Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Murine Spinotrapezius model om de invloed van arteriolaire Ligatie beoordelen op microvasculaire functie en Remodeling

doi: 10.3791/50218 Published: March 3, 2013
* These authors contributed equally

Summary

We demonstreren a novel arteriële ligatie model in muizen spinotrapezius spier, inclusief een stap-voor-stap procedure en beschrijving van de vereiste instrumenten. We beschrijven de operatie en relevante uitkomstmaten met betrekking tot vasculaire netwerk remodeling en functionele vasodilatatie met intravitale en confocale microscopie.

Abstract

De muizen spinotrapezius is een dunne, oppervlakkige skelet ondersteuning spier die zich uitstrekt van T3 tot en met L4, en is gemakkelijk bereikbaar via dorsale incisie in de huid. De unieke anatomie maakt de spinotrapezius nuttig voor het onderzoek van ischemische schade en de daaropvolgende microvasculaire remodellering. Hier tonen we een arterieel ligatie model in de muis spinotrapezius spier die werd ontwikkeld door ons onderzoeksteam en eerder gepubliceerde 1-3. Voor bepaalde kwetsbare muizenstammen, zoals Balb / c muis deze ligatie operatie maakt betrouwbaar skeletspier ischemie en dient als platform voor het onderzoeken van therapieën die revascularisatie stimuleren. Evaluatiemethoden ook aangetoond, inclusief het gebruik van confocale microscopie en intravitale. De spinotrapezius is zeer geschikt om een ​​dergelijke beeldvorming studies door zijn toegankelijkheid (oppervlakkige dorsale anatomie) en de relatieve slankheid (60-200 pm). De spinotrapezius spier kan worden gemonteerd en face, het vergemakkelijken vanbeeldvorming van hele spier microvasculaire netwerken zonder histologische coupes. We beschrijven het gebruik van intravitale microscopie metrics na een functionele vasodilatatie procedure verwerven; bijzonder de toename arterilar diameter als gevolg van spiercontractie. We tonen ook de procedures voor het oogsten en bevestigen van de weefsels, een noodzakelijke voorloper immunokleuring studies en het gebruik van confocale microscopie.

Introduction

Diermodellen van chronische ischemie waardevolle hulpmiddelen voor onderzoek naar de pathofysiologie van ischemische ziekten, zoals perifere vaatziekte, kransslagaderziekte en cerebrovasculaire ziekte. In knaagdieren, zoals de mens, arteriële occlusie leidt tot structurele remodellering van het vasculaire netwerk, inclusief arteriogenese en angiogenese. Bij gezonde en jongere patiënten, kan het remodelleren voldoende zijn om weefsel te redden van ischemie geïnduceerd letsel, maar co-morbiditeit, zoals diabetes kunnen ernstig in gevaar brengen remodeling en herstel. Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan vasculaire remodellering gebeurtenissen is essentieel voor het ontwikkelen van therapieën die deze endogene revascularisatie processen te stimuleren.

Momenteel dijbeenslagader ligatie of resectie in de achterpoot is de standaard techniek voor het bestuderen chronische ischemie geïnduceerde vasculaire remodellering in kleine dieren 4,5. Analyse van de diameter, connectiviteit, en de reactiviteit vande microvaatjes die het vasculaire netwerk stroomafwaarts van de geligeerde femorale slagader is echter moeilijk vanwege de dikte van de spieren. We hebben een arterieel ligatie model in de muis spinotrapezius muscle: eenzijdige ligatie van de zijdelingse invoer slagader in deze stabiliserende rugspier 1. De relatief dunne spinotrapezius (60-200 micrometer) vatbaar is voor en face immunokleuring voor de beoordeling van hele netwerk topologie met single-cell resolutie, waardoor een gedetailleerd onderzoek van vasculaire remodellering evenementen in de hele weefsel. De spinotrapezius is oppervlakkig en toegankelijk, en daarmee de schepen gemakkelijker door intravitale microscopie efficiënte karakterisering van het effect van remodeling en arteriolaire ligatie op vasculaire reactiviteit.

In dit rapport beschrijven we in detail en demonstreren de muis spinotrapezius arteriolaire ligatie model. Zowel in vivo en ex vivo methods beoordeling na een operatie worden beschreven, waaronder meting van functionele vasodilatatie, waarvan is aangetoond worden verminderd onder ischemische condities 6 en immunofluorescente beeldvorming van gehele spier microvasculaire netwerk. We ook resultaten van twee afzonderlijke proefstudies om het nut van het model te tonen. Eerst hebben we gebruik gemaakt van de arteriële ligatie model een statistisch significante toename in vat tortuositeit in C57BL / 6 muizen (Figuur 2B) induceren. Tortuositeit stijgt tijdens arteriogenese in arteriole collateralen. In andere muizenstammen die kwetsbaarder zijn ischemie door het ontbreken van zekerheid arteriolen (bijvoorbeeld Balb / c) is waargenomen capillaire arterialization 10. Capillaire arterialization wordt door verhoogde diameters en de ontwikkeling van α-gladdespieractine reactiviteit. Tweede functionele elektrische stimulatie van de spier tot vasodilatatie in arteriolen van de terminal spinotrapezius (Figuur 3B).

Protocol

1. Spinotrapezius Feed Artery Ligatie Chirurgie

  1. Verdoof de muis door intraperitoneale injectie. In een 0,5 ml injectiespuit formuleren: 0,06 ml van 100 mg / ml ketamine
    0,03 ml van 20,0 mg / ml xylazine
    0,01 ml van 0,4 mg / ml Atropine
    0,30 ml 0,9% zoutoplossing.
    Dosis: 0,01 ml * per gram lichaamsgewicht, ip

* Dosis variabele op muizenstam en voorraad, dienovereenkomstig aan te passen, zodat de muis herstel is binnen een uur van inductie.

  1. Breng standaard oogzalf om het hoornvlies uitdroging te voorkomen.
  2. Verwijder haar van de rug met behulp van knippen klippers, gevolgd door korte toepassing van ontharingscrème.
  3. Desinfecteer het chirurgische veld met chloorhexidine of povidon-jodium. Alternatieve povidonjood met ethanol drie keer, eindigend met povidonjood.
  4. Breng de muis om de eerder bereide chirurgische werkblad, met verwarming pad en steriel lakenop zijn plaats.
  5. Maak een lineaire incisie (3-5 mm) door de dorsale huid ongeveer 5 mm caudaal van de benige prominentie van het schouderblad met iris schaar en standaard patroon pincet (bijvoorbeeld FST, 11271-30) door tenting het weefsel en het snijden parallel aan de wervelkolom. Het doel incisie site kan worden geïdentificeerd door transdermale visualisatie van de dorsale vetkussentje als pigmentatie van de huid toelaat; gesneden op de caudale rand van het vet pad. Vouw de incisie als nodig is, en uit te breiden door middel van secundaire huidlagen met behulp van de lente schaar.
    1. Anatomische kennis - De spinotrapezius spier ligt dorsaal en strekt zich uit van T4 naar L3 langs weerszijden van de wervelkolom. De voorste rand strekt zich zijdelings tot ongeveer het schouderblad. De spier versmalt in de caudale richting zodat de dorsale rand mediaal ligt aan de voorste rand en kan liggen gelijk met de wervelkolom. Twee dikke pads zijn ook belangrijk om op te merken, het leggen direct dorsaal en ventraal van de spinotrapeziusspieren naar de craniale half.
    2. Ontsteking door de incisie is aangetoond geen effect op de vasculaire remodellering reactie als sham operatie ligatie toonde geen verandering in hermodellering van het spinotrapezius vasculatuur. Twee ruimtelijke factoren dragen bij tot dit resultaat. Eerst wordt de incisie wordt verwijderd door 5 mm in de craniale richting van het gebied waar de vasculaire respons in de spier kenmerkend onderzocht. Bovendien wordt de incisie op de dorsale huid gescheiden van het vaartuig ligatieplaats door een ventrale vetkussentje dat ligt bovenop de craniale derde van de spinotrapezius spier.
  6. Spoel de incisie met de oplossing verwarmd Ringer's om spieren uitdroging te voorkomen. Toepassing van vasodilatoren zoals papaverine zal helpen bij het visualiseren van de beoogde slagader voor ligatie.
  7. Onder een dissectiemicroscoop een tang om bot te ontleden en te scheiden (maar niet verwijderen) de dorsale witte vet pad van de onderliggende muscheid weefsel om de vasculatuur visualiseren als het binnenkomt en verlaat de spinotrapezius op de zijkant.
  8. Zoek de beoogde slagader, die samen met een of twee gepaarde aderen, passeert het vetkussentje die ventraal van de spinotrapezius op weg in de zijrand van de spier. Deze slagader voedt een aanzienlijk deel van de caudale helft van de spier, die kan worden bevestigd door het afwegen en het vervangen van de spieren om het pad van de slagader nemen in de spier. De doellocatie voor ligatie het deel van de slagader die uit de ventrale vetkussentje en die in de spieren, en is vrij toegankelijk in deze regio. De slagader-ader pair moeten voorzichtig worden gescheiden van de ventrale vetkussentje in deze regio. Merk op dat de spinotrapezius wordt gevoed door meerdere slagader-ader paren, met inbegrip van schepen die dwars ofwel de dorsale en ventrale vetkussentjes. Zorg ervoor dat u deze schepen verstoren.
    1. Meerdere indicatoren kunnen worden gebruikt om onderscheid slagadervan ader. Een van de beste methoden is om voorzichtig bloedstroom belemmeren de microprobe en weg stroomopwaarts bewegen van de spier; stroom wordt niet hervat in de slagader totdat de obstructie wordt losgelaten. Kleur kan ook worden gebruikt als vaatwanden bevatten witte omhulsel van bindweefsel dat slagaders missen. Verder kan men overwegen de diameter vóór de toepassing van vasodilator als aderen doorgaans groter.
  9. De slagader is typisch dicht bij de gekoppelde ader; stompe dissectie met een microprobe en # 5 forceps om een ​​ongeveer 5 mm segment isoleren, door het passeren van de microprobe achter de slagader en met de punt naar een grotere afstand in de natuurlijke make kloof tussen de slagader en ader. Dit is de opening waardoor de hechting wordt geregen.
  10. Met 10-0 enkeldraadse hechtdraad en naaldhouder plaats een ligatie in de voeding slagader (~ 70 urn diameter) naar het proximale uiteinde van het segment ontleed met een chirurg knoop. Place extra ligatie naar het distale uiteinde van de slagader ontleed segment voldoende scheiding tussen ligaturen zorgen voor doorsnijden van de slagader.
    1. De kleinschalige geassocieerd met de voeding spinotrapezius slagader leidt tot verhoogde chirurgische moeilijkheden tegen ligatie van een groter vat zoals de femorale arterie. Onervaren chirurgen in het bijzonder zullen hoge tarieven van avulsie, onbedoelde bloedingen en andere chirurgische complicaties. Van bijzonder belang is de moeilijkheid om en snij de kleurloze slagader na doorstroming is belemmerd net voor het snijden. Om deze redenen is het plaatsen van 2 ligaturen aangeraden voor gewend aan de procedure, omdat de chirurg een visuele in plaatsbepaling waarbij de slagader en een bevestiging van de snede met de gemakkelijk waarneembare scheiding van de 2 ligaturen doorsnijden. Echter kan een ervaren chirurg vindt een ligatuur voldoende, mits zij kunnen duidelijkidentificeren en snijd de slagader stroomafwaarts van de ligatuur. Hoewel deze techniek vermindert het risico van onopzettelijk een nabijgelegen knikken vaartuig met de scherpe ligatie hechting is niet zonder nadelen, zoals verhoogde moeilijkheid bevestiging van de arterie werd doorsneden.
  11. Controleer ligatie door het observeren vermindering van bloedstroom (verhinderd RBC kolom) stroomafwaarts van de ligatieplaats (dwz in de spier).
  12. Schaar doorsnijden met de geligeerde slagader tussen de ligaturen. Als er slechts een ligatuur werd geplaatst (11a), gesneden met uiterste zorg in stroomafwaartse richting.
  13. Geneesmiddel beladen plain-film (1 mm) kan worden geplaatst stroomafwaarts (caudaal) als onderdeel van experimentele procedure.
  14. Plaats de ontheemden fascia en vetweefsel naar hun oorspronkelijke stand.
  15. Sluit de huid incisie met behulp van 8-0 niet-resorbeerbare hechtingen. Plaats dan de muis in een voorbereide verwarmde herstel kooi onder observatie en het toedienen van een appropriate analgeticum zoals bupivacaïne, 0,02-0.05 ml 0,25% lokale infiltratie.

2. Spinotrapezius intravitale Microscopy, in situ

  1. Verdoven de muis in een inductiekamer met 3-4% isofluraan verdampt in 100% zuurstof met een debiet van 3-4 L · min -1.
    1. Het gebruik van inhalatie anesthesie voorkeur functionele metingen omdat er minder cardiovasculaire depressie dan met injecteerbare anesthetica. Als inhalatie verdoving niet beschikbaar, langwerkende injecteerbare anesthetica, zoals natriumpentobarbital de voorkeur aan herhaalde injecties voorkomen wanneer het dier is gepositioneerd.
  2. Eenmaal verdoofd, voortdurend isofluraan te leveren door middel van een verdoving masker (aka neuskegel) bij het ​​onderhoud concentraties (meestal ~ 2%) en het debiet van 0,5-1 L · min -1.
    1. Muizen voornamelijk ventileren door middel van hun neus, dus het is alleen negessary om hun neus te bedekken met de narcose masker middenrif.
  3. Verwijder indien nodig haar van de rug met behulp van knippen clippers en ontharingscrème.
  4. Vervoer het dier om de warmte pad.
    1. Het is belangrijk om muizen in een euthermic toestand te houden om koude-geïnduceerde vasoconstrictie voorkomen, dit kan worden bereikt door lichten, water hete lucht pads, magnetron verwarmt pads, etc.
  5. Steek de rectale temperatuur probe en stel thermo-controller tot 35 ° C.
  6. Maak een incisie in de huid aan het caudale einde van de spinotrapezius met iris schaar en standaard patroon tang.
  7. Craniaal Verleng de incisie om het vet pad, het creëren van een hoefijzer incisie, en bedek de huid flap met plastic omslag om uitdroging te voorkomen.
  8. Blunt ontleden het onderhuids bindweefsel met een pincet en de lente schaar om de zichtbaarheid te maximaliseren.
  9. Plaats stimulerende elektroden zo dicht Together mogelijk de grootte van het huidige veld te minimaliseren en plaats ze op het caudale einde van het blootgestelde spier juist lateraal aan de wervelkolom.
  10. Voer een test stimulatie om plaatsing van de elektroden te bevestigen met behulp van een elektrode data-acquisitiesysteem, elektrode stimulus isolator, en computer controller, met vierkante golven van een 200 psec duur, 2 mA amplitude, geleverd met 1 Hz.
  11. Plaats plastic folie over de blootliggende spieren om uitdroging te voorkomen.
  12. De tijdsduur van een 30 min periode waarin het vaartuig diameters zal evenwicht.
  13. Plaats de intravitale microscoop over de spinotrapezius spier aan de vasculaire architectuur te bekijken.
    1. Als u een immersie lens, plaats een druppel PBS tussen de doelstelling en de plastic verpakking.
  14. Starten van boven de belangrijkste arteriole (het grootste schip zichtbaar), manipuleren van de fase in het XY-vlak naar het schip van belang vinden.
    1. Visualiseren kleine arterioles met gereflecteerd licht microscopie vereist meer contrast dan door de rode cel kolom. We gebruiken primair een zijstroom dark-field imaging microscoop microvasculaire contrast, maar ook het contrast kan worden verbeterd met een gereflecteerd-licht fluorescentiemicroscoop na de intraveneuze injectie van een hoog molecuulgewicht fluorescent dextran.
  15. Na de 30-min evenwicht, het nemen van een foto / video van het schip van belang.
  16. Stimuleren spier met blokgolven van 200 psec duur 2 mA amplitude leveren op 8 Hz, gedurende 90 sec, zoals hierboven beschreven.
  17. Leg een ander beeld / video direct na stimulatie en blijven elke minuut vast te leggen tot het schip is teruggekeerd naar de rustdiameter, ~ 10 minuten.
  18. Herhaal stap 6-18 via de contralaterale spier.
  19. Data analyse kan worden uitgevoerd in real time video beugels of off-line met beeldanalyse software.
  20. Euthanaseren de muis te volgening IACUC protocol.

3. Spinotrapezius Tissue Oogst en fixatie

  1. Verdoven muizen door intraperitoneale injectie; samenstelling als in Spinotrapezius Feed Artery Ligatie stap 1.
  2. Maak een insnijding enkele millimeters craniaal van de benige prominentie van de schouder van de muis mes met iris schaar en standaard patroon tang. Vouw de incisie lateraal en caudaal aan beide zijden.
  3. Laat de huid van dorsale romp door voorzichtig als gevolg van de huid en het snijden van de oppervlakkige fascia.
  4. Stompe dissectie tot dorsale vetweefsel met standaard forceps verwijderen en vervolgens de spier geven en eveneens ontleden ventrale vetweefsel.
  5. Verwijder fascia bovenliggende de spier met behulp van een tang en de lente schaar. Deze stap kan moeilijk en tijdrovend zijn, maar is belangrijk voor het verbeteren immunofluorescentie kleuring en beeldvorming. Het houden van het weefsel gehydrateerd kunnen verlichten verwijdering van de fascia.
  6. Plaatsende laterale rand van de spier en stompe dissectie tot de spinotrapezius spier scheiden van het vet pad dat ligt ventrale aan.
  7. Ga verder met de stompe dissectie in een craniaal naar caudaal. Merk op dat een aantal bloedvaten in en uit dit ventrale oppervlak van de spier, als perfusie nodig is, dient te worden uitgevoerd voordat doorsnijden deze schepen. Merk ook op dat in de caudale helft van de spier, de laterale rand inserts in de spier liggende ventrale aan. Sommige snijden kan nodig zijn langs deze grens om volledig te definiëren en te bevrijden van de rand.
  8. Accijnzen de spinotrapezius spier. Om dit te doen:
    1. Vrije de zijrand van de spier zoals hierboven beschreven.
    2. Snijd dwars over de meeste craniale de spier mate.
    3. Snijd langs de mediale rand (langs de ruggengraat), in het sagittale vlak.
  9. Herhaal de procedure stappen 4-9 op de contralaterale spier, en dan euthanaseren de mouse door een IACUC goedgekeurde methode.
  10. Bevestig de weefsels op met gelatine beklede objectglaasjes door onderdompeling in gekoelde methanol (4 ° C) of in een 4% paraformaldehyde / gedeïoniseerd water oplossing bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
    1. Alternatief kan perfusiefixatie worden. Voorafgaand aan stap 2, doet een thoracotomie een insnijding in het rechter atrium en perfuseren vasculatuur met 5 ml 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1 mM CaCl2 en 2% heparine via de linker ventrikel, gevolgd door 5 ml van 4 % paraformaldehyde voor schip fixatie en tenslotte 5 ml van 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1 mM CaCl2 7.
  11. Onmiddellijk na fixatie, wassen specimen vier keer 20 min elk met 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% saponine.

Representative Results

Een chirurgische gezien de hoofdader voeden van de spinotrapezius spier die ligatie ondergaat wordt getoond in figuur 1, met een etiket interessegebieden. Een voorbeeld confocaal beeld van het geoogst en immunogekleurd regio spier direct stroomafwaarts van de arterie geligeerd een week na ligatie gelegen is weergegeven in figuur 2A. Vergrote zekerheid arteriolen die gladde spier alfa-actine expressie gladde spiercellen (rood) beeldkarakteristiek tortuositeit na ligatie. Tortuositeit vaartuig, weergegeven als de verhouding tussen vaartuig weglengte en koord afstand (de lijn die over hetzelfde vat pad eindpunten), in de geligeerde spier (rechts) ten opzichte van geligeerde contralaterale spier verbeterd (Figuur 2B, n = 8) . Figuur 3 toont de resultaten van een studie waarbij terminal arteriole functionele vasodilatatie werd gemeten met intravitale microscopie. Zoals verwacht, arteriolaire di ameter verhoogt na elektrische stimulatie geïnduceerde spiercontracties.

Figuur 1
Figuur 1. Chirurgische veld van gereflecteerde spinotrapezius spier en diervoeders slagader. Het voer slagader wordt geligeerd op de twee plaatsen aangegeven A0. Tussen deze ligaturen en na belemmering van bloedstroom, wordt de slagader doorsneden ter plaatse aangegeven met A. De gerichte deel van de slagader overgangen van de ventrale vetkussentje, beschreven door C, in het spinotrapezius spier, beschreven door D, op de plaats aangegeven met pijl B. De stromingsrichting is aangeduid door gestippelde pijl E.

ghres.jpg "/>
Figuur 2. Confocale beeld van spinotrapezius spier microvasculaire netwerk voor pilot-studie van tortuositeit. (A) Geoogst en hele gemonteerde spier werd immunogekleurd voor gladde spier alfa-actine en belichte met behulp van confocale microscopie. Het gezichtsveld toont het gebied van spier direct achter de geligeerde arteriole 1 week na ligatie gelegen. Kronkelige vaten zijn duidelijk in de spier als gevolg van de ligatie (B) Pilot study resultaten tonen significant verhoogd (p = 0,035; een eenzijdige Student's t-test). Tortuositeit vertoond door microvaatjes in de geligeerde spier gemeten door vaartuig padlengte koord afstand verhouding voor een proef van C57BL / 6 muizen (n = 8) ten opzichte van contralaterale controle.

Figuur 3
Figuopnieuw 3. Intravitale microscopie van functionele vasodilatatie in spinotrapezius arteriolen in vivo. (A) Vertegenwoordiger microfoto van spinotrapezius terminal arteriolen in rust (links) en onmiddellijk na beëindiging van 8 Hz spiercontractie (rechts). (B) Terminal arteriole diameter in rust ( 8,5 ± 0,5 urn, links) en direct daarna (11 ± 1 pm, midden) 90 sec spiercontractiemechanismen, aanmerkelijk gestegen arteriolaire diameter (p = 0,032, 1-tailed gepaarde t-test) in Balb / C muizen (n = 6). Procentuele verandering aangegeven (rechts).

Discussion

De muis spinotrapezius ligatie hier gepresenteerde model is een effectieve klein diermodel om de functionele en structurele aanpassingen die het gevolg zijn bestuderen vanuit een arteriële occlusie. Dit model is een aanvulling op de veel gebruikte achterbeen ischemie model 4, in dat het een hele spier uitzicht intact microvasculaire netwerken met een hoge ruimtelijke resolutie. Bovendien, omdat deze spier bevindt zich net onder de dorsale huid, het is toegankelijk voor seriële beeldvorming met intravitale microscopie, en aan de lokale drug delivery via superfusie of dunne film implantatie 2. Deze eigenschappen maken het een aantrekkelijk klein diermodel om de effecten van nieuwe therapeutische targets op vasculaire remodellering en functionele vasodilatatie na arteriële occlusie bestuderen.

Merk op dat voorzichtigheid moet worden gebruikt bij het vergelijken van gegevens verkregen in de spinotrapezius ligatie model gegevens verkregen in het achterbeen ligatie model te wijten aan een aantal belangrijke derschillen. Ten eerste worden de spinotrapezius spieren stabiliserende spieren, en ze verschillen van de beenspieren in termen van functie en type vezel distributie. Onze groep eerder aangetoond dat het arteriolaire ligatie in de spinotrapezius spier minder of verwaarloosbare hypoxie in stammen met goed ontwikkelde zekerheid arteriolaire netwerken ten opzichte van de hypoxie waargenomen in de achterpoot na de dijslagader ligatie in de achterpoot model 1,8 creëert - 10. We hebben ook aangetoond dat de ligatie model spinotrapezius een andere remodeling respons in Balb / c muizen in vergelijking met C57BL / 6 muizen met Balb / c muizen netwerken remodeling door capillaire collateralization en C57BL / 6 remodeling door vergroting van bestaande verbindingen arteriolaire 3 levert. Er is een interessante parallel tussen deze observaties en de gegevens op achterbeen ligatie modellen, waarin Balb / c muizen ervaren een langdurige perfusie herstel na ligatie in vergelijking met C57BL / 6 muizen 9,11,12 </ Sup>. In andere modellen van weefsel ischemie, muis 13 jaar geslacht 14 en de aanwezigheid van de ziekte 15 ook invloed hebben op de weefsels 'reacties op arteriolaire occlusie, hoewel we nog niet getest deze voorspellers in de spinotrapezius ligatie model.

Anderzijds de grootte van de slagader die wordt geligeerd in de spinotrapezius model is aanzienlijk kleiner dan de femorale slagader, en dus de invloed ligatie een kleiner volume weefsel die verder downstream, dus op een lager niveau van de bloedsomloop boom in de spinotrapezius opzichte van de achterpoot 3. Daarom moet de anatomische verschil in de locatie van de ligatie van deze twee modellen worden beschouwd als vergelijking van de respectieve fysiologische reacties (bv. vasculaire remodellering) deze interventie.

Ten derde kan de dikte van de spinotrapezius mogelijk zuurstof naar de unperfused gedeelte van het weefsel te bereiken van naburigeweefsel, vergeleken met de gecombineerde ischemie en hypoxie in de achterpoot model zoals hierboven 3. Vierde, het herstel van stroom naar het deel van de spinotrapezius stroomafwaarts van de ligatie is sneller dan in de achterpoot ligatie. De spinotrapezius ligatie model is een uniek chronische model en moet niet verward worden met andere modellen van voorbijgaande arteriële occlusie of modellen van ischemie-reperfusie schade. Wij het mogelijk dit model aan dit soort voorwaarden passen, maar dit valt buiten het toepassingsgebied van werk hier voorgesteld zijn. Tenslotte we waarschuwen rechtstreeks verband pre-klinisch onderzoek in dit model klinische verschijnselen van ischemische ziekte in mensen, vooral bij gebruik van jonge en overigens gezonde muizen en vanwege de inherente fysiologische grenzen zoals hogere hartslag 5. Toch beschouwen wij dit nieuwe model als een waardevol instrument voor het blootleggen van de basismechanismen van weefsel reacties op ligatie en het identificeren van de mogelijkheden van derapeutic targets in een in vivo omgeving.

Naast de chirurgische aantekeningen in de voeding spinotrapezius slagader ligatie procedure (anatomische noot (6a), onderscheiden van de slagader ader (9a) en het gebruik van een ligatuur (11a)), nog andere aspecten van de procedure voordeel discussie.

Eerst wordt de eerste incisie gemaakt over de dorsale vetkussentje rand (of meerdere mm caudaal van het schouderblad als transdermale visualisatie niet mogelijk is) idealiter zo klein als de chirurg voelt, en uitgebreid in de procedure indien nodig. Deze praktijk minimaliseert het hechten moeten de incisie, die handig voor de chirurg sluiten vermindert procedure tijd en ook minder irriterend aan het dier tijdens herstel. Alternatief kan een grotere incisie nodig zijn volgens voorkeur van de chirurg omdat de spier kunnen gemakkelijker te vinden met een geëxpandeerde veld. In dit geval kan de insnijdingprofiteren van een hoefijzer vorm met een mediale open gezicht te laten vouwen naar de wervelkolom. Tijdens het maken van de huid incisie en die zich uitstrekt door de secundaire huidlagen, als een oppervlakte-beschadigd en veroorzaakt bloedingen, oefen lichte druk met een steriel gaasje en bieden tijd voor hemostase.

Ook van belang is het belangrijk om het weefsel te behandelen met de minimum vereiste kracht, en waar mogelijk houden met forceps dichter bij de spier laterale rand en de beoogde afstand van ischemische zone. Deze praktijk kan worden voorkomen crush, wat kan leiden tot extra-gemedieerde inflammatoire weefselreacties dat de vasculaire remodellering respons opgewekt door de arteriële ligatie kunnen beïnvloeden.

Concluderend hebben we aangetoond dat het gebruik van de murine spinotrapezius spier als model voor de behandeling van chirurgische vasculaire en weefsel reacties op arteriolaire ligatie. Dit model is geschikt voor intravitale beoordeling van vasculaire wijzigingen (Zo functionele vasodilatatie) en voor ex vivo bepaling van vasculaire veranderingen (bijvoorbeeld immunofluorescente imaging en kwantificatie van vasculaire netwerken). Zowel preklinische en klinische studies hebben aangetoond dat een individu reactie arteriolaire obstructie (zoals via ligatie in muizen of atherosclerotische plaques bij mensen) hangt af van hun leeftijd de aanwezigheid of afwezigheid van ziekte (bijvoorbeeld diabetes mellitus) de diameter van de verstopte slagader de genetische samenstelling van het individu en de metabolische vraag van het weefsel 11-15. Murine modellen, zoals de hier gepresenteerde, gebruik maken van de onderzoeker van stam-specifieke anatomische en genetische verschillen en ziekte-specifieke fenotypes, die onderzoek faciliteert in deze complexe relaties.

Disclosures

De auteurs verklaren zij hebben geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij erkennen Kevin Macleod voor het gebruik van zijn creatieve commons licentie muziek in de bijbehorende video, met inbegrip van (in volgorde van verschijning) zijn tracks "Airport Lounge", "Achtergrond" en "Evening Melodrama." We willen ook graag Ndubisi Okeke en Frederick Torstrick erkennen voor hun hulp bij de operatie video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iris scissors FST 14090-09 Type: Tool
Size 7 forceps FST 11271-30 Type: Tool
Size 5 forceps FST 11251-20 Type: Tool
Spring scissors Roboz RS5671 Type: Tool
Microprobe FST 10140-03 Type: Tool
May be substituted with straight probe
Needle holder FST 12500-12 Type: Tool
Induction chamber JD Medical Dist. Co., Inc. IC-1086 Type: Equipment
Eye Gel Dechra NDC 17033-211-38 Type: Reagent
Heat pad FST 21060-01 Type: Equipment
Rectal temperature probe FST 21060-01 Type: Equipment
Stimulating electrodes FHC UEWSGCSE0N1M Type: Equipment
Artisan's Polymer Clay Polyform N/A Type: Equipment
PowerLab data acquisition system ADInstruments ML 845 Type: Equipment
Stimulus isolator ADInstruments FE 180 Type: Equipment
LabChart ADInstruments ML S060/7 Type: Software
Reflected-light fluorescent microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High MW fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent
Video calipers Colorado Video 308 Type: Equipment
Automated Vascular Analysis (AVA) Microvision Medical Type: Software
Anti-αSMA Conjugated Fluorophore Sigma 1A4-Cy3 Type: Reagent
Clonal, 1:100
Fluorescent Microscope Olympus BFXM Type: Equipment
High-molecular weight fluorescent dextran Sigma FD250S-100MG Type: Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bailey, A. M., O'Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation. Microcirculation. 15, 389-404 (2010).
  2. Bruce, A. C., Peirce, S. M. Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model. Microcirculation. 19, 143-154 (2012).
  3. Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 17, 333-347 (2010).
  4. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (23), e1035 (2009).
  5. Madeddu, P., et al. Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems. Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).
  6. Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front. Physio. 2, 91 (2011).
  7. Sefcik, L. S., et al. Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth. Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).
  8. Deindl, E., et al. Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit. Circulation Research. 89, 779-786 (2001).
  9. Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain. Circulation Research. 105, 89-98 (2009).
  10. Scholz, D., et al. Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).
  11. McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
  12. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
  13. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).
  14. Peng, X., et al. Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).
  15. Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice. Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).
Murine Spinotrapezius model om de invloed van arteriolaire Ligatie beoordelen op microvasculaire functie en Remodeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).More

Guendel, A. M., Martin, K. S., Cutts, J., Foley, P. L., Bailey, A. M., Mac Gabhann, F., Cardinal, T. R., Peirce, S. M. Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling. J. Vis. Exp. (73), e50218, doi:10.3791/50218 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter