функциональных сосудов, а именно, увеличение диаметра arterilar в результате сокращения мышц. Мы также продемонстрируем процедуры для сбора и фиксации тканей, необходимым предшественником иммунной исследования и использования конфокальной микроскопии.

Introduction

Животные модели хронической ишемии являются ценными инструментами для изучения патофизиологии ишемических заболеваний, таких как заболевания периферических артерий, ишемической болезнью сердца, и сосудов головного мозга. У грызунов, как и у людей, артериальная окклюзия приводит к структурным ремоделирования сосудистой сети, в том числе arteriogenesis и ангиогенеза. В здоровых и молодых пациентов, эта реконструкция может быть достаточно, чтобы спасти ткани от ишемического повреждения, но сопутствующие заболевания, такие как диабет может привести к серьезному компромиссу реконструкции и восстановления. Понимание механизмов, лежащих в основе сердечно-сосудистых событий ремоделирования имеет важное значение для разработки методов лечения, которые стимулируют эти эндогенные процессы реваскуляризации.

В настоящее время перевязки бедренной артерии или резекции задних конечностей является стандартным методом для изучения хронического ишемического ремоделирования сосудов у мелких животных 4,5. Анализ диаметра, связь и реакционная способностьмикрососудов, которые составляют сосудистые вниз по течению сети лигированную бедренной артерии трудно, однако, из-за толщины мышц. Мы разработали модель артериол перевязки в мышцах мышей spinotrapezius: односторонние перевязки артерии боковой подачи в этом стабилизирующее спинных мышц 1. Относительно тонкие spinotrapezius (60-200 мкм) поддается фас иммуноокрашивания для оценки всей топологии сети с одноклеточными разрешение, позволяющее подробного изучения сердечно-сосудистых событий ремоделирования по всей ткани. Spinotrapezius также поверхностные и доступной, и, следовательно, его сосуды легко наблюдаемых прижизненной микроскопии, для эффективных характеристик воздействия реконструкции и артериол перевязки на сосудистую реактивность.

В этом отчете мы подробно описать и продемонстрировать мыши spinotrapezius артериол перевязки модели. Как в естественных условиях и экс естественных меняthods оценки после операции описаны, в том числе измерение функциональное расширение кровеносных сосудов, которое было показано, что нарушения при ишемическом условия 6 и иммунофлуоресцентного изображений цельномышечных сети капилляров. Мы также включают в себя результаты двух отдельных пилотных исследований, чтобы продемонстрировать полезность модели. Во-первых, мы использовали артериальную модель перевязки, чтобы вызвать статистически значимое увеличение извилистости судна в C57BL / 6 (рис. 2В). Извилистость увеличивается во время arteriogenesis В залогов артериол. В других линий мышей, которые являются более уязвимыми к ишемии из-за отсутствия залога артериол (например, Balb / с), капиллярный артериализации наблюдается 10. Капиллярная артериализации обнаруживается повышенный диаметр и развитие α-гладкой реактивности актин. Во-вторых, функциональной электрической стимуляции мышц приводит к вазодилатации в терминале артериол spinotrapeziнами (рис. 3В).

Protocol

1. Spinotrapezius поток артерии Лигирование хирургии

  1. Anesthetize мышь внутрибрюшинного введения. В 0,5 мл шприц, сформулировать: 0,06 мл 100 мг / мл кетамина
    0,03 мл 20,0 мг / мл Ксилазин
    0,01 мл 0,4 мг / мл атропина
    0,30 мл 0,9% физиологического раствора.
    Доза: 0,01 мл * на грамм массы тела, IP-

* Доза переменной при деформации мыши и акции, настроить соответствующим образом, мышь восстановления в течение часа с индукцией.

  1. Нанесите мазь стандартных офтальмологических, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
  2. Удалить волосы назад с помощью обрезки ножницами, а затем краткое применение крема для удаления волос.
  3. Лечить операционного поля с хлоргексидина или повидон-йод. Альтернативный повидон-йод с этанолом в три раза, заканчивая повидон-йод.
  4. Перенесите мышью на предварительно подготовленную поверхность хирургической работе, с грелки и стерильная салфеткана место.
  5. Создание линейного разреза (3-5 мм) через спинной кожи около 5 мм каудально по отношению к костной известность лопатки использованием радужной оболочки ножницами и щипцами стандартного образца (например, FST, 11271-30) по палаток ткани и резки параллельно позвоночник. На сайте целевой разрез может быть идентифицирован по трансдермальных визуализации спинного жировой ткани, если позволяет пигментации кожи; сократить на хвостовом границы жировой ткани. Развернуть разрез по мере необходимости, и проходят через вторичные слои кожи с помощью пружинных ножниц.
    1. Анатомические записки - spinotrapezius мышц лежит сверху и простирается от T4 до L3 по обе стороны от позвоночника. Передняя граница проходит в боковом примерно лопатки. Мышцы сужается в каудальном направлении, так что самое задней границы лежит медиальнее к переднему краю, и может лежать на одном уровне с позвоночником. Два жировых отложений Также важно отметить, прокладка непосредственно спинной и брюшной к spinotrapeziusмышцы к черепной половины.
    2. Воспаление в связи с разреза было показано, что не влияет на сосудистый ответ ремоделирования, как фиктивный перевязка операция не показали изменения в ремоделирования сосудистой spinotrapezius. Две пространственные факторы влияют на этот результат. Первый разрез удаляется на 5 мм в краниальном направлении из области интересов, где сосудистая реакция в мышцах, как правило, рассматривается. Кроме того, в месте разреза на спине кожа отделяется от места перевязки судна брюшной жировой ткани, которая лежит на верхней части черепа трети мышцы spinotrapezius.
  6. Промывать разрез с решением нагретой Рингер, чтобы предотвратить высыхание мышц. Применение вазодилататоров, таких как папаверин будет оказывать помощь в визуализации целевой артерии для перевязки.
  7. Под микроскопом рассечение, используйте щипцы, чтобы притупить рассекают и отделяют (но не удалить) спинной белые жировой ткани от основной MUSCУлар ткани для того, чтобы визуализировать сосудистую, как он входит и выходит spinotrapezius на ее боковой край.
  8. Найдите целевой артерии, которая наряду с одним или двумя парными венами, проходит через жировой ткани, что является вентральный к spinotrapezius на своем пути, чтобы боковые края мышцы. Эта артерия питает значительную часть хвостового половине мышцы, которая может быть подтверждена путем отражения и замены мышцы наблюдать путь артерий в мышцы. Целевые места для перевязки является сегмент артерии выхода брюшной жировой ткани и въезда в мышцах, и вполне доступно в этом регионе. Артерия-вена пара, возможно, придется аккуратно отделить от брюшной жировой ткани в этой области. Обратите внимание, что spinotrapezius подается несколько артерия-вена пар, в том числе судов, которые поперечной либо спинных и брюшных жировых отложений. Будьте осторожны, чтобы не нарушать этих судов.
    1. Многочисленные показатели могут быть использованы для различения артериииз вены. Один из лучших методов, чтобы мягко препятствовать кровотока с микрозонда и двигаться вверх по течению от мышц; поток не возобновится в артерии, пока препятствие не будет отпущена. Цвет также может быть использован, как стенок вен содержать беловатые оболочку из соединительной ткани, что артерии не хватает. Кроме того, можно рассмотреть диаметром до применения сосудорасширяющих как жил, как правило, больше по размеру.
  9. Артерии, как правило, в непосредственной близости от своих парных вен; использовать тупой диссекции с микрозонда и № 5 щипцы, чтобы изолировать около 5 мм сегменте, переходя микрозонда за артерию, и с помощью иглы, чтобы сделать больший разрыв в природном щель между артерией и веной. Это щель, через которую шов будет резьбой.
  10. Использование 10-0 однопоточных шва и держатель иглы месте перевязки вокруг подачи артерии (~ 70 мкм в диаметре) в направлении проксимального конца расчлененный сегменте использованием узлов хирурга. PlaCE дополнительные перевязки к дальнему концу расчлененный артерии сегмента, с достаточным расстояние между лигатурами, чтобы обеспечить перерезки артерии.
    1. Малом масштабе, связанные с spinotrapezius артерии кормов приводит к повышению хирургической трудности, по сравнению с перевязкой больших судна, таких как бедренная артерия. Неопытные врачи в частности будет иметь высокие темпы отрыв, случайное кровотечение, и другие хирургические осложнения. Особую озабоченность вызывает трудность определения и сокращения бесцветный артерии после потока были препятствия перед резки. По этим причинам размещения 2 лигатуры рекомендуется для тех, кто привык к процедуре, как хирург имеет визуальное руководство в поиске, где секут артерии, а также подтверждение разрез с готовностью наблюдается разделение на 2 лигатуры. Тем не менее, более опытный хирург может найти ни одной лигатуры достаточное тех пор, пока они в состоянии четковыявить и сократить артерии ниже лигатуры. Хотя этот метод снижает риск непреднамеренного никующие поблизости судно с резким шовного лигирования, она не лишена недостатков, в том числе повышенной сложности в подтверждении артерия перерезана.
  11. Убедитесь, перевязки, наблюдая за уменьшением притока крови (препятствует РБК колонки) вниз по течению от перевязки сайта (т.е. к мышце).
  12. Использование рассечение ножницами секут перевязанной артерии, между двумя лигатурами. Если только одна лигатура была помещена (11а), вырезать с крайней осторожностью в направлении вниз.
  13. Наркотиков подшипников скольжения пленки (1 мм) может быть помещен ниже по течению (каудально) в рамках экспериментальной процедуры.
  14. Переместите перемещенных фасции и жировой ткани в исходной ориентации.
  15. Закрыть разрез кожи использованием 8-0, не рассасывающиеся швы. Затем поместите мышь в подготовленную клетку с подогревом восстановление под наблюдение и управление APpropriate анальгетик, такой как бупивакаин, 0.02-0.05 мл 0,25% местной инфильтрации.

2. Spinotrapezius Прижизненная микроскопия, на месте

  1. Anesthetize мыши в индукции камеры с 3-4% изофлурана испаряется в 100% кислорода при скорости потока 3-4 л · мин -1.
    1. Использование ингаляционного наркоза является предпочтительным для функционального измерения, поскольку там меньше сердечно-сосудистой депрессии, чем с инъекционной анестезии. Если ингаляционный наркоз в недоступны, длительного действия инъекционных анестетиков, таких как пентобарбитала натрия предпочтительно, чтобы избежать повторных инъекций один раз животное было расположены.
  2. После наркоза, постоянно доставлять изофлуран через анестезии маска (так называемый носовой обтекатель) на поддержание концентрации (обычно ~ 2%) и расход 0.5-1 л · мин -1.
    1. Мыши преимущественно проветривать через носовые ходы, так это только включенные в другие группировкиEssary, чтобы покрыть свои носу с диафрагмой маски анестезии.
  3. При необходимости удалить волосы со спины использованием обрезки ножницами и депиляции кремом.
  4. Транспортировка животных на тепло площадку.
    1. Это важно для поддержания мышей в euthermic состояние, чтобы предотвратить холодную вызванной сужением сосудов, что может быть достигнуто путем ламп, вода, циркулирующая тепла колодки, микроволновой печи нагревается колодки, и т.д.
  5. Вставьте ректального датчика температуры и установите термо-контроллера до 35 ° C.
  6. Сделайте разрез кожи на хвостовом конце spinotrapezius использованием радужной оболочки ножницами и щипцами стандартным шаблоном.
  7. Расширить разрез краниально к жировой ткани, создавая разрез подковы, и покрывать кожный лоскут полиэтиленовой пленкой для предотвращения высыхания.
  8. Blunt рассекать ткани подкожной соединительной щипцами и весной ножницами, чтобы максимизировать видимость.
  9. Поместите стимулирующие электроды как можно ближе Togeтермо насколько это возможно, чтобы свести к минимуму размер текущего поля, и помещать их в каудальном конце мышцы подвергаются только сбоку от позвоночника.
  10. Выполните тест стимуляции для подтверждения размещения электродов использованием приобретения электрода данных системы, изолятор электрода стимул, и компьютер контроллером, с квадратной волны длительностью 200 мкс, 2 мА амплитуды, выступил с частотой 1 Гц.
  11. Поместите пластиковую обертку над открытыми мышц, чтобы предотвратить высыхание.
  12. Начала отсчета времени на 30 мин период в течение которого судно диаметром сравняет.
  13. Установите прижизненной микроскопии над spinotrapezius мышцы, чтобы просмотреть сосудистой архитектуры.
    1. При использовании погружении линзы, поместите каплю PBS между объективным и полиэтиленовой пленкой.
  14. Начиная над главным артериол (самое крупное судно видно), манипулировать этап в плоскости XY, чтобы найти судно интерес.
    1. Визуализация небольших артериолES с отраженной световой микроскопии требует большего контраста, чем это предусмотрено эритроцитов колонки. Мы в первую очередь использовать побочный поток темном поле микроскопа изображений для повышения микрососудистых контраст, но контраст также может быть улучшено с отраженного света флуоресцентным микроскопом после внутривенной инъекции с высокой молекулярной массой флуоресцентные декстрана.
  15. После 30-минутного уравновешивания, захват изображений / видео судна интересов.
  16. Стимулировать мышц с квадратной волны длительностью 200 мкс, 2 мА амплитуды, поставляется в 8 Гц, в течение 90 сек, как описано выше.
  17. Захват другое изображение / видео сразу после стимуляции и продолжают снимать каждую минуту, пока судно не вернулись в покое диаметра, ~ 10 мин.
  18. Повторите шаги 6-18 использовании противоположной мышцы.
  19. Анализ данных может быть выполнена в режиме реального времени с видео суппортами или офф-лайн с изображением программного обеспечения для анализа.
  20. Усыпить мышь следитьING IACUC протокол.

3. Spinotrapezius Harvest тканей и фиксация

  1. Anesthetize мышей внутрибрюшинного введения; формулировка, как и в Spinotrapezius поток артерии Лигирование шаг 1.
  2. Сделайте надрез на несколько миллиметров краниально к костной известность лопатки мыши, используя диафрагму ножницами и щипцами стандартного шаблона. Развернуть разрез сбоку, а затем каудально с обеих сторон.
  3. Освободите кожу от спинного туловище, слегка отражающий кожи и сокращения поверхностной фасции.
  4. Используйте тупой диссекции, чтобы удалить спинной жировой ткани с использованием стандартных щипцов, а затем отражать мышц и анализировать аналогичным вентральной жировой ткани.
  5. Удалить фасции покрывающей мышцы с помощью пинцета и ножниц весной. Этот шаг может быть трудно и отнимает много времени, но важно улучшить иммунофлуоресцентного окрашивания и обработки изображений. Хранение тканей гидратированных может облегчить удаление фасции.
  6. Обнаруживатьбоковые границы мышцы, и использовать тупой диссекции отделить spinotrapezius мышцы от жировой ткани, которая лежит вентрально к нему.
  7. Продолжить тупой диссекции в головы к хвосту направлении. Отметим, что несколько сосудов въезжать и выезжать из этого вентральной поверхности мышцы, если перфузия, оно должно быть выполнено до пересекающих эти сосуды. Отметим также, что в каудальной половины мышц, его боковые вставки границу в мышцы, находящейся вентральной к нему. Некоторые резки может потребоваться вдоль этой границы, чтобы полностью определить и освободить края.
  8. Акцизный spinotrapezius мышцы. Для этого:
    1. Бесплатные бокового края мышцы, как описано выше.
    2. Сокращение поперечно наиболее черепно степени мышцы.
    3. Разрежьте вдоль медиальной границей (вдоль позвоночника), в сагиттальной плоскости.
  9. Повторите процедуру 4-9 шагов на противоположной мышцы, а потом усыпить мУз по IACUC утвержденного метода.
  10. Исправить тканей на покрытые желатином предметные стекла путем погружения в охлажденным метанолом (4 ° C) или в 4% параформальдегид / деионизированной водном растворе при комнатной температуре в течение 20 мин.
    1. Кроме того, перфузии фиксации могут быть использованы. До шагу 2, выполнить торакотомия, сделать разрез в правом предсердии, и заливать сосудистую с 5 мл 1 × трис-буферном растворе с 0,1 мМ CaCl 2 и 2% гепарина через левый желудочек, затем по 5 мл 4 % параформальдегидом для фиксации судна, и, наконец, 5 мл 1 × трис-буферном растворе с 0,1 мМ CaCl 2 7.
  11. Сразу же после фиксации, мыть образец четыре раза в течение 20 минут каждый с использованием 0,01 М фосфатным буферным раствором (PBS) с 0,1% сапонина.

Representative Results

Хирургические вид на главную артерию кормления spinotrapezius мышц, которые претерпевает перевязки показано на рисунке 1, с этикетками с указанием областей интереса. Например конфокальной образом собирают и иммуноокрашиванию область мышца, расположенная непосредственно ниже по течению от лигировали артерии через неделю после перевязки показано на рисунке 2А. Расширенное артериол обеспечения содержащих гладкие мышцы альфа-актин выражения гладкомышечных клеток (красные) отличаются характерным извилистости после перевязки. Судно извитость, сообщил, как отношение длины судна пути и шнур расстоянии (т. е. линии, проходящей над теми же концами пути судна), в лигированную мышцы (справа) повышается по отношению к unligated противоположной мышцы (рис. 2Б, п = 8) На рис. 3 представлены результаты экспериментального исследования, в котором терминал артериол функциональное расширение кровеносных сосудов измеряли с помощью прижизненной микроскопии. Как и ожидалось, артериол ди ameter значительно увеличивается после электрической стимуляции вызванных мышечных сокращений.

Рисунок 1
Рисунок 1. Хирургическое поле отраженных spinotrapezius мышц и корма артерии. Подачи артерию перевязывают в двух местах, указанных на A0. Между этими лигатуры и после обструкции кровотока, артерия перерезана на сайте указано А. целевого сегмента артерии переходы от брюшной жировой ткани, изложенные C, в spinotrapezius мышцы, изложенные D, на сайте указано со стрелкой B. Направление потока указано пунктирными стрелками E.

ghres.jpg "/>
Рисунок 2. Конфокальная образ spinotrapezius сеть капилляров мышц для экспериментального исследования извилистость. (A) Заготовление и весь монтаж мышцы иммуноокрашиванию для гладких мышцах альфа-актин и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. Поле зрения показана область мышца, расположенная непосредственно за лигированную артериол 1 перевязки сообщению недели. Извилистый суда очевидна в мышцах в результате перевязки (B) Результаты пилотного исследования показывают, значительно увеличилось (р = 0,035, Т-тест 1 хвостами Стьюдента). Извилистости выставлены на микрососудов в лигированную мышцы, как измеряется судно длиной пути к Шнур расстояние соотношение суд над C57BL / 6 (N = 8) по сравнению с контралатеральной управления.

Рисунок 3
FIGURE 3. Прижизненные изображения микроскопии функциональных вазодилатации артериол в spinotrapezius, в естественных условиях. (A) представитель микрофотографии spinotrapezius артериол терминала в покое (слева) и сразу же после прекращения 8 Гц сокращения мышц (справа). (B) Терминал артериолы диаметром в покое ( 8,5 ± 0,5 мкм, слева) и сразу после (11 ± 1 мкм, средний) 90 секунд мышечных сокращений, которые значительно увеличили диаметр артериол (р = 0,032; 1-хвост парного критерия Стьюдента) в Balb / C мышей (n = 6). Процентное изменение указал (справа).

Discussion

Мышиный перевязки spinotrapezius модель, представленная здесь, является эффективным маленькая модель животных для изучения функциональной и структурной адаптации, которые в результате артериальной окклюзии. Эта модель является дополнением к широко используемым ишемии задних конечностей модель 4, в том, что она обеспечивает цельномышечных вид нетронутой микрососудистых сетей с высоким пространственным разрешением. Кроме того, поскольку эта мышца находится непосредственно под кожей спины, она доступна для последовательных изображений с прижизненной микроскопии, а также для локальной доставки наркотиков через superfusion или тонкой имплантации Фильм 2. Эти особенности делают его привлекательным маленькая модель животного, в котором для изучения влияния новых терапевтических целей на ремоделирования сосудов и функциональной вазодилатации после артериальной окклюзии.

Обратите внимание, что осторожностью следует применять при сравнении данных, полученных в spinotrapezius модели лигирования с данными, полученными в задней конечности модели перевязки за счет нескольких ключевых гifferences. Во-первых, spinotrapezius мышцы стабилизирующие мышцы, и они отличаются от мышц ног с точки зрения функций и распределение волокон типа. Наша группа ранее показала, что артериол перевязки в spinotrapezius мышц создает меньше или незначительной гипоксии в штаммах с хорошо развитой обеспечения артериол сети, по сравнению с гипоксией наблюдается в задней лапы после перевязки бедренной артерии в задней конечности модель 1,8 - 10. Мы также показали, что spinotrapezius модели перевязки производит различную реакцию ремоделирования BALB / C мышей по сравнению с C57BL / 6, с BALB / C мышей сетей ремоделирования капиллярного обеспеченности и C57BL / 6 ремоделирования по расширению существующих артериол соединения 3. Существует интересная параллель между этими наблюдениями и те, сделанные в задней конечности модели перевязки, где BALB / C мышей испытывать длительное восстановление перфузии после перевязки по сравнению с C57BL / 6, 9,11,12 </ SUP>. В других моделях ишемии тканей, мыши возрасте 13 лет гендерные 14 и наличие болезни 15 также повлиять ответы тканей к окклюзии артериол, хотя мы еще не проверили эти предикторы в spinotrapezius модели перевязки.

Во-вторых, размер артерия, которая лигируют в spinotrapezius модели существенно меньше, чем в бедренную артерию, и, следовательно, влияет на перевязки меньшего объема ткани, которая ниже по течению, то есть на более низком уровне сердечно-сосудистой дерево, в spinotrapezius по сравнению с задних конечностей 3. Таким образом, анатомическое различие в расположении перевязки в этих двух моделей следует учитывать при сравнении соответствующих физиологических реакций (например, ремоделирования сосудов) к этому вмешательству.

В-третьих, тонкость spinotrapezius может позволить кислороду достигать unperfused часть ткани из соседнихткани, по сравнению с комбинированной ишемии и гипоксии в задней конечности модель, как отмечалось выше 3. В-четвертых, восстановление потока в части spinotrapezius вниз по течению от перевязки быстрее, чем в задних конечностей труб. Spinotrapezius модели перевязки является уникальным хронических модели и не следует путать с другими моделями переходного артериальной окклюзии или модели ишемии реперфузии травмы. Мы считаем возможным, чтобы адаптировать эту модель, чтобы удовлетворить эти типы условий, но это выходит за рамки работы, представленные в настоящем документе. Наконец, мы предостерегаем от непосредственно связанные доклинических наблюдений в этой модели клинических проявлений ишемической болезни у людей, особенно при использовании молодых и здоровых мышей и из-за присущей физиологических пределах, такие как частота сердечных сокращений выше 5. Тем не менее, мы рассматриваем эту новую модель в качестве ценного инструмента для выявления основных механизмов тканей ответы на перевязки и выявление потенциальныхrapeutic цели в настройки в естественных условиях.

В дополнение к хирургическому отмечает, предусмотренных в spinotrapezius подачи перевязки артерии процедуры (анатомические записка (6а), отличающие артерии от вен (9а), а также использование одной лигатуры (11а)), несколько других аспектов процедуры выгоду от обсуждение.

Первый, начальный разрез, сделанный на спинной жир границы площадки (или несколько мм каудально по отношению к лопатке, если трансдермальный визуализации невозможен) идеально сделано как малые, как хирург комфортно, и расширил во время процедуры, если это необходимо. Эта практика сводит к минимуму наложения швов требуется, чтобы закрыть разрез, что удобно для хирурга, сокращает время процедуры, а также является менее раздражающим для животных во время восстановления. Кроме того, большой разрез кожи может быть целесообразным в соответствии с предпочтениями хирурга, так как мышца может быть легче найти с расширенным полем. В этом случае разрез можетвыгоду от форму подковы с медиальной открытым лицом, чтобы складывать по направлению к позвоночнику. При принятии разрез кожи и проходящей через вторичные слои кожи, если надводное судно повреждено и вызывает кровотечение, применяются светового давления стерильной марлей и дать время для гемостаза.

Также отметим, важно, чтобы справиться с тканью с минимально необходимым силу, и, по возможности держать щипцами ближе к боковой границе мышцы и от предполагаемой зоне ишемии. Эта практика помогает избежать давки травмы, которая может привести к дополнительным воспалительных опосредованной ткани ответов, которые могут запутать сосудистых реакций реконструкция вызванные артериальной труб.

В заключение, мы продемонстрировали использование мышиных spinotrapezius мышцы в хирургическом модель для изучения сосудистых и тканевых ответов на артериол труб. Эта модель подходит для прижизненной оценки сосудистых изменений (дляНапример, функциональное расширение кровеносных сосудов), и для бывших оценки естественных сосудистых изменений (например, иммунофлуоресцентного визуализации и количественной сосудистой сети). Оба доклинические и клинические исследования показали, что реакция человека на артериол препятствие (например, с помощью перевязки у мышей или атеросклеротические бляшки в организме человека) зависит от их возраста наличии или отсутствии заболевания (например, сахарный диабет), диаметр препятствия артерии , генетической структуре личности, и метаболический спроса тканей 11-15. Мышиной модели, такие, как тот, представленные здесь, воспользоваться исследователь штамм-специфических анатомических и генетических различий и конкретных заболеваний фенотипы, что облегчает расследование этих сложных отношениях.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Мы признаем, Кевин Маклауд для использования его творческого достояния лицензионной музыки в соответствующем видео, включая (в порядке появления) его треки "Аэропорт Lounge", "Обои" и "Вечер Мелодрама". Мы также хотели бы отметить Ndubisi Okeke и Фредерик Torstrick за их помощь в операции видео.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iris scissors FST 14090-09 Type: Tool
Size 7 forceps FST 11271-30 Type: Tool
Size 5 forceps FST 11251-20 Type: Tool
Spring scissors Roboz RS5671 Type: Tool
Microprobe FST 10140-03 Type: Tool
May be substituted with straight probe
Needle holder FST 12500-12 Type: Tool
Induction chamber JD Medical Dist. Co., Inc. IC-1086 Type: Equipment
Eye Gel Dechra NDC 17033-211-38 Type: Reagent
Heat pad FST 21060-01 Type: Equipment
Rectal temperature probe FST 21060-01 Type: Equipment
Stimulating electrodes FHC UEWSGCSE0N1M Type: Equipment
Artisan's Polymer Clay Polyform N/A Type: Equipment
PowerLab data acquisition system ADInstruments ML 845 Type: Equipment
Stimulus isolator ADInstruments FE 180 Type: Equipment
LabChart ADInstruments ML S060/7 Type: Software
Reflected-light fluorescent microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High MW fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent
Video calipers Colorado Video 308 Type: Equipment
Automated Vascular Analysis (AVA) Microvision Medical Type: Software
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore Sigma 1A4-Cy3 Type: Reagent
Clonal, 1:100
Fluorescent Microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High-molecular weight fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bailey, A. M., O'Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation. Microcirculation. 15, 389-404 (2010).
  2. Bruce, A. C., Peirce, S. M. Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model. Microcirculation. 19, 143-154 (2012).
  3. Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 17, 333-347 (2010).
  4. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (23), e1035 (2009).
  5. Madeddu, P., et al. Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems. Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).
  6. Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front. Physio. 2, 91 (2011).
  7. Sefcik, L. S., et al. Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth. Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).
  8. Deindl, E., et al. Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit. Circulation Research. 89, 779-786 (2001).
  9. Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain. Circulation Research. 105, 89-98 (2009).
  10. Scholz, D., et al. Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).
  11. McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
  12. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
  13. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).
  14. Peng, X., et al. Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).
  15. Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice. Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).
Мышиные Spinotrapezius модели для оценки воздействия артериол Лигирование на микрососудистой функции и ремоделирования
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).More

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter