Summary
हम एक उपन्यास murine spinotrapezius मांसपेशी में धमनी ligation मॉडल एक कदम दर कदम प्रक्रिया और आवश्यक उपकरण के विवरण सहित, प्रदर्शित करता है. हम सर्जरी और प्रासंगिक परिणाम संवहनी नेटवर्क remodeling और कार्यात्मक vasodilation intravital और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए संबंधित माप का वर्णन करता है.
Abstract
murine spinotrapezius एक पतली, सतही कंकाल समर्थन मांसपेशियों कि T3 से L4 तक फैली है, और पृष्ठीय त्वचा चीरा के माध्यम से आसानी से सुलभ है. अपनी अनूठी शरीर रचना spinotrapezius इस्कीमिक चोट और बाद microvascular remodeling की जांच के लिए उपयोगी बनाता है. यहाँ, हम कि हमारे शोध टीम द्वारा विकसित किया गया था और पहले 1-3 प्रकाशित murine spinotrapezius मांसपेशी में एक arteriolar ligation मॉडल को प्रदर्शित करता है. कुछ माउस / Balb सी के रूप में इस तरह के कमजोर माउस उपभेदों, के लिए, इस ligation सर्जरी मज़बूती से कंकाल की मांसपेशी ischemia बनाता और चिकित्सा कि revascularization को प्रोत्साहित की जांच करने के लिए एक मंच के रूप में कार्य करता है. मूल्यांकन के तरीके भी intravital और confocal माइक्रोस्कोपी के उपयोग सहित प्रदर्शन कर रहे हैं. spinotrapezius अच्छी तरह से जैसे इमेजिंग (सतही पृष्ठीय शरीर रचना) पहुंच और रिश्तेदार thinness (60-200 सुक्ष्ममापी) के कारण अध्ययन के लिए अनुकूल है. spinotrapezius पेशी चेहरा एन बढ़ सकता है, को सुविधाजनक बनानेhistological सेक्शनिंग के बिना पूरे मांसपेशी microvascular नेटवर्क के इमेजिंग. हम intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक कार्यात्मक vasodilation प्रक्रिया निम्नलिखित मैट्रिक्स के अधिग्रहण का वर्णन है, विशेष रूप से, मांसपेशियों में संकुचन का एक परिणाम रूप में arterilar व्यास में वृद्धि हुई है. हम भी कटाई और ऊतकों फिक्सिंग के लिए प्रक्रियाओं, अध्ययन और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग immunostaining के लिए एक आवश्यक अग्रदूत प्रदर्शित करता है.
Introduction
इस्कीमिक रोगों जैसे परिधीय धमनी रोग, कोरोनरी धमनी रोग, और cerebrovascular रोग के रूप में, के pathophysiology की जांच के लिए पुरानी ischemia के पशु मॉडल मूल्यवान उपकरण हैं. कृन्तकों में, मनुष्य के रूप में, धमनी रोड़ा संवहनी नेटवर्क के संरचनात्मक remodeling होता arteriogenesis और angiogenesis सहित. स्वस्थ और युवा मरीजों में, इस remodeling ischemia प्रेरित चोट से ऊतक का बचाव करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, लेकिन से मधुमेह जैसे सह morbidities गंभीर remodeling और वसूली के साथ समझौता कर सकते हैं कर सकते हैं. नाड़ी remodeling घटनाओं अंतर्निहित तंत्र को समझना चिकित्सा कि इन अंतर्जात revascularization प्रक्रियाओं को प्रोत्साहित करने के विकास के लिए आवश्यक है.
वर्तमान में, और्विक धमनी या hindlimb में ligation लकीर छोटे 4,5 पशुओं में पुरानी ischemia प्रेरित संवहनी remodeling के अध्ययन के लिए मानक तकनीक है. व्यास, कनेक्टिविटी, और जेट के विश्लेषणmicrovessels कि ligated और्विक धमनी के संवहनी नेटवर्क अनुप्रवाह तथापि, मांसपेशियों की मोटाई की वजह से मुश्किल है. इस स्थिर पृष्ठीय 1 मांसपेशी में पार्श्व फ़ीड धमनी की एकतरफा ligation: हम माउस spinotrapezius मांसपेशी में एक arteriolar ligation मॉडल विकसित किया है. अपेक्षाकृत पतली spinotrapezius (60-200 सुक्ष्ममापी) एन चेहरा immunostaining एकल कोशिका के संकल्प के साथ पूरे नेटवर्क टोपोलॉजी के मूल्यांकन के लिए उत्तरदायी है, पूरे ऊतक भर में संवहनी remodeling की घटनाओं की एक विस्तृत जांच की अनुमति देता है. spinotrapezius भी सतही और सुलभ है, और इस प्रकार अपने जहाजों intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा आसानी से प्रत्यक्ष कर रहे हैं नाड़ी जेट पर remodeling और arteriolar ligation के प्रभाव की कुशल लक्षण वर्णन के लिए.
इस रिपोर्ट में, हम विस्तार से वर्णन है और माउस spinotrapezius arteriolar ligation मॉडल का प्रदर्शन. Vivo और पूर्व vivo मुझे दोनों मेंसर्जरी के बाद मूल्यांकन का thods, कार्यात्मक vasodilation, जो इस्कीमिक 6 शर्तों के तहत प्रभावित होना दिखाया गया है और पूरे मांसपेशी microvascular नेटवर्क के immunofluorescent इमेजिंग की माप सहित वर्णित हैं. हम भी दो अलग पायलट अध्ययन के परिणाम के लिए मॉडल की उपयोगिता का प्रदर्शन शामिल हैं. सबसे पहले, हम धमनी ligation मॉडल का उपयोग C57BL / 6 चूहों (चित्रा 2B) में एक पोत टेढ़ा - मेढ़ापन में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि के लिए प्रेरित करना. टेढ़ा - मेढ़ापन धमनिका collaterals में arteriogenesis के दौरान बढ़ जाती है. अन्य माउस उपभेदों में, उस अधिक संपार्श्विक arterioles (जैसे Balb / ग) के अभाव के कारण ischemia के लिए असुरक्षित हैं, केशिका धमनीचक्र संयोजन 10 मनाया जाता है. केशिका धमनीचक्र संयोजन वृद्धि की diameters और α चिकनी पेशी actin जेट के विकास से पता चला है. दूसरा, मांसपेशियों के कार्यात्मक बिजली की उत्तेजना spinotrapezi के टर्मिनल arterioles में vasodilation की ओर जाता हैहमें (3B चित्रा).
Protocol
1. Spinotrapezius फ़ीड धमनी Ligation सर्जरी
- Intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize. 100 मिलीग्राम / एमएल Ketamine 0.06 मिलीलीटर: एक 0.5 मिलीलीटर सिरिंज में, तैयार
0.03 20.0 मिलीग्राम / एमएल Xylazine मिलीलीटर
0.01 0.4 मिलीग्राम / एमएल atropine के मिलीलीटर
0.30 0.9% Saline मिलीलीटर.
खुराक: 0.01 मिलीग्राम * ग्राम शरीर के वजन के प्रति आईपी,
* माउस तनाव और शेयर पर खुराक चर, तदनुसार प्रेरण से एक घंटे के भीतर समायोजित तो माउस वसूली है.
- मानक नेत्र मरहम लागू corneal शुष्क्ीकरण रोकने के.
- Trimming कतरनी, लोमनाशक क्रीम का संक्षिप्त अनुप्रयोग द्वारा पीछा करने के लिए उपयोग कर पीछे से बाल निकालें.
- Chlorhexidine या povidone आयोडीन के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र कीटाणुरहित. वैकल्पिक तीन बार इथेनॉल के साथ povidone आयोडीन povidone आयोडीन के साथ समाप्त.
- हीटिंग पैड और बाँझ कपड़ा के साथ पहले से तैयार शल्य काम की सतह पर माउस, स्थानांतरणजगह में.
- पृष्ठीय त्वचा के माध्यम से एक रेखीय चीरा (3-5 मिमी) लगभग 5 मिमी कंधे tenting द्वारा परितारिका कैंची और मानक पैटर्न संदंश (FST जैसे, 11271-30) ऊतक का उपयोग करने के लिए और समानांतर काटने ब्लेड की बोनी प्रमुखता लांगुलिय बनाएँ रीढ़. लक्ष्य चीरा साइट अगर त्वचा pigmentation परमिट पृष्ठीय वसा पैड के transdermal दृश्य से पहचाना जा सकता है, वसा पैड के लांगुलिय सीमा में कटौती. चीरा विस्तार के रूप में की जरूरत है, और माध्यमिक त्वचा वसंत कैंची का उपयोग परतों के माध्यम से विस्तार.
- शारीरिक नोट - spinotrapezius मांसपेशी पीछे की ओर स्थित है और रीढ़ की हड्डी के दोनों ओर साथ L3 टी -4 से फैली है. पूर्वकाल सीमा लगभग कंधे ब्लेड laterally फैली हुई है. मांसपेशी लांगुलिय दिशा में tapers पूर्वकाल सीमा तो यह है कि सबसे पीछे सीमा औसत दर्जे का निहित है, और रीढ़ की हड्डी के साथ फ्लश करना हो सकता है. दो वसा पैड भी ध्यान दें करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, spinotrapezius सीधे पृष्ठीय और उदर बिछानेकपाल 1/2 की ओर मांसपेशियों.
- चीरा के कारण सूजन संवहनी remodeling प्रतिक्रिया पर कोई प्रभाव नहीं है, के रूप में नकली ligation सर्जरी spinotrapezius vasculature की remodeling में कोई परिवर्तन नहीं दिखाई करने के लिए दिखाया गया है. दो स्थानिक कारकों इस परिणाम के लिए योगदान करते हैं. पहले चीरा ब्याज जहां मांसपेशियों में संवहनी प्रतिक्रिया आम तौर पर जांच की जाती है के क्षेत्र से कपाल दिशा में 5 मिमी से निकाल दिया जाता है. इसके अतिरिक्त, पृष्ठीय त्वचा पर चीरा साइट पोत ligation साइट से कि spinotrapezius की मांसपेशी के कपाल 3 के शीर्ष पर स्थित एक उदर वसा पैड से अलग है.
- गर्म है घंटी मांसपेशी शुष्क्ीकरण रोकने के समाधान के साथ चीरा सिंचाई. Papaverine के रूप में इस तरह के vasodilators आवेदन ligation के लिए लक्ष्य धमनी visualizing में सहायता करेगा.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, संदंश उपयोग को काटना कुंद और अलग (को दूर नहीं लेकिन) अंतर्निहित musc से पृष्ठीय सफेद वसा पैडular ऊतक आदेश में vasculature कल्पना करने के रूप में इसे प्रवेश और अपने पार्श्व बढ़त पर spinotrapezius पत्ते.
- पता लगाएँ लक्ष्य धमनी, जो एक या दो बनती नसों के साथ साथ, वसा पैड है कि मांसपेशियों के पार्श्व किनारे करने के लिए अपने रास्ते पर spinotrapezius उदर है के माध्यम से गुजरता है. यह धमनी मांसपेशियों की है, जो दर्शाती है और मांसपेशी की जगह के लिए मांसपेशियों के भीतर धमनी के पथ का निरीक्षण द्वारा पुष्टि की जा सकती है की दुम का 1/2 का एक बड़ा हिस्सा खिलाती है. ligation के लिए लक्ष्य स्थान धमनी उदर वसा पैड निकल और मांसपेशियों में प्रवेश के खंड है, और इस क्षेत्र में काफी सुलभ है. जोड़ी धमनी नस धीरे इस क्षेत्र में उदर वसा पैड से अलग करने की जरूरत हो सकती है. ध्यान दें कि spinotrapezius एकाधिक धमनी नस जोड़े द्वारा खिलाया है अनुप्रस्थ या तो पृष्ठीय और उदर वसा पैड है कि जहाजों सहित,. देखभाल करने के लिए इन जहाजों को बाधित नहीं.
- कई संकेतकों के लिए धमनी भेद किया जा सकता हैनस से. सर्वोत्तम तरीकों में से धीरे microprobe साथ रक्त प्रवाह में बाधा डालती है और नदी के ऊपर पेशी से दूर स्थानांतरित करने के लिए है, प्रवाह धमनी में फिर से शुरू नहीं जब तक बाधा जारी है. रंग भी इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में नस दीवारों संयोजी ऊतक का एक whitish म्यान कि धमनियों की कमी होती है. इसके अलावा, एक vasodilator के आवेदन से पहले व्यास के रूप में विचार नसों आम तौर पर कर रहे हैं आकार में बड़ा हो सकता है.
- धमनी अपने बनती नस के करीब निकटता में आम तौर पर होता है, एक microprobe और 5 लगभग 5 मिमी खंड अलग संदंश साथ धमनी पीछे microprobe गुजर रहा है, और टिप का उपयोग करने के लिए प्राकृतिक में एक व्यापक अंतराल के द्वारा कुंद विच्छेदन, उपयोग धमनी और शिरा के बीच फांक. यह अंतर है जिसके माध्यम से सीवन पिरोया जाएगा.
- 10-0 एकल धागा सिवनी और सुई धारक dissected सर्जन गाँठ का उपयोग क्षेत्र के समीपस्थ अंत की ओर फ़ीड धमनी (~ 70 सुक्ष्ममापी व्यास) के चारों ओर एक ligation जगह का उपयोग. पीएलएCE dissected धमनी खंड के बाहर का अंत की दिशा में एक अतिरिक्त संयुक्ताक्षर के बीच पर्याप्त जुदाई धमनी की transection के लिए अनुमति देने के साथ, ligation.
- spinotrapezius फ़ीड धमनी के साथ जुड़े छोटे पैमाने पर वृद्धि की शल्य कठिनाई की ओर जाता है और्विक धमनी के रूप में एक बड़ा पोत के ligation की तुलना में,. अनुभवहीन सर्जन विशेष रूप से तोड़ - फोड़, अनजाने में ख़ून का बहाव, और अन्य शल्य जटिलताओं की उच्च दर है. विशेष चिंता की पहचान और बेरंग धमनी काटने के बाद प्रवाह काटने से पहले ही किया गया अवस्र्द्ध की कठिनाई है. इन कारणों के लिए, 2 संयुक्ताक्षर रखने प्रक्रिया के लिए अनभ्यस्त उन लोगों के लिए सिफारिश की है, के रूप में सर्जन लगाने जहां धमनी आड़ा काट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तत्काल 2 संयुक्ताक्षर की जुदाई के साथ नमूदार कटौती की पुष्टि करने में एक दृश्य गाइड है. हालांकि, एक अधिक अनुभवी सर्जन एक एकल संयुक्ताक्षर पर्याप्त लगता है, के रूप में लंबे समय के रूप में वे स्पष्ट रूप से करने में सक्षम हैंपहचान और संयुक्ताक्षर की धमनी अनुप्रवाह में कटौती. हालांकि इस तकनीक को अनजाने तेज ligation सीवन के साथ पास के एक पोत nicking के जोखिम को कम कर देता है, यह धमनी transected था की पुष्टि में वृद्धि कठिनाई सहित कमियां के बिना नहीं है.
- रक्त के प्रवाह के ह्रास (बाधित आरबीसी स्तंभ) ligation साइट के बहाव (यानी मांसपेशी की दिशा में) देख ligation सत्यापित करें.
- का प्रयोग विदारक कैंची दो संयुक्ताक्षर बीच ligated धमनी, आड़ा काट. अगर केवल एक संयुक्ताक्षर (11a) रखा गया था, नीचे की ओर दिशा में चरम देखभाल के साथ कटौती.
- सादे फिल्म लोड औषध (1 मिमी) अनुप्रवाह प्रयोगात्मक प्रक्रिया के हिस्से के रूप में रखा जा सकता है (दुमदारी से).
- विस्थापित प्रावरणी और उनके मूल उन्मुखीकरण के लिए वसा ऊतकों reposition.
- त्वचा चीरा 8-0 गैर resorbable sutures का उपयोग बंद. फिर एक तैयार गर्म वसूली पिंजरे में निगरानी में माउस और जगह एक एपी प्रशासनbupivacaine, 0.02-0.05 मिलीग्राम 0.25% स्थानीय घुसपैठ के रूप में एनाल्जेसिक propriate.
2. Spinotrapezius बगल में intravital माइक्रोस्कोपी,
- एक प्रेरण कक्ष में 3-4 3-4 एल के एक प्रवाह दर · -1 मिनट में isoflurane% 100% ऑक्सीजन में vaporized साथ माउस anesthetize.
- inhalant संज्ञाहरण का उपयोग कार्यात्मक मापन के लिए बेहतर है क्योंकि वहाँ इंजेक्शन anesthetics के साथ तुलना में कम हृदय अवसाद है. यदि उपलब्ध नहीं है, लंबे समय से अभिनय pentobarbital सोडियम के रूप में इस तरह के इंजेक्शन anesthetics, में inhalant संज्ञाहरण दोहराने इंजेक्शन से बचने के लिए एक बार पशु तैनात किया गया है पसंद कर रहे हैं.
- एक बार anesthetized, लगातार एक संज्ञाहरण मुखौटा (उर्फ नाक शंकु) के माध्यम से रखरखाव (आमतौर पर ~ 2%) सांद्रता और 0.5-1 एल · मिनट -1 के प्रवाह की दर में isoflurane उद्धार.
- चूहे predominately अपने नाक passages के माध्यम से हवादार, तो यह केवल necसंज्ञाहरण मुखौटा डायाफ्राम के साथ उनकी नाक को कवर essary.
- यदि आवश्यक हो, वापस trimming कतरनी और लोमनाशक क्रीम का उपयोग से बालों को हटाने के.
- गर्मी पैड पशु परिवहन.
- यह महत्वपूर्ण है कि एक euthermic राज्य में चूहों को बनाए रखने के लिए ठंड प्रेरित वाहिकासंकीर्णन को रोकने, इस दीपक के माध्यम से पूरा किया जा सकता है, पानी परिसंचारी गर्मी पैड, microwavable पैड, आदि तपता
- गुदा तापमान जांच डालें और 35 थर्मामीटरों नियंत्रक सेट डिग्री सेल्सियस
- आईरिस कैंची और मानक पैटर्न संदंश का उपयोग spinotrapezius की दुम का अंत में एक चीरा त्वचा.
- वसा पैड के लिए चीरा cranially विस्तार, एक घोड़े की नाल चीरा बनाने, और प्लास्टिक की चादर के साथ desiccation रोकने के त्वचा प्रालंब कवर.
- ब्लंट संदंश और वसंत कैंची की दृश्यता अधिकतम करने के साथ चमड़े के नीचे संयोजी ऊतक काटना.
- करीब toge के रूप में उत्तेजक इलेक्ट्रोड रखेंसंभव के रूप में वहाँ, वर्तमान क्षेत्र के आकार को कम करने के लिए, और उन्हें उजागर सिर्फ रीढ़ की हड्डी में पार्श्व मांसपेशियों की दुम का अंत में स्थिति.
- एक परीक्षण उत्तेजना का प्रदर्शन करने के लिए इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट की पुष्टि एक इलेक्ट्रोड डाटा अधिग्रहण प्रणाली, इलेक्ट्रोड उत्तेजना अलगाने, और कंप्यूटर नियंत्रक एक 200 μsec अवधि 2 मा आयाम, 1 हर्ट्ज पर दिया वर्ग लहरों के साथ.
- उजागर पेशी पर प्लास्टिक की चादर प्लेस desiccation को रोकने के लिए.
- एक 30 मिनट की अवधि के दौरान जो पोत diameters संतुलन में लाना समय शुरू करो.
- Spinotrapezius पेशी पर स्थिति intravital खुर्दबीन संवहनी वास्तुकला देखने.
- एक विसर्जन लेंस का उपयोग अगर, पीबीएस के उद्देश्य और प्लास्टिक की चादर के बीच एक बूंद जगह है.
- मुख्य धमनिका (दृश्य सबसे बड़ा पोत) के ऊपर शुरू, XY विमान में मंच में हेरफेर करने के लिए ब्याज के जहाज का पता लगाने के लिए.
- छोटे arteriol Visualizingतों परिलक्षित प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ अधिक से अधिक विपरीत से स्तंभ लाल सेल द्वारा प्रदान की आवश्यकता है. हम मुख्य रूप से एक पक्ष धारा काले क्षेत्र इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग microvascular विपरीत बढ़ाने के लिए, लेकिन इसके विपरीत भी एक उच्च आणविक भार फ्लोरोसेंट dextran की नसों में इंजेक्शन के बाद एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन परिलक्षित प्रकाश के साथ सुधार किया जा सकता है.
- संतुलन 30 मिनट के बाद, एक / ब्याज की पोत की छवि, वीडियो पर कब्जा.
- 200 μsec अवधि, 2 मा आयाम, 90 सेकंड के लिए 8 हर्ट्ज, पर दिया, जैसा कि ऊपर वर्णित के वर्ग लहरों के साथ मांसपेशियों को प्रोत्साहित.
- एक और छवि / वीडियो तुरंत बाद उत्तेजना पर कब्जा है और हर मिनट पर कब्जा करने के लिए जब तक पोत आराम कर रही व्यास के लिए वापस आ गया है करने के लिए जारी है, 10 मिनट ~.
- 6-18 कदम contralateral मांसपेशी का उपयोग दोहराएँ.
- डेटा विश्लेषण वीडियो छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ या बंद लाइन नली का व्यास के साथ वास्तविक समय में किया जा सकता है.
- Euthanize माउस का पालनआईएनजी IACUC प्रोटोकॉल.
3. Spinotrapezius ऊतक हार्वेस्ट और फिक्सेशन
- Spinotrapezius फ़ीड धमनी Ligation चरण 1 के रूप में तैयार करने, intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा चूहों anesthetize.
- एक चीरा कई माउस के कंधे ब्लेड परितारिका कैंची और मानक पैटर्न संदंश का उपयोग कर की बोनी प्रमुखता से कपाल मिलीमीटर. चीरा laterally और फिर दुमदारी से दोनों पक्षों पर विस्तार.
- पृष्ठीय धड़ से धीरे त्वचा को दर्शाती है और सतही प्रावरणी काटने के द्वारा त्वचा रिलीज.
- कुंद विच्छेदन प्रयोग मानक संदंश का उपयोग पृष्ठीय वसा ऊतक निकालने के लिए, और तब मांसपेशी को प्रतिबिंबित और इसी तरह उदर वसा ऊतकों काटना.
- संदंश और वसंत कैंची का उपयोग मांसपेशी overlying प्रावरणी निकालें. यह कदम कठिन और समय लेने वाली हो सकते हैं, लेकिन करने के लिए immunofluorescent धुंधला हो जाना और इमेजिंग में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है. ऊतक हाइड्रेटेड रखते हुए प्रावरणी के हटाने को कम कर सकते हैं.
- पता लगाएँमांसपेशियों के पार्श्व सीमा, और कुंद विच्छेदन का उपयोग करने के लिए वसा पैड है कि यह करने के लिए उदर निहित से spinotrapezius मांसपेशी अलग.
- लांगुलिय दिशा में एक कपाल कुंद विच्छेदन जारी. ध्यान दें कि कई रक्त वाहिकाओं में प्रवेश करने और मांसपेशियों के इस ventral सतह छोड़, अगर छिड़काव की आवश्यकता है, यह इन जहाजों transecting पहले प्रदर्शन किया जाना चाहिए. यह भी नोट करें कि मांसपेशी की दुम का छमाही में, यह करने के लिए उदर पड़े मांसपेशी में अपने पार्श्व सीमा आवेषण. कुछ काटने के इस सीमा के साथ आवश्यक हो सकता है पूरी तरह से परिभाषित करने और बढ़त मुक्त.
- आबकारी spinotrapezius मांसपेशी. ऐसा करने के लिए:
- मांसपेशियों के पार्श्व धार के रूप में ऊपर वर्णित है.
- मांसपेशी सबसे कपाल हद पार transversely काटें.
- मध्यवर्ती सीमा (रीढ़ साथ) के साथ बाण के समान विमान में काटें.
- दोहराएँ प्रक्रिया contralateral पेशी पर 4-9 कदम है, और फिर मीटर euthanizeouse एक IACUC अनुमोदित विधि द्वारा.
- विसर्जन द्वारा ठंडा मेथनॉल (4 डिग्री सेल्सियस) में या एक 4% / आरटी पर 20 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी समाधान paraformaldehyde में जिलेटिन लेपित गिलास स्लाइड पर ऊतकों को ठीक करें.
- वैकल्पिक रूप से, छिड़काव निर्धारण नियोजित किया जा सकता है. पहले चरण के लिए 2, एक thoracotomy प्रदर्शन, सही प्रांगण में एक चीरा बनाने, और छिड़कना vasculature 1 की 5 मिलीग्राम × 0.1 मिमी 2 CACL और बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से 2% हेपरिन के साथ खारा Tris बफर, 4 की 5 मिलीलीटर द्वारा पीछा के साथ पोत निर्धारण के लिए%, paraformaldehyde, और अंत में 1 की 5 मिलीग्राम × Tris-0.1 मिमी 2 CACL 7 के साथ buffered खारा.
- तुरंत बाद निर्धारण, 20 मिनट के लिए चार बार नमूना धोने प्रत्येक 0.1% saponin के साथ 0.01 फॉस्फेट-buffered एम खारा (पीबीएस) का उपयोग कर.
Representative Results
मुख्य धमनी spinotrapezius मांसपेशी कि ligation undergoes खिलाने के एक शल्य दृश्य चित्र 1 में दिखाया गया है, हित के क्षेत्रों का संकेत लेबल के साथ. मांसपेशी काटा और immunostained क्षेत्र स्थित सीधे ligated धमनी एक सप्ताह से नीचे के बाद ligation चित्रा 2A में दिखाया गया है की एक उदाहरण confocal छवि. बढ़े संपार्श्विक चिकनी पेशी अल्फा actin चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (लाल) व्यक्त युक्त arterioles ligation के बाद विशेषता टेढ़ा - मेढ़ापन प्रदर्शित करते हैं. पोत टेढ़ा - मेढ़ापन, ligated मांसपेशी में पोत पथ लंबाई और रस्सी दूरी (यानी, एक ही बर्तन पथ endpoints पर विस्तार लाइन) के बीच अनुपात के रूप में सूचना दी, (सही) unligated contralateral मांसपेशी सापेक्ष बढ़ाया है (चित्रा 2B, n = 8) 3. चित्रा एक पायलट अध्ययन में टर्मिनल धमनिका कार्यात्मक vasodilation intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मापा गया था के परिणामों से पता चलता है. जैसी कि उम्मीद थी, arteriolar di ameter काफी बिजली की मांसपेशियों उत्तेजना प्रेरित संकुचन के बाद बढ़ जाती है.
चित्रा 1. A0 से संकेत दो स्थानों में परिलक्षित spinotrapezius मांसपेशियों और फ़ीड धमनी का सर्जिकल क्षेत्र फ़ीड धमनी. Ligated है. इन संयुक्ताक्षर के बीच और bloodflow की रुकावट के बाद, धमनी ए द्वारा उदर वसा पैड, सी द्वारा उल्लिखित से धमनी संक्रमण के लक्षित क्षेत्र संकेत स्थल पर transected, मांसपेशी में spinotrapezius, डी द्वारा उल्लिखित है, साइट पर संकेत साथ तीर बी फ्लो दिशा धराशायी तीर ई. द्वारा संकेत दिया है
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चित्रा 2. टेढ़ा - मेढ़ापन के पायलट अध्ययन लिए spinotrapezius मांसपेशी microvascular नेटवर्क की Confocal छवि (ए) काटा और पूरे घुड़सवार पेशी चिकनी पेशी अल्फा actin और imaged confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के लिए immunostained किया गया था. देखने के क्षेत्र से पता चलता है कि पेशी के क्षेत्र सीधे ligated धमनिका 1 सप्ताह के बाद ligation के नीचे स्थित है. टेढ़ा - मेढ़ापन ligated मांसपेशी में microvessels द्वारा प्रदर्शित रूप में पोत पथ लंबाई से मापा, कपटपूर्ण वाहिकाओं मांसपेशी में स्पष्ट ligation का एक परिणाम के रूप में (बी) के पायलट अध्ययन के परिणामों में काफी (1 पूंछ छात्र टी परीक्षण = पी .035) बढ़ दिखा रहे हैं. कॉर्ड C57BL / 6 चूहों के एक परीक्षण के लिए दूरी अनुपात (एन 8 =) contralateral नियंत्रण की तुलना में.
Figu3 रहे हैं. कार्यात्मक vasodilation spinotrapezius arterioles में intravital माइक्रोस्कोपी इमेजिंग vivo में (ए) बाकी (बाएं) spinotrapezius टर्मिनल arterioles के प्रतिनिधि photomicrographs और तुरंत 8 हर्ट्ज मांसपेशी संकुचन (दाएं) की समाप्ति के बाद बाकी (बी) टर्मिनल धमनिका व्यास ( 8.5 ± 0.5 सुक्ष्ममापी, बाएं) और तुरंत बाद (11 ± 1 सुक्ष्ममापी, मध्य) मांसपेशियों में संकुचन के 90 सेकंड है, जो काफी arteriolar (व्यास में वृद्धि हुई p = 0.032, 1-पूंछ (टी परीक्षण / Balb सी चूहों में) बनती n = ) 6. प्रतिशत परिवर्तन का संकेत (दाएं).
Discussion
murine spinotrapezius ligation यहाँ प्रस्तुत मॉडल एक प्रभावी छोटे जानवर एक धमनी रोड़ा से कार्यात्मक और संरचनात्मक रूपांतरों नतीजा यह है कि अध्ययन के लिए मॉडल है. इस मॉडल को व्यापक रूप से इस्तेमाल hindlimb ischemia 4 मॉडल के लिए पूरक है, कि यह उच्च स्थानिक संकल्प के साथ बरकरार microvascular नेटवर्क पूरे मांसपेशी के एक दृश्य प्रदान करता है. इसके अलावा, क्योंकि इस मांसपेशी पृष्ठीय त्वचा के नीचे स्थित है, यह intravital माइक्रोस्कोपी के साथ धारावाहिक इमेजिंग और superfusion या पतली फिल्म 2 आरोपण के माध्यम से स्थानीय दवा वितरण के लिए सुलभ है. इन सुविधाओं यह एक आकर्षक छोटे जो नाड़ी remodeling और धमनी रोड़ा के बाद कार्यात्मक vasodilation पर उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्य के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल बनाते हैं.
ध्यान दें कि सावधानी जब spinotrapezius ligation मॉडल में hindlimb ligation मॉडल में कई महत्वपूर्ण घ के कारण प्राप्त आंकड़ों के प्राप्त आंकड़ों की तुलना इस्तेमाल किया जाना चाहिएifferences. सबसे पहले, spinotrapezius मांसपेशियों की मांसपेशियों को स्थिर कर रहे हैं, और वे समारोह और फाइबर प्रकार के वितरण के मामले में पैर की मांसपेशियों से अलग. हमारे समूह पहले से दिखा दिया है कि spinotrapezius मांसपेशी में arteriolar ligation अच्छी तरह से विकसित संपार्श्विक arteriolar नेटवर्क, hindlimb 1,8 मॉडल में और्विक धमनी ligation बाद hindpaw में मनाया hypoxia की तुलना के साथ तनाव में कम या नगण्य hypoxia बनाता है - 10. हम यह भी पता चला है कि spinotrapezius ligation मॉडल / Balb ग चूहों में एक अलग remodeling प्रतिक्रिया C57BL / 6 चूहों की तुलना में केशिका और मौजूदा arteriolar 3 कनेक्शन की वृद्धि से C57BL / 6 remodeling collateralization द्वारा Balb ग / चूहों नेटवर्क remodeling के साथ, उत्पादन. इन टिप्पणियों और hindlimb ligation मॉडल में किए गए उन के बीच एक दिलचस्प समानांतर है, जिसमें Balb / ग ligation के बाद चूहों की तुलना में C57BL / 6 9,11,12 चूहों के लिए एक लंबे समय तक छिड़काव वसूली का अनुभव </> समर्थन. ऊतक ischemia, माउस 13 साल की उम्र 14 लिंग और 15 रोग की उपस्थिति के अन्य मॉडलों में भी arteriolar रोड़ा 'ऊतकों की प्रतिक्रियाओं को प्रभावित है, हालांकि हम अभी तक spinotrapezius ligation मॉडल में इन predictors का परीक्षण किया है.
दूसरा, धमनी कि spinotrapezius मॉडल में ligated है के आकार और्विक धमनी की तुलना में काफी छोटा है, और इसलिए, ligation प्रभावों एक छोटे ऊतक मात्रा है कि आगे डाउनस्ट्रीम है, संचार के पेड़ के एक निचले स्तर पर यानी spinotrapezius में, 3 hindlimb की तुलना में. इसलिए, इन दो मॉडलों में ligation के स्थान में संरचनात्मक अंतर जब इस हस्तक्षेप करने के लिए संबंधित शारीरिक प्रतिक्रियाओं (जैसे संवहनी remodeling) की तुलना करने पर विचार किया जाना चाहिए.
तीसरा, spinotrapezius के thinness ऑक्सीजन पड़ोसी से ऊतक के unperfused भाग तक पहुँचने की अनुमति दे सकता हैसंयुक्त और hindlimb मॉडल के रूप में 3 से ऊपर उल्लेख किया ischemia hypoxia की तुलना में, ऊतक. चौथा, ligation के spinotrapezius बहाव के भाग के लिए प्रवाह की वसूली hindlimb ligation की तुलना में तेजी से होता है. spinotrapezius ligation मॉडल एक अद्वितीय पुरानी मॉडल है और क्षणिक धमनी या ischemia reperfusion चोट के रोड़ा मॉडल के अन्य मॉडलों के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए. हम यह करने के लिए इस मॉडल के अनुकूल परिस्थितियों के इन प्रकार समायोजित संभव विचार है, लेकिन यह यहां प्रस्तुत काम के दायरे के बाहर है. अन्त में, हम सीधे मानव में इस्कीमिक रोग के नैदानिक अभिव्यक्तियाँ इस मॉडल में पूर्व नैदानिक टिप्पणियों से संबंधित है, खासकर जब युवा और अन्यथा स्वस्थ चूहों और उच्च दिल की दर के रूप में 5 में निहित शारीरिक सीमा के कारण का उपयोग करने के खिलाफ चेतावनी देते हैं. बहरहाल, हम ligation ऊतक प्रतिक्रियाओं के बुनियादी तंत्र को उजागर करने और क्षमता की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में इस नए मॉडल के संबंध मेंएक में vivo सेटिंग में rapeutic लक्ष्य.
Spinotrapezius फ़ीड धमनी ligation प्रक्रिया (संरचनात्मक नोट (6a), शिरा (9a) से धमनी भेद, और एक संयुक्ताक्षर (11a) का उपयोग) में प्रदान की गई शल्य नोट, एक प्रक्रिया से लाभ के कुछ अन्य पहलुओं के अलावा चर्चा.
सबसे पहले, प्रारंभिक पृष्ठीय वसा पैड सीमा (या कई कंधे ब्लेड लांगुलिय मिमी, अगर transdermal दृश्य संभव नहीं है) पर बनाया चीरा आदर्श के रूप में छोटे रूप किया जाता है के रूप में सर्जन के साथ सहज है, और प्रक्रिया के दौरान अगर जरूरत विस्तार. इस अभ्यास suturing चीरा, जो सर्जन के लिए सुविधाजनक है बंद करने के लिए आवश्यक कम से कम, प्रक्रिया के समय को कम कर देता है, और भी कम वसूली के दौरान पशुओं के लिए परेशान है. वैकल्पिक रूप से, एक बड़ा सा चीरा त्वचा सर्जन वरीयता के अनुसार उपयुक्त हो, के बाद से मांसपेशी आसान करने के लिए एक विस्तारित क्षेत्र के साथ पता लगाने के लिए किया जा सकता हो सकता है. इस मामले में हो सकता है, चीरारीढ़ की ओर तह की अनुमति देने के एक औसत दर्जे का खुला चेहरे के साथ एक घोड़े की नाल के आकार से लाभ. जबकि त्वचा चीरा और माध्यमिक त्वचा की परतों के माध्यम से बढ़ा है, अगर एक सतह पोत क्षतिग्रस्त है और ख़ून का बहाव का कारण बनता है, बाँझ धुंध के साथ प्रकाश दबाव लागू और hemostasis लिए समय प्रदान.
नोट के अलावा, यह महत्वपूर्ण है के लिए न्यूनतम आवश्यक बल के साथ ऊतक को संभालने, और जहाँ भी संभव संदंश के साथ मांसपेशी पार्श्व सीमा के करीब और इरादा इस्कीमिक क्षेत्र से दूर पकड़. इस अभ्यास के लिए क्रश चोट, जो अतिरिक्त सूजन की मध्यस्थता ऊतक प्रतिक्रियाओं है कि नाड़ी remodeling धमनी ligation द्वारा पैदा की प्रतिक्रिया उलझाना सकता करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं से बचने में मदद करता है.
अंत में, हम murine spinotrapezius मांसपेशी की नाड़ी और arteriolar ligation ऊतक प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए एक शल्य मॉडल के रूप में इस्तेमाल का प्रदर्शन किया है. इस मॉडल संवहनी परिवर्तन की intravital मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है (के लिएउदाहरण के लिए, कार्यात्मक) vasodilation, और संवहनी परिवर्तन के पूर्व vivo मूल्यांकन (उदाहरण के लिए, immunofluorescent और संवहनी नेटवर्क के इमेजिंग quantitation) के लिए. दोनों पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययन दिखा दिया है कि एक व्यक्ति की प्रतिक्रिया arteriolar बाधा (या मानव में चूहों atherosclerotic सजीले टुकड़े में ligation के माध्यम से उदाहरण के लिए) के लिए उनकी उम्र पर निर्भर करता है उपस्थिति या रोग के अभाव (जैसे मधुमेह मेलिटस) बाधित धमनी का व्यास , व्यक्तिगत और 11-15 ऊतक के चयापचय मांग की आनुवंशिक मेकअप. Murine मॉडल, यहाँ प्रस्तुत एक के रूप में, तनाव विशेष शारीरिक और आनुवंशिक मतभेद और रोग विशेष phenotypes, जो इन जटिल संबंधों की जांच की सुविधा के शोधकर्ता लाभ.
Disclosures
लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
हम अपनी क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस संगीत का उपयोग करने के लिए संबंधित वीडियो में केविन Macleod, स्वीकार करते हैं (उपस्थिति के क्रम में) अपने पटरियों "हवाई अड्डे के लाउंज," "वॉलपेपर," और "शाम भावों को आगृत करनेवाला नाटक सहित." हम भी उनकी सहायता के लिए सर्जरी वीडियो के साथ Ndubisi Okeke और फ्रेडरिक Torstrick स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iris scissors | FST | 14090-09 | Type: Tool |
| Size 7 forceps | FST | 11271-30 | Type: Tool |
| Size 5 forceps | FST | 11251-20 | Type: Tool |
| Spring scissors | Roboz | RS5671 | Type: Tool |
| Microprobe | FST | 10140-03 | Type: Tool May be substituted with straight probe |
| Needle holder | FST | 12500-12 | Type: Tool |
| Induction chamber | JD Medical Dist. Co., Inc. | IC-1086 | Type: Equipment |
| Eye Gel | Dechra | NDC 17033-211-38 | Type: Reagent |
| Heat pad | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
| Rectal temperature probe | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
| Stimulating electrodes | FHC | UEWSGCSE0N1M | Type: Equipment |
| Artisan's Polymer Clay | Polyform | N/A | Type: Equipment |
| PowerLab data acquisition system | ADInstruments | ML 845 | Type: Equipment |
| Stimulus isolator | ADInstruments | FE 180 | Type: Equipment |
| LabChart | ADInstruments | ML S060/7 | Type: Software |
| Reflected-light fluorescent microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
| High MW fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |
| Video calipers | Colorado Video | 308 | Type: Equipment |
| Automated Vascular Analysis (AVA) | Microvision Medical | Type: Software | |
| Anti-αSMA Conjugated Fluorophore | Sigma | 1A4-Cy3 | Type: Reagent Clonal, 1:100 |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
| High-molecular weight fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |
References
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