Summary
Vi viser en roman arteriell ligation modell i murine spinotrapezius muskel, inkludert en steg-for-steg prosedyre og beskrivelse av ønsket instrumentering. Vi beskriver kirurgi og relevante utfallet målinger knyttet til vaskulær nettverk ombygging og funksjonelle vasodilatasjon med intravital og konfokalmikroskopi.
Abstract
Murine spinotrapezius er en tynn, overfladisk skjelettlidelser støtte muskel som strekker seg fra T3 til L4, og er lett tilgjengelig via dorsal huden innsnitt. Dens unike anatomi gjør spinotrapezius nyttige for undersøkelse av iskemisk skade og påfølgende mikrovaskulær remodeling. Her viser vi en arteriolar ligation modell i murine spinotrapezius muskel som ble utviklet av vår forskning team og tidligere publisert 1-3. For visse sårbare musestammer, som Balb / c mus, skaper denne ligation kirurgi pålitelig skjelettmuskulatur iskemi og tjener som en plattform for å undersøke terapier som stimulerer revaskularisering. Metoder for vurdering er også vist, inkludert bruk av intravital og konfokalmikroskopi. Den spinotrapezius er godt egnet til slike imaging studier på grunn av sin tilgjengelighet (overflatisk dorsal anatomi) og relativ tynnhet (60-200 um). Den spinotrapezius muskel kan monteres en face, tilretteleggingavbildning av hel-muskel mikrovaskulære nettverk uten histologisk snitting. Vi beskriver bruken av intravital mikroskop for å skaffe beregninger etter en funksjonell vasodilatasjon prosedyre, spesielt økningen i arterilar diameter som følge av muskel sammentrekning. Vi viser også prosedyrene for høsting og fikse vev, en nødvendig forløper til farging studier og bruk av konfokal mikroskopi.
Introduction
Dyremodeller av kronisk iskemi er verdifulle verktøy for å undersøke patofysiologien av iskemiske sykdommer, for eksempel perifer karsykdom, koronarsykdom, og cerebrovaskulær sykdom. I gnagere, som hos mennesker, fører arteriell okklusjon til strukturell ombygging av vaskulære nettverket, herunder arteriogenesis og angiogenese. Hos friske og yngre pasienter, kan dette remodeling være tilstrekkelig til å redde vev fra iskemi-indusert skade, men komorbiditet som diabetes kan alvorlig kompromittere ombygging og utvinning. Forstå mekanismene bak vaskulær remodellering hendelser er avgjørende for utvikling av terapi som stimulerer disse endogene revaskulariserings prosesser.
Foreløpig er lårarterie ligation eller reseksjon i hindlimb standard teknikk for å studere kronisk iskemi-indusert vaskulær remodellering i små dyr 4,5. Analyse av diameter, tilkoblingsmuligheter, og reaktivitet avde microvessels som utgjør det vaskulære nettverket nedstrøms ligert lårarterie er imidlertid vanskelig, på grunn av tykkelsen av musklene. Vi har utviklet en arteriolar ligation modell i mus spinotrapezius muskler: ensidig ligation av lateral fôr arterien i denne stabiliserende dorsal muskler en. De relativt tynne spinotrapezius (60-200 mikrometer) er mottagelig for en face farging for vurdering av hele nettverkstopologi med encellede oppløsning, slik at en detaljert undersøkelse av vaskulær remodellering hendelser i hele vev. Den spinotrapezius er også overfladisk og tilgjengelig, og dermed dets skip er lett observerbar av intravital mikroskopi, for effektiv karakterisering av virkningen av ombygging og arteriolar ligation på vaskulær reaktivitet.
I denne rapporten beskriver vi i detalj og demonstrere musen spinotrapezius arteriolar ligation modell. Både in vivo og ex vivo megdikk vurderingsform etter kirurgi er beskrevet, inkludert måling av funksjonell vasodilatasjon, som har vist seg å være svekket i henhold iskemiske betingelser 6 og immunofluorescerende avbildning av hel-muskel mikrovaskulære nettverk. Inkluderer vi også resultatene av to separate pilotstudier å demonstrere nytten av modellen. Først utnyttet vi den arterielle ligation modell for å indusere en statistisk signifikant økning i fartøyets tortuosity i C57BL / 6 mus (figur 2B). Tortuosity øker under arteriogenesis i arteriole collaterals. I andre musestammer, som er mer utsatt for ischemi på grunn av fravær av sikkerhetsverdier arterioler (f.eks Balb / c), er kapillar arterialization observert 10. Kapillær arterialization blir oppdaget av økt diameter og utvikling av α-glatt muskulatur aktin reaktivitet. Sekund, fører funksjonell elektrisk stimulering av muskelen til vasodilatasjon i terminal arterioler av spinotrapezioss (Figur 3B).
Protocol
1. Spinotrapezius feed Artery ligation kirurgi
- Anesthetize musen ved intraperitoneal injeksjon. I en 0,5 ml sprøyte, formulere: 0,06 ml av 100 mg / ml Ketamine
0,03 ml 20,0 mg / ml xylazin
0,01 ml av 0,4 mg / ml Atropin
0,30 ml av 0,9% saltvann.
Dose: 0,01 ml * per gram kroppsvekt, ip
* Dose variabel på mus belastning og lager, justere tilsvarende så mus utvinning er innen en time fra induksjon.
- Bruk standard ophthalmic sårsalve for å hindre hornhinnen uttørking.
- Fjerne hår fra baksiden bruker trimming clippers, etterfulgt av kortfattet søknad av Hårfjerningskrem.
- Desinfisere kirurgiske feltet med klorheksidin eller povidon-jod. Alternativ povidon-jod med etanol tre ganger, og endte med povidon-jod.
- Overfør musen til tidligere utarbeidet kirurgisk arbeidsflate, med oppvarming pad og sterilt draperepå plass.
- Lag en lineær snitt (3-5 mm) gjennom dorsal huden ca 5 mm Caudal til den benete prominence av skulderblad med iris saks og standard mønster tang (f.eks FST, 11271-30) ved telting vevet og kutte parallelt med ryggraden. Målet innsnitt området kan identifiseres ved transdermal visualisering av dorsal fettpute hvis huden pigmentering tillatelser; kuttes på kaudal grensen av fettpute. Utvid snittet som trengs, og strekker seg gjennom videregående hudlagene med våren saks.
- Anatomisk notat - spinotrapezius muskel ligger dorsalt og strekker seg fra T4 til L3 langs hver side av ryggraden. Den fremre grensen strekker lateralt til omtrent skulderblad. Muskelen smalner i caudal retning slik at den mest posterior grensen ligger mediale til fremre kant, og kan lå i flukt med ryggraden. To fett pads er også viktig å merke seg, legging direkte dorsal og ventral til spinotrapeziusmuskel mot skallen halvparten.
- Betennelse grunnet innsnitt har vist seg å ha noen effekt på den vaskulære remodeling svaret, som simulert ligation operasjonen viste ingen endring i ombygging av spinotrapezius vaskulatur. To romlige faktorer bidrar til dette resultatet. Først innsnitt er fjernet ved 5 mm i den kraniale retning fra regionen av interesse der den vaskulære respons i muskel er typisk undersøkt. Tillegg er innsnitt området på dorsal hud separert fra fartøyet ligation området ved en ventral fettpute som ligger på toppen av den kraniale tredjedel av spinotrapezius muskel.
- Vanne snittet med warmed Ringer løsning for å forebygge muskel uttørking. Anvendelsen av vasodilatorer som papaverin vil bistå i å visualisere målet arterien for ligation.
- Under en disseksjonsmikroskop Bruk pinsett til å dempe dissekere og skille (men ikke fjern) dorsal hvite fett pad fra den underliggende muscular vev for å visualisere blodkar som går inn og forlater spinotrapezius på sin sidekant.
- Lokalisere målet arterien, som sammen med en eller to sammenkoblede årer, passerer gjennom fettet puten som er ventrale til spinotrapezius på vei inn til den laterale kant av muskelen. Denne arterien mater en vesentlig del av den kaudale halvdelen av muskelen, som kan bekreftes ved å reflektere og bytte muskelen å observere banen av arterien i muskelen. Målplasseringen for ligation er den delen av arterien ut av ventrale fett puten og skrive muskelen, og er ganske tilgjengelig i denne regionen. Lunge-vene paret kan måtte forsiktig separert fra den ventrale fettpute i denne regionen. Vær oppmerksom på at spinotrapezius er lei av flere arterie-vene par, inkludert fartøy som tverrgående enten dorsal og ventral fett pads. Pass på å ikke forstyrre disse fartøyene.
- Flere indikatorer kan brukes til å skille arteriefra vein. En av de beste metodene er å forsiktig hindre blodstrømmen med mikrosonde og flytte oppstrøms bort fra muskel; flyt vil ikke gjenopptas i arterien til hindringen er utgitt. Farge kan også brukes, som vein vegger inneholder en hvitaktig slire av bindevev som arteriene mangler. Videre, kan man vurdere diameteren før anvendelse av vasodilator som årer er vanligvis større i størrelse.
- Arterien er typisk i nærhet til sin sammenkoblede vene, bruke sløv disseksjon med mikrosonde og # 5 tang å isolere et ca 5 mm segment, ved føring av mikrosonde bak arterien, og med spissen for å gjøre bredere åpning i det naturlige kløft mellom arterie og vene. Dette er gapet gjennom hvilket sutur skal tres.
- Bruke 10-0 single-tråd sutur og nålholderen stedet en ligering rundt innmatingen arterien (~ 70 um diameter) mot den indre enden av den dissekerte segmentet ved hjelp av en kirurg knute. PLAce ytterligere ligering mot den distale ende av den dissekerte arterien segmentet, med tilstrekkelig skille mellom ligaturer å tillate transeksjonen av arterien.
- Liten skala forbundet med spinotrapezius innmatingen arterien fører til økt kirurgisk vanskelighetsgrad, sammenlignet til ligering av et større fartøy som lårarterien. Uerfarne kirurger spesielt vil ha høy forekomst av avulsion, utilsiktet blødning, og andre kirurgiske komplikasjoner. Av spesiell bekymring er vanskeligheten med å identifisere og kutte fargeløs arterien etter strømmen har blitt hindret like før skjæring. Av disse grunner, er å plassere to ligaturer anbefalt for de på den til prosedyren, som kirurgen har en visuell guide i finne hvor til tversgående arterien samt en bekreftelse av kuttet med lett observerbar separeringen av de to ligaturer. Imidlertid kan en mer erfaren kirurg finne en enkelt ligatur tilstrekkelig, så lenge de er i stand til tydeligidentifisere og kutte Arteria nedstrøms ligatur. Mens denne teknikken reduserer risikoen for utilsiktet nicking en nærliggende fartøy med den skarpe ligation sutur, er det ikke uten ulemper, blant annet økt vanskeligheter bekrefter arterie ble transektert.
- Verifisere ligation ved å observere reduksjon av blodstrøm (hindret RBC kolonne) nedstrøms ligation nettstedet (dvs. mot muskel).
- Bruke dissecting saks skjære over ligert arterien, mellom de to ligaturer. Hvis bare én ligatur ble plassert (11a), kuttet med ekstrem forsiktighet i nedstrøms retning.
- Drug loaded vanlig-film (1 mm), kan plasseres nedstrøms (kaudalt) som del av eksperimentell prosedyre.
- Reposisjonere fordrevne fascia og fettvev til sin opprinnelige orientering.
- Lukk hud innsnitt med 8-0 non-resorberbare suturer. Deretter plasserer musen i en forberedt oppvarmet utvinning bur under observasjon og administrere en appropriate smertestillende som bupivacaine, 0,02 til 0,05 ml 0,25% lokal infiltrasjon.
2. Spinotrapezius Intravital Mikroskopi, in situ
- Anesthetize musen i induksjonsovn kammer med 3-4% isofluran fordampes i 100% oksygen ved en strømningshastighet på 3-4 L · min -1.
- Bruken av inhalant anestesi er å foretrekke for funksjonelle målinger fordi det er mindre kardiovaskulær depresjon enn med injiserbare anestetika. Hvis inhalant anestesi i ikke tilgjengelige, langtidsvirkende injiserbare anestetika, slik som natrium pentobarbital er foretrukket å unngå gjentatte injeksjoner når dyret har blitt posisjonert.
- Gang bedøvet, kontinuerlig leverer isofluran gjennom en anestesi maske (aka nesen kjegle) ved vedlikehold konsentrasjoner (generelt ~ 2%) og strømningshastigheten for 0,5 til 1 L · min -1.
- Mus hovedsakelig ventilere gjennom sine nesegangene, så det er bare necvendig å dekke nesen med anestesi maske mellomgulvet.
- Hvis det er nødvendig, fjerne hår fra baksiden ved hjelp av trimming clippers og Hårfjerningskrem.
- Transportere dyret til varmen pad.
- Det er viktig å opprettholde mus i en euthermic tilstand å hindre at kald-indusert vasokonstriksjon, og dette kan oppnås ved hjelp av lyskilder, vann sirkulerer varme pads, varmer mikrobølgesikker pads, etc.
- Sett rektal temperatur probe og sette termo-kontrolleren til 35 ° C.
- Gjør en hud snitt på caudal slutten av spinotrapezius bruke iris saks og standard mønster tang.
- Utvide snittet cranially til fett puten, og skaper en hestesko snitt, og dekker huden klaff med plastfolie for å hindre uttørking.
- Sløve dissekere det subkutane bindevev med pinsett og våren saks for å maksimere synlighet.
- Plasser stimulerende elektroder så nær together som mulig, for å minimalisere størrelsen på gjeldende felt, og plassere dem ved caudale enden av den eksponerte muskelen bare lateralt for ryggraden.
- Utfør en test stimulering for å bekrefte plassering av elektroder ved hjelp av en elektrode datainnsamling system, elektrode stimulans isolator, og datamaskinen kontrolleren, med firkantede bølger av en 200 μsec varighet, 2 mA amplitude, levert på 1 Hz.
- Plasser plastfolie over eksponert muskler for å hindre uttørking.
- Begynn timingen en 30 min periode hvor fartøy diameter vil stabilisere seg.
- Plasser intravital mikroskop over spinotrapezius muskler til å vise vaskulær arkitektur.
- Hvis du bruker en nedsenking linse, plassere en dråpe PBS mellom objektivet og plastfolie.
- Starter over de viktigste arteriole (det største skipet synlig), manipulere scenen i XY-planet for å finne skipet av interesse.
- Visualisering liten arterioles med reflektert lys mikroskopi krever større kontrast enn forutsatt av den røde-cellers kolonnen. Vi primært bruke en side-strøm mørk-feltet imaging mikroskop å forbedre mikrovaskulær kontrast, men kontrasten kan også bli forbedret med en reflektert lys fluorescerende mikroskop etter intravenøs injeksjon av en høy-molekylvekt fluorescerende dekstran.
- Etter 30 minutters likevekt, ta et bilde / video av fartøyet av interesse.
- Stimulere muskelen med firkantbølger på 200 μsec varighet, 2 mA amplitude, ved 8 Hz for 90 sek, som beskrevet ovenfor.
- Ta et nytt bilde / video umiddelbart etter stimulering og fortsette å fange hvert minutt før fartøyet har returnert til hvile diameter, ~ 10 min.
- Gjenta trinn 6-18 ved hjelp av kontralaterale muskel.
- Data analyse kan utføres i sanntid med video calipers eller off-line med bildeanalyse programvare.
- Avlive musen følgering IACUC protokollen.
3. Spinotrapezius Tissue Harvest og Fiksering
- Anesthetize mus ved intraperitoneal injeksjon; formulering som i Spinotrapezius Strøm Artery Ligatur trinn 1.
- Gjør et snitt flere millimeter kraniale til den benete prominence av musens skulderblad med iris saks og standard mønster tang. Utvid snittet sidelengs og deretter caudally på begge sider.
- Slipp huden mot dorsal torso ved å forsiktig reflekterer huden og kutte overfladiske fascia.
- Bruk sløv disseksjon for å fjerne dorsal fettvev ved hjelp av standard tang, og deretter reflektere muskel og lignende dissekere ventral fettvev.
- Fjern fascia overliggende muskel bruker pinsett og våren saks. Dette trinnet kan være vanskelig og tidkrevende, men er viktig for å bedre immunofluorescerende flekker og avbildning. Holde vevet hydrert kan lette fjerning av konseptet.
- Lokaliseresideveis grensen av muskelen, og bruke sløv disseksjon å skille spinotrapezius muskel fra fett puten som ligger ventral til den.
- Fortsett den butte disseksjon i en cranial til Caudal retning. Merk at flere blodkar inn og forlate denne ventral overflate av muskelen, hvis perfusjon er nødvendig, skal det utføres før transecting disse fartøyene. Også oppmerksom på at i caudal halvparten av muskel, dets laterale grensen setter inn i muskelen som ligger ventrale til det. Noen cutting kan være nødvendig langs denne grensen til helt definere og frigjøre kanten.
- Avgiftsdirektoratet den spinotrapezius muskel. For å gjøre dette:
- Frigjør sidekant av muskelen som beskrevet ovenfor.
- Skjær transversalt over lukkemuskelen mest kranial grad.
- Kutt langs mediale kant (langs ryggraden), i sagittalplan.
- Gjenta prosedyren trinn 4-9 på motsatt muskel, og deretter avlive den mouse av en IACUC godkjent metode.
- Fest vev på gelatin-belagte glassplater ved nedsenkning i kjølt metanol (4 ° C), eller i en 4% paraformaldehyd / deionisert vann løsning ved RT i 20 min.
- Alternativt kan perfusjons fiksering anvendes. Før til trinn 2, utføre en torakotomi, gjøre et snitt i høyre atrium, og perfuse vaskulatur med 5 ml 1 x Tris-bufret saltløsning med 0,1 mM CaCl 2 og 2% heparin via den venstre ventrikkel, etterfulgt av 5 ml 4 % paraformaldehyd for fartøyets fiksering, og til slutt 5 ml 1 x Tris-bufret saltløsning med 0,1 mM CaCl 2 7.
- Straks etter fiksering, vaske prøven fire ganger i 20 min hver bruker 0,01 M fosfat-bufret saltvann (PBS) med 0,1% saponin.
Representative Results
En kirurgisk utsikt hovedpulsåren mater spinotrapezius muskel som gjennomgår ligation er vist i figur 1, med etiketter indikerer områder av interesse. Et eksempel konfokal bilde av høstet og immunostained regionen muskel plassert direkte nedstrøms fra ligert arterien en uke etter ligering er vist i figur 2A. Forstørrede sikkerhet arterioler inneholder glatt muskulatur alfa-actin uttrykker glatte muskelceller (rød) viser karakteristiske tortuosity etter ligation. Fartøy tortuosity, rapportert som forholdet mellom fartøy banelengde og ledningen avstand (dvs. linjen som strekker seg over det samme fartøyet sti endepunkter), i ligert muskelen (høyre) er forbedret i forhold til unligated kontralaterale muskel (Figur 2B, n = 8) . Figur 3 viser resultatene av en pilotstudie i hvilken terminal arteriole funksjonelle vasodilatasjon ble målt ved hjelp intravital mikroskopi. Som forventet, arteriolar di ameter øker betraktelig etter elektrisk stimulering-indusert muskel sammentrekning.
Figur 1. Kirurgiske feltet av reflektert spinotrapezius muskel og fôr arterie. Fôret arterien ligeres på de to stedene er markert med A0. Mellom disse ligaturer og etter obstruksjon av bloodflow blir arterien transektert på stedet angitt med A. målrettet segmentet av arterien overganger fra ventrale fettpute, skissert av C, inn i den spinotrapezius muskelen, skissert av D, på stedet angitt med pil B. Flow retning er angitt med stiplede arrow E.
ghres.jpg "/>
Figur 2. Confocal bilde av spinotrapezius muskel mikrovaskulær nettverk for pilotstudie av tortuosity. (A) Slaktet og hele montert muskelen ble immunostained for glatt muskulatur alfa-actin og avbildes ved hjelp konfokalmikroskopi. Synsfeltet viser regionen av muskel ligger direkte nedstrøms av det ligert arteriole 1 uke etter ligering. Kroket fartøy er tydelig i muskler som en følge av ligering (B) pilotstudie resultater viser betydelig økt (p = 0,035; 1 tailed Student t-test). Tortuosity utstilt ved microvessels i ligert muskelen målt ved fartøy banelengde ledningen avstand ratio for en prøveversjon av C57BL / 6 mus (n = 8) sammenlignet med kontralateral kontroll.
Figure tre. Intravital mikroskopi avbildning av funksjonell vasodilatasjon i spinotrapezius arterioler, in vivo. (A) Representative photomicrographs av spinotrapezius terminal arterioler i ro (til venstre) og umiddelbart etter opphør av 8 Hz muskelkontraksjon (høyre). (B) Terminal arteriole diameter ved hvile ( 8,5 ± 0,5 mikrometer, venstre) og umiddelbart etter (11 ± 1 mikrometer, midten) 90 sek av muskel sammentrekning, som i betydelig grad økt arteriolar diameter (p = 0,032, 1-tailed paret t-test) i Balb / C mus (n = 6). Prosentvis endring indikert (til høyre).
Discussion
Murine spinotrapezius ligation modell som presenteres her er en effektiv liten dyremodell å studere de funksjonelle og strukturelle tilpasninger som følger av en arteriell okklusjon. Denne modellen er komplementær til mye brukt hindlimb iskemi modell 4, som gir det en hel-muskel visning av intakte mikrovaskulære nettverk med høy romlig oppløsning. Videre, fordi denne muskelen ligger like under dorsal huden, er det tilgjengelig til seriell bildebehandling med intravital mikroskopi, og til lokal levering av legemidler via superfusjons eller tynn film implantasjon 2. Disse funksjonene gjør det til et attraktivt liten dyremodell for å studere effekten av nye terapeutiske mål på vaskulær remodellering og funksjonell vasodilatasjon etter arteriell okklusjon.
Vær oppmerksom på at forsiktighet bør brukes når du sammenligner data ervervet i spinotrapezius ligation modell til data ervervet i hindlimb ligation modellen på grunn av flere sentrale differences. Først blir spinotrapezius muskler stabilisere musklene, og de skiller seg fra de leggmusklene i form av funksjon og fiber type distribusjon. Vår gruppe har tidligere vist at arteriolar ligering i spinotrapezius muskelen skaper mindre eller ubetydelig hypoksi i stammer med velutviklede collateral arteriolar nettverk, i forhold til den hypoksi observert i hindpaw følge lårarterien ligering i hindlimb modellen 1,8 - 10. Vi har også vist at den spinotrapezius ligation modellen gir en annen remodeling respons i Balb / c mus sammenlignet med C57BL / 6 mus, med Balb / c-mus-nettverk remodeling ved kapillær collateralization og C57BL / 6 remodeling ved utvidelse av eksisterende arteriolar tilkoblinger 3. Det er en interessant parallell mellom disse observasjonene og de gjorde i hindlimb ligation modeller, hvori Balb / c mus oppleve en langvarig perfusjon restitusjon etter ligation forhold til C57BL / 6 mus 9,11,12 </ Sup>. I andre modeller av vev iskemi, mus alder 13 14 kjønn og tilstedeværelse av sykdom 15 også kunne påvirke vev responser på arteriolar okklusjon, selv om vi ennå ikke har testet disse prediktorene i spinotrapezius ligation modell.
Sekund, er størrelsen av arterien som er ligert i spinotrapezius modellen betydelig mindre enn lårarterie, og derfor påvirker ligation et mindre vevvolum som er lenger nedstrøms, dvs. på et lavere nivå av sirkulasjons tre, i spinotrapezius sammenlignet med hindlimb 3. Derfor bør den anatomiske forskjellen i plasseringen av ligering i disse to modellene betraktes når man sammenligner de respektive fysiologiske responser (f.eks vaskulær remodellering) til dette inngrep.
Tredje kan tykkelse på spinotrapezius tillate oksygen å nå unperfused parti av vevet fra nabolandetvev, sammenlignet med den kombinerte iskemi og hypoksi i hindlimb modellen som beskrevet over 3. Fjerde, er utvinning av vannmengde til den delen av spinotrapezius nedstrøms ligation raskere enn i hindlimb ligering. Den spinotrapezius ligation modellen er en unik kronisk modell og må ikke forveksles med andre modeller av forbigående arteriell okklusjon eller modeller av ischemi reperfusjonsskade. Vi anser det mulig å tilpasse denne modellen for å imøtekomme disse typer forhold, men dette er utenfor omfanget av arbeidet presentert heri. Til slutt, advarer vi mot direkte knyttet pre-kliniske observasjoner i denne modellen til kliniske manifestasjoner av iskemisk sykdom hos mennesker, spesielt når utnytte unge og ellers friske mus og på grunn av den iboende fysiologiske grenser som høyere hjertefrekvens 5. Likevel, ser vi denne nye modellen som et verdifullt verktøy for å avdekke grunnleggende mekanismer for vev svar på ligation og identifisere potensialetrapeutic mål i en in vivo-innstillingen.
I tillegg til de kirurgiske notater gitt i spinotrapezius fôr arterien ligation prosedyre (anatomisk note (6a), skille arterien fra blodåre (9a), og bruk av en enkelt ligatur (11a)), noen andre aspekter av prosedyren nytte diskusjon.
Først, er den innledende innsnitt gjort over dorsal fettpute kant (eller flere mm kaudal til skulderbladene, hvis transdermal visualisering er ikke mulig) ideelt laget så liten som kirurgen er komfortabel med, og utvidet under prosedyren hvis det er nødvendig. Denne praksisen minimerer suturering kreves for å lukke innsnitt, som er praktisk for kirurgen, reduserer prosedyre tid, og er også mindre irriterende for dyret under utvinning. Alternativt kan en større hud innsnitt være hensiktsmessig i henhold til kirurgen foretrekker, siden muskel kan være lettere å finne med et utvidet felt. I dette tilfellet, innsnitt kandra nytte av en hestesko form med en medial åpent ansikt for å tillate folding mot ryggraden. Samtidig som huden innsnitt og som strekker seg gjennom de sekundære hudlagene, hvis et overflatefartøy er skadet og forårsaker blødning, pålegges lett trykk med sterilt gasbind og gi tid for hemostase.
Også av notatet, er det viktig å behandle vevet med minimal nødvendig kraft, og hvor mulig hold med pinsett nærmere musklenes laterale kant og bort fra den tiltenkte iskemisk sonen. Denne praksisen bidrar til å unngå klemskade, noe som kan føre til ytterligere provoserende-medierte vev tiltak som kan forvirre den vaskulær remodellering respons fremkalt av den arterielle ligation.
Som konklusjon, har vi vist at bruken av den murine spinotrapezius muskelen som kirurgisk modell for å undersøke vaskulære og vev responser på arteriolar ligering. Denne modellen er egnet for vurdering av intravital vaskulære endringer (foreksempel funksjonelle vasodilatasjon), og for ex vivo vurdering av vaskulære endringer (for eksempel immunofluorescerende avbildning og kvantifisering av vaskulære nettverk). Begge pre-kliniske og kliniske studier har vist at et individs respons på arteriolar obstruksjon (f.eks via ligering i mus eller aterosklerotiske plakk i mennesker) er avhengig av alder deres nærvær eller fravær av sykdom (f.eks diabetes mellitus) diameteren til hindret arterien , den genetiske sammensetningen av den enkelte, og den metabolske etterspørsel av vevet 11-15. Murine modeller, for eksempel den som presenteres her, benytte forskeren av stamme-spesifikke anatomiske og genetiske forskjeller og sykdomsspesifikke fenotyper, noe som letter gransking av disse komplekse relasjoner.
Disclosures
Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi erkjenner Kevin Macleod for bruk av sin Creative Commons lisensiert musikk i tilknyttede video, inkludert (i rekkefølgen) sin spor "Airport Lounge", "Wallpaper" og "Evening Melodrama". Vi ønsker også å erkjenne Ndubisi Okeke og Frederick Torstrick for deres hjelp med kirurgi video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iris scissors | FST | 14090-09 | Type: Tool |
| Size 7 forceps | FST | 11271-30 | Type: Tool |
| Size 5 forceps | FST | 11251-20 | Type: Tool |
| Spring scissors | Roboz | RS5671 | Type: Tool |
| Microprobe | FST | 10140-03 | Type: Tool May be substituted with straight probe |
| Needle holder | FST | 12500-12 | Type: Tool |
| Induction chamber | JD Medical Dist. Co., Inc. | IC-1086 | Type: Equipment |
| Eye Gel | Dechra | NDC 17033-211-38 | Type: Reagent |
| Heat pad | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
| Rectal temperature probe | FST | 21060-01 | Type: Equipment |
| Stimulating electrodes | FHC | UEWSGCSE0N1M | Type: Equipment |
| Artisan's Polymer Clay | Polyform | N/A | Type: Equipment |
| PowerLab data acquisition system | ADInstruments | ML 845 | Type: Equipment |
| Stimulus isolator | ADInstruments | FE 180 | Type: Equipment |
| LabChart | ADInstruments | ML S060/7 | Type: Software |
| Reflected-light fluorescent microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
| High MW fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |
| Video calipers | Colorado Video | 308 | Type: Equipment |
| Automated Vascular Analysis (AVA) | Microvision Medical | Type: Software | |
| Anti-αSMA Conjugated Fluorophore | Sigma | 1A4-Cy3 | Type: Reagent Clonal, 1:100 |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BFXM | Type: Equipment |
| High-molecular weight fluorescent dextran | Sigma | FD250S-100MG | Type: Reagent |
References
- Bailey, A. M., O'Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation. Microcirculation. 15, 389-404 (2010).
- Bruce, A. C., Peirce, S. M. Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model. Microcirculation. 19, 143-154 (2012).
- Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 17, 333-347 (2010).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (23), e1035 (2009).
- Madeddu, P., et al. Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems. Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).
- Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front. Physio. 2, 91 (2011).
- Sefcik, L. S., et al. Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth. Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).
- Deindl, E., et al. Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit. Circulation Research. 89, 779-786 (2001).
- Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain. Circulation Research. 105, 89-98 (2009).
- Scholz, D., et al. Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).
- McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
- Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).
- Peng, X., et al. Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).
- Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice. Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).
